Summary
Este protocolo describe imágenes de las neuronas individuales o de las células de la cresta neural en embriones de pez cebra de vida. Este método se utiliza para examinar los comportamientos celulares y la localización de actina mediante fluorescencia confocal time-lapse microscopía.
Abstract
El pez cebra es un modelo ideal de comportamiento celular durante el desarrollo de imágenes en vivo. Embriones de pez cebra son fertilizados externamente y por lo tanto fácilmente accesible en todas las etapas de desarrollo. Además, su claridad óptica permite imágenes de alta resolución de la célula y de dinámica molecular en el medio natural del embrión intacto. Estamos utilizando un enfoque de imágenes en vivo para analizar los comportamientos celulares durante la migración neuronal células de la cresta y la consecuencia y la orientación de los axones neuronales.
Imágenes en vivo es particularmente útil para comprender los mecanismos que regulan los procesos de motilidad celular. Para visualizar los detalles de la motilidad celular, tales como la actividad protrusiva y dinámica molecular, es ventajoso para etiquetar las células individuales. En el pez cebra, la inyección de ADN plásmido se obtiene un patrón de mosaico la expresión transitoria y ofrece claras ventajas sobre otros métodos de etiquetado celular. Por ejemplo, las líneas transgénicas con frecuencia etiqueta a poblaciones enteras de células y por lo tanto pueden dificultar la visualización de las protuberancias finas (o cambios en la distribución molecular) en una sola célula. Además, la inyección de ADN en el estadio de una célula es menos invasiva y más precisa que las inyecciones de colorante en las etapas posteriores.
Aquí se describe un método para el etiquetado de cada desarrollo de las neuronas o las células de la cresta neural y las imágenes de su comportamiento in vivo. Se inyecta el plásmido de ADN en una célula de embriones etapa, que se traduce en la expresión del transgen mosaico. Los vectores contienen células específicas de los promotores que dirigen la expresión de un gen de interés en un subconjunto de neuronas sensoriales o las células de la cresta neural. Proporcionamos ejemplos de células marcadas con GFP membrana selectiva o con una sonda de biosensor que permite la visualización de la F-actina en las células vivas 1.
Erica Andersen, Asuri Namrata, y Clay Mateo contribuyeron igualmente a este trabajo.
Protocol
1. Montaje de diapositivas y las diapositivas de imágenes de la inyección
Diapositivas de inyección:
- Prepare elastómero de silicona Sylgard de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Utilice el Sylgard de enlace de tres de vidrio para microscopio estándar portaobjetos, apilando una diapositiva en la parte superior de la intersección de las otras dos diapositivas, que están dispuestos lado a lado en los bordes largos. El carro superior crea una esquina en ángulo recto o "muro" entre la parte superior e inferior se desliza.
- Vamos Sylgard toda la noche. Estas diapositivas son reutilizables.
Imágenes de diapositivas:
- Nosotros usamos rectángulos de acero inoxidable cortado con el mismo tamaño de un portaobjetos de microscopio de vidrio estándar (75mm x 25mm x 1mm) por lo que la cámara se ajusta el soporte de diapositivas sobre la platina del microscopio. Un agujero de 1,5 cm se corta en el centro del rectángulo.
- Ponga un cubreobjetos de 22 mm 2 para el rectángulo de metal con Sylgard. Use sólo lo suficiente para sellar completamente Sylgard el cubreobjetos. A la imagen en un microscopio invertido, los embriones se monta en este cubreobjetos y la imagen de abajo.
- Vamos Sylgard toda la noche. Estas diapositivas son reutilizables y se limpia con etanol al 70% entre los usos.
2. Preparación de construcciones de ADN
Para expresar un transgén en un tejido específico, el gen de interés se clona detrás de un promotor específico de las células. Usamos un elemento cis-reguladoras del gen de pez cebra neurogenin1 (-3.1ngn1) 2 o el gen SOX10 (-4.9sox10) 3 para dirigir la expresión en las neuronas sensoriales o las células de la cresta neural, respectivamente. Para visualizar la dinámica celular y la membrana, expresamos citoplasma o fluoróforos localizado a la membrana. A la imagen de la F-actina de distribución, que expresa el ADN que codifica el dominio de homología calponin de utrofina fusionado a mCherry (UtrCH-mCherry). La sonda UtrCH-mCherry biosensor permite la visualización de la F-actina, sin interferir con la dinámica de actina 1. Generamos estas construcciones de ADN utilizando la puerta de enlace Invitrogen recombinación estrategia basada en la clonación de 4 y vectores siempre en el pez cebra Tol2kit 5.
- Generar vector de expresión (s) con varios sitios-Gateway Tecnología y vectores de la Tol2kit pez cebra 5. Plásmidos contienen la columna vertebral de Tol2 pT2KXIGDin.
- Purificar el ADN plásmido con QIAfilter plásmido kit de preparación Midi (QIAGEN Inc.) y eluir con agua estéril. El ADN no tiene por qué ser lineal para la inyección.
3. La inyección de construcciones de ADN
- Diluir el ADN a una concentración final de 10-50 mg / ml de ADN en el 0,2% de rojo fenol (para la visualización durante la inyección) en el agua.
- Relleno y calibrar la aguja: Volver a llenar una aguja sacó capilar con aproximadamente 1 l solución de ADN e insertarlo en el soporte de la aguja del aparato de inyección (se utiliza un Picospritzer). Con una pinza fina, romper la punta de la aguja de modo que la apertura de la punta es de aproximadamente 10 mm de diámetro. Mida el diámetro de la gota de aceite mineral con un micrómetro ocular. Ajustar la configuración de la presión de tiempo para obtener una gota de aproximadamente un volumen de la Liga Nacional.
- Recoger una de las células de embriones etapa de embrión en un medio de E3 (5 mM NaCl, KCl 0,17 mm, 0,33 mm de CaCl2, 0,33 mm MgSO 4 * 7H 2 O, pH 7,0).
- Transferencia de aproximadamente 30-60 embriones a la diapositiva de la inyección y la posición de los embriones en la esquina en ángulo recto formado entre la parte superior e inferior se desliza. Eliminar la mayor parte de la E3, para que los embriones se mantienen a la diapositiva por la tensión superficial.
- Use un alfiler doblado la disección de embriones para rotar por lo que la célula está contra la pared de la diapositiva de la inyección.
- Use un micromanipulador para guiar la aguja a través del corion del embrión, a través de la yema de huevo y en la única célula del embrión. Se inyecta 0,5-1 solución de ADN nl en la célula.
- La transferencia de los embriones en placas de Petri en el E3 y se incuba a 28,5 º C. Si es necesario, el desarrollo puede ser frenado mediante la incubación de los embriones a una temperatura más baja.
4. Embriones de montaje de imágenes
- Retire el corion de los embriones con unas pinzas finas de aproximadamente una hora antes de los embriones llegan a la edad deseada para la imagen (aproximadamente 14-17 horas después de la fertilización para nuestros propósitos).
- Seleccionar los embriones con células marcadas con un microscopio de disección equipado con fluorescencia. Nosotros usamos un objetivo de 4X (40x) en un ámbito Nikon AZ100 debido a su combinación de larga distancia de trabajo y una gran ampliación.
- Lugar a un embrión en un tubo de microcentrífuga con aproximadamente 50 l E3 que contiene 0,2% tricaína anestesia (concentración 10 veces).
- Añadir 500 l 1% de agarosa de bajo punto de fusión en el E3 con 10 mM HEPES (mantenido a 42 ° C), diluyendo la tricaína a una concentración final de 0,02%.
- Inmediatamente la transferencia del embrión en una caída de agarosa alcubreobjetos de la diapositiva de imagen utilizando una amplia gama de pipetas de vidrio diámetro.
- Antes de la agarosa se endurece, la posición del embrión para la región con células marcadas es hacia abajo, contra el portaobjetos inferior (abajo dorsal de las células de la cresta neural y dorsolateral abajo de la columna vertebral neuronas sensoriales).
- Ensamble de cámara de imagen: Cubra un lado de un anillo de plástico (2 cm de diámetro exterior, 3 mm de alto) con grasa de silicona al vacío y colocar a la diapositiva de imagen de metal. Escudo del otro lado del ring con grasa.
- Llenar la cámara con el E3 que contiene HEPES 10 mM y 0,02% tricaína. Selle la parte superior la cámara mediante la colocación de 22 mm 2 cubreobjetos a la superficie superior del anillo engrasado.
5. Imágenes 4D del comportamiento celular en el Olimpo FV1000 confocal con IX81 microscopio
Los detalles de la adquisición de la imagen dependerá de los detalles de su sistema de microscopía. A continuación se describe el proceso de adquisición de lapso de tiempo para la Olympus FV1000 microscopio confocal. Ver el protocolo anterior JoVe para la adquisición de lapso de tiempo con el Zeiss LSM 510 confocal sistema 6.
- Coloque la cámara de imágenes en el soporte de diapositivas sobre la platina del microscopio y se centran en el embrión con un objetivo 20X 10X o bajo luz transmitida.
- Cambiar a un objetivo de 60x (NA de 1.2 o superior) y se centran en la celda marcada con epifluorescencia. Nosotros usamos ni una inmersión en aceite (UPLSAPO 60xO NA 1,35) o de inmersión en agua (UPLSAPO 60xW NA 1.20) de la lente.
- En el software de FV (Ver 1.7c), haga clic en la repetición de XY para iniciar la digitalización láser.
- Ajustar los valores de adquisición y control de adquisición de imágenes (de salida del láser, velocidad de exploración, HV, ganancia y niveles de compensación) para optimizar la señal, manteniendo la potencia del láser, como mínimo (25% o menos) para evitar daños en los tejidos y reducir photobleaching.
- Para adquirir una de la serie Z, establecer los límites superior e inferior de la z-stack, junto con el tamaño de paso. Asegúrese de que el icono de profundidad se dedica a fin de que el icono de barrido XY XY y Z destacó. Iniciar la adquisición haciendo clic en el icono de Barrido XYZ.
- Para adquirir una serie de lapso de tiempo, establezca el intervalo de tiempo y el número de puntos de tiempo bajo el título TimeScan en la ventana de Configuración de la adquisición. Haga clic en el icono de tiempo en la ventana de control de imagen de adquisición para que el icono de barrido XY XY (Z) y destacó T. Iniciar la adquisición, haga clic en el gráfico XY (Z) en el icono Barra T.
- Por otra parte, la TimeController se puede utilizar para establecer un lapso de tiempo. Esta programación es útil cuando se generan grandes cantidades de datos, ya que no exceda la asignación de memoria. En Dispositivo, abra la ventana TimeController. Crear una tarea nueva imagen. La ventana de parámetros de imagen se abrirá. Haga clic en el botón Estado de FV para actualizar los ajustes de adquisición. Asegúrese de guardar y Eliminar se observan bajo el título Terminar. Establecer el nombre del archivo de salida y haga clic en Aceptar para guardar la configuración y cerrar la ventana. Utilice la función de bucle para establecer el intervalo de tiempo deseado y el número de puntos de tiempo. Haga clic en Listo y en Iniciar para comenzar la adquisición. La pausa y cambio de funciones-Z se puede utilizar para reorientar al mismo tiempo de imagen.
6. Resultados representante
Las cifras y las películas muestran ejemplos de las neuronas sensoriales y las células de la cresta neural marcada con fluoróforos específicos de membrana o la sonda biosensor de actina.
Figura 1 Confocal de imágenes (z-proyecciones) de Tg (ngn1: GFP-CAAX). Embriones transgénicos inyectados con 25 pg ngn1: mCherry-CAAX ADN. Las etiquetas mCherry-CAAX una neurona roja (A) en un fondo con todas las neuronas sensoriales-Barba Rohon etiqueta verde (B). C) imagen combinada de los canales verde y rojo. Barra de escala = 50 micras.
Figura 2 confocal z-proyecciones de las neuronas en embriones inyectados con aproximadamente 20 pg ngn1:.. MCherry-UtrCH ADN A) Rohon-Barba neuronas sensoriales en el embrión HPF 16,5. F-actina de la señal es fuerte en los conos de crecimiento (puntas de flecha) y salientes a lo largo de los axones de reciente formación. B) de neuronas en embriones HPF 20 mostrando una fuerte señal de la F-actina en los conos de crecimiento de los axones ramificados periférica (puntas de flecha) y el más débil de la señal en el centro de mayor madurez axones (flechas). Barra de escala = 50 micras.
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Discussion
La concentración óptima de ADN inyectado puede variar dependiendo del tamaño y la fuerza del promotor de la construcción y debe ser determinada empíricamente. La inyección de ADN en exceso puede conducir a los embriones saludables con una extensa muerte celular, mientras que muy poco se traducirá en una proporción muy pequeña de los embriones inyectados expresar el transgén. El nivel de expresión de ADN se correlaciona con la fuerza de la señal de fluoróforo, el cual varía de célula a célula. Aunque la clasificación de embriones en epifluorescencia, excluir a aquellos con niveles extremadamente altos de expresión. Células marcadas que aparecen muy brillantes por lo general también muestran signos evidentes de toxicidad, tales como la morfología anormal de las células, deslocalización de moléculas marcadas, y la muerte celular. Una inyección de ADN típico de los rendimientos de 5-10% de los embriones que son adecuados para las imágenes.
El biosensor F-actina puede funcionar de una manera negativa dominante cuando se expresa en altos niveles. Si promotor impulsado por la expresión es problemática, el biosensor se puede expresar mediante la inyección de ARNm doquier. La ventaja de la inyección de ARNm es que los niveles de expresión se puede controlar mediante el ajuste de la concentración de ARNm. Las células individuales en estos embriones son etiquetados por la co-inyección de un constructo de ADN que contiene una expresión promotor específico de las células de conducción de un fluoróforo membrana localizada. Hemos utilizado este enfoque a la imagen de la F-actina en las células de la cresta neural 7.
A menudo, llevar a cabo la técnica de etiquetado de una sola célula en las líneas de expresión transgénica. Por ejemplo, la inyección de un-3.1ngn1: mCherry plásmido en embriones de la Tg (-3.1ngn1: GFP) de la línea se etiqueta individual neuronas sensoriales de color rojo en un fondo verde de las neuronas. Esta estrategia permite examinar el comportamiento de una celda individual en el contexto de la población de células.
Nos centramos aquí en las imágenes de los nervios y células de la cresta neural conductas y la distribución de actina. Sin embargo, el método general de etiquetado específico de tejido celular del mosaico de la inyección de ADN plásmido puede ser ampliado para su uso con las proteínas de fusión fluorescentes, así como otros codificada genéticamente sondas biosensor. La combinación de estas técnicas puede permitir a los investigadores a visualizar la localización subcelular de moléculas específicas, así como los mecanismos de señalización en vivo.
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Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el NIH R01 NS042228 para MCH El confocal Olympus FV1000 fue adquirido con una instrumentación NIH subvención compartida S10RR023717 al Departamento de Zoología de la Universidad de Washington (PI Bement Bill).
Erica Andersen, Asuri Namrata, y Clay Mateo contribuyeron igualmente a este trabajo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | A5040-250G | |
| Sylgard Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 184 | |
| QIAfilter Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12243 | |
| Low melting point agarose | Invitrogen | 15517-014 | |
| Picospritzer | Parker Hannifin Corporation | 051-0302-900 |
References
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