Summary
이 프로토콜은 zebrafish 배아를 생활에서 개별 뉴런 또는 신경 능선 세포의 이미징을 설명합니다. 이 방법은 형광 공촛점 시간 경과 현미경을 사용하여 셀룰러 행동과 굴지의 현지화을 검사하는 데 사용됩니다.
Abstract
zebrafish는 생체내 개발 중에 이미징 세포 행동에 대한 이상적인 모델입니다. Zebrafish의 배아는 외부 수정된 개발의 모든 단계에 따라서 쉽게 액세스할 수 있습니다. 또한, 그들의 광학 선명도는 그대로 배아의 자연 환경에서 세포와 분자 역학의 고해상도 이미징 수 있습니다. 우리는 신경 능선 세포의 연결을 마이 그 레이션 및 axons의 파생물 및지도하는 동안 세포 행동을 분석하는 라이브 이미징 방법을 사용하고 있습니다.
라이브 영상은 세포 운동성 프로세스를 조절 메커니즘을 이해하는 데 특히 유용합니다. 등 밀어내는 활동 및 분자 역학과 같은 세포 운동성 대한 자세한 내용을 시각화하기 위해서는 각각의 세포를 레이블에 유리합니다. zebrafish에서 플라스미드 DNA의 주입은 일시적 모자이크 표현 패턴을 산출 및 기타 셀 라벨 방법을 통해 독특한 혜택을 제공합니다. 예를 들어, 유전자 변형 라인은 종종 전체 세포 인구를 분류하고 있으므로 하나의 세포에서 미세 라고나할까요 (또는 분자 분포의 변화)의 시각화을 정확히 파악하기 어렵습니다. 또한, 한 세포 단계에서 DNA의 주입은 적게 침략 이후 단계에서 염료를 주사보다 더 정확합니다.
여기는 개별 개발 뉴런 또는 신경 크레스트 세포 및 이미징 생체내 그들의 행동을 라벨에 대한 방법을 설명합니다. 우리는 모자이크 transgene 발현 결과 1 - 세포 단계의 배아로 플라스미드 DNA를 주입. 벡터는 세포 특정 발기인을 포함 감각 뉴런 또는 신경 크레스트 세포의 일부에 대한 관심의 유전자의 드라이브 표현. 우리는 막 대상 GFP 또는 셀에 1을 생활에서 F - 굴지의 시각화을 허용하는 바이오 센서 프로브와 함께 레이블 세포의 예제를 제공합니다.
에리카 앤더슨, Namrata Asuri, 그리고 매튜 클레이이 작품에 동등하게 공헌했습니다.
Protocol
1. 분사 슬라이드 및 이미지 슬라이드 어셈블리
사출 슬라이드 :
- 제조 업체의 지침에 따라 Sylgard의 실리콘 엘라스토머를 준비합니다.
- 본드 3 개의 표준 유리 현미경을 Sylgard를 사용 긴 가장자리에 나란히 배열되어 다른 두 슬라이드의 교차로 위에 슬라이드를 스태킹하여 함께 슬라이드. 상단 슬라이드 직각 모서리 또는 상단과 하단 슬라이드 사이의 "벽"을 만듭니다.
- Sylgard가 하룻밤 책정할 수 있습니다. 이 슬라이드는 재사용됩니다.
이미징 슬라이드 :
- 챔버는 현미경 스테이지에있는 슬라이드 홀더에 맞는 그래서 우리는 표준 유리 현미경 슬라이드 (75mm X 25mm X 1mm)의 같은 크기로 절단 스테인리스 사각형을 사용합니다. 1.5 cm의 구멍이 사각형의 중앙에자를 수 있습니다.
- Sylgard와 금속 사각형에 부착 22mm 2 coverslip. 철저하게 coverslip을 봉인하기 위해 충분히 Sylgard 사용합니다. 거꾸로 현미경에 이미지, 배아이 coverslip에 장착되며 바닥에서 몇 군데.
- Sylgard가 하룻밤 책정할 수 있습니다. 이 슬라이드는 재사용과 사용 사이에 70 % 에탄올로 세척하고 있습니다.
2. DNA 구조의 준비
조직에 특정한 방식으로 transgene을 표현하기 위해, 관심있는 유전자는 세포 특정 발기인 뒤에 복제됩니다. 우리는 zebrafish neurogenin1 유전자 (- 3.1ngn1)의 CIS - 규제 요소를 2 또는 감각 뉴런 또는 신경 크레스트 세포의 표현을 드라이브에 sox10 유전자 (- 4.9sox10) 3, 각각을 사용합니다. 셀 및 멤브레인 역학을 시각화하기 위해, 우리는 세포질을 명시적 또는 멤브레인 -화된 fluorophores. 이미지 F - 굴지 배포하기 위해, 우리는 mCherry (UtrCH - mCherry)에 융합 utrophin의 calponin의 상동 도메인을 인코딩 DNA를 표현한다. UtrCH - mCherry 바이오 센서 프로브는 굴지 역학 1 방해하지 않고 F - 굴지의 시각화 수 있습니다. 우리는 재조합 기반 복제 전략 4 zebrafish Tol2kit 5 제공된 벡터 Invitrogen 게이트웨이를 사용하여 이러한 DNA 구조를 생성합니다.
- zebrafish Tol2kit 5 Multisite - 게이트웨이 기술 및 벡터를 사용하여 발현 벡터 (들)을 생성합니다. Plasmids는 pT2KXIGDin에서 Tol2 백본을 포함합니다.
- QIAfilter 플라스미드 미디 준비 키트 (QIAGEN 주)와 멸균 물 속에 elute와 플라스미드 DNA를 정화. DNA는 주사에 대한 선형 필요하지 않습니다.
3. DNA 구조의 사출
- 물에 0.2 % 페놀 레드 (사출 중 시각화를위한)에 10-50 μg / ML DNA의 최종 농도로 DNA를 희석.
- 바늘을 입력하고 보정 : 약 1 μl DNA 솔루션으로 뽑아 모세 바늘을 뒤로 - 기입하여 사출 장치의 바늘 홀더 (우리가 Picospritzer를 사용)에 그것을 삽입합니다. 좋은 포셉 사용 팁 오프닝은 직경 약 10mm입니다 같은 바늘에서 팁을 휴식. 안구 마이크로 미터와 광유의 비말의 직경을 측정합니다. 약 1 NL 볼륨의 비말을 얻으려면 압력 기간 설정을 조정합니다.
- E3 배아 매체 (5mM NaCl, KCl 0.17mM, 0.33mM CaCl 2, 0.33mM MgSO 4 * 7H 2 O, 산도 7.0) 1 - 세포 단계의 배아를 수집합니다.
- 사출 슬라이드와 슬라이드 상단과 하단 사이에 형성 직각 모서리에 위치 배아를 약 30-60 배아를 전송합니다. 배아가 표면 장력에 의해 슬라이드 개최되도록 E3의 대부분을 제거합니다.
- 세포는 사출 슬라이드의 벽에되도록 배아를 회전 구부러진 해부 핀을 사용합니다.
- 난황 통해 배아의 단일 세포로, 배아 chorion를 통해 바늘을 안내 micromanipulator을 사용합니다. 셀에 0.5-1 NL의 DNA 솔루션을 주사.
- 28.5에서 E3와 부화에 페트리 접시에 배아를 전송 ° C. 필요한 경우, 개발은 낮은 온도에서 배아를 잠복기가 느려질 수 있습니다.
4. 이미징 장착 배아
- 배아는 이미징 (우리의 목적을 위해 약 14~17시간 사후 수정)에 원하는 연령에 도달하기 전에 한 시간 정도 미세 집게로 태아의 chorions를 제거합니다.
- 형광을 갖춘 해부 현미경을 사용하여 표시된 전지와 배아를 선택합니다. 우리는 때문에 긴 작동 거리와 높은 배율 자사의 조합 니콘 AZ100 범위에서 4X 목표 (40X 배율)를 사용합니다.
- 약 50 μl E3가 0.2 % Tricaine 마취를 (10X 농도)이있는있는 microfuge 튜브로 배아를 놓습니다.
- 0.02 %의 최종 농도 Tricaine을 diluting 10 MM의 HEPES (42 ° C에서 보관)와 E3 500 μl 1퍼센트 낮은 용융 점 아가로 오스를 추가합니다.
- 즉시에 아가로 오스 드롭의 배아를 전송넓은 구멍 유리 피펫을 사용하여 이미지 슬라이드의 coverslip.
- 아가로 오스는 견고하기 전에 표시된 전지 영역 하단 coverslip (신경 능선 세포와 척수 감각 뉴런에 다운 dorsolateral에 대한 지느러미 아래)에 대해 아래로 향하게하므로, 배아를 위치.
- 이미징 챔버 조립 : 금속 이미지 슬라이드 실리콘 진공 그리스와 접사와 플라스틱 링 (2cm 외경, 높이 3mm)의 문장 한쪽 있습니다. 그리스와 반지의 반대편 코트.
- E3 10 MM HEPES 및 0.02 % Tricaine을 포함하는으로 챔버를 입력합니다. 반지의 상단 표면에 기름칠 22mm 2 coverslip을 affixing하여 챔버 상단을 밀봉합니다.
5. IX81 현미경 올림푸스 FV1000 공촛점에서 세포 행동의 4D 영상
이미지 수집의 세부 사항은 현미경 시스템의 세부 사항에 따라 달라집니다. 여기서 우리는 올림푸스 FV1000 공촛점 현미경을위한 시간 저속 수집 프로세스를 설명합니다. 자이스 혈구 LSM 510 공촛점 시스템을 6 시간 저속 취득 이전 조브 프로토콜을 참조하십시오.
- 현미경 단계에있는 슬라이드 홀더에 이미징 챔버를 삽입하여 전송되는 빛을 아래 10X 20X 또는 목표를 사용하여 배 (胚)에 중점을두고 있습니다.
- 60X 목표 (1.2 이상의 NA)로 전환하고 epifluorescence으로 표시 세포에 중점을두고 있습니다. 우리도 기름 침지 (UPLSAPO 60xO NA 1.35) 또는 물 침수 세례 (UPLSAPO 60xW NA 1.20) 렌즈를 사용합니다.
- FV 소프트웨어 (버전 1.7c)에서 레이저 스캐닝을 시작하기 위해 XY 반복을 클릭합니다.
- 조직의 손상을 방지하고 photobleaching 줄이기 위해 최소 (25 % 이하)에서 레이저 파워를 유지하면서 신호를 최적화하기 위해 수집 설정 및 이미지 수집 제어 (레이저 출력, 스캔 속도, HV, 이득 및 오프셋 레벨) 조정합니다.
- Z - 시리즈를 얻기위한 단계의 크기와 함께, Z - 스택의 상단과 하단 한계를 설정합니다. 깊이 아이콘 XY 스위프 아이콘이 XY 및 Z 강조를 가지고 있으므로 종사 있는지 확인하십시오. XYZ 스위프 아이콘을 클릭하여 인수를 시작합니다.
- 시간 경과 시리즈를 취득하려면 TimeScan 인수 설정 윈도우에서 제목 아래 시간 지점의 시간 간격과 번호를 설정합니다. XY 스위프 아이콘이 XY (Z)와 T 강조를 가지고 있도록 이미지 수집 제어 창에서 시간 아이콘을 클릭하십시오. XY (Z) T 스위프 아이콘을 클릭하여 인수를 시작합니다.
- 또는 TimeController는 시간 경과를 설정하는 데 사용할 수 있습니다. 대용량 데이터 집합을 생성할 때 메모리 할당을 초과하지 않으므로이 프로그램은 유용합니다. 장치에서 TimeController 창을 엽니다. 새로운 이미징 작업을 만듭니다. 이미지 매개 변수 창이 열립니다. 수집 설정을 업데이 트 FV 상태 버튼을 클릭합니다. 확인 확실히 저장하고 종료 표제 아래 선택되어 삭제합니다. 출력 파일 이름을 설정하고 설정을 저장하고 창을 닫습니다. 시간이 지점의 원하는 시간 간격과 전화 번호를 설정하는 루프 기능을 사용하십시오. 준비 클릭하고 수집을 시작하려면 시작합니다. 일시 정지 및 Z - 시프트 기능을하는 동안 이미지를 집중할 수 있습니다.
6. 대표 결과
그림과 영화는 막 타겟 fluorophores 또는 굴지의 바이오 센서 프로브와 함께 표시 감각 뉴런과 신경 크레스트 세포의 예제를 묘사.
그림 1 TG (ngn1 : GFP - caax)의 공촛점 이미지 (Z - 계획안). : mCherry - caax의 DNA 25 PG ngn1을 주입 유전자 변형 배아. mCherry - CAAX 라벨 라벨이 모든 Rohon - 비어드 감각 뉴런과 배경에 한 신경 세포 빨간색 (A) 그린 (B). 녹색과 빨간색 두 채널의 C) 합병 이미지. 스케일 바 = 50 μm의.
그림 2 공촛점 Z - 계획안 ~ 20 PG ngn1 주사 태아의 뉴런의 :.. mCherry - UtrCH의 DNA 16.5 HPF의 배아에서) Rohon - 비어드 감각 신경 세포. F - 굴지의 신호는 성장 콘 (화살촉)와 새로 형성된 axons 따라 라고나할까요에서 강해. B) 20 HPF의 배아에서 신경 세포가 브랜츠드 주변 축삭 (화살촉)와 좀 더 성숙 해 중앙에서 약한 신호의 성장 원뿔의 강력한 F - 굴지의 신호를 보여주는 axons (화살표). 스케일 바 = 50 μm의.
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Discussion
주입된 DNA의 최적 농도는 구조 경험적으로 결정되어야하는 모터의 크기와 강도에 따라 달라집니다. 너무 작은 transgene 표현을 주입 배아의 아주 극소수의 결과되지만 너무 DNA의 사출은 광범위한 세포 죽음으로 건강하지 못한 배아 발생할 수 있습니다. DNA 표현 수준은 세포에서 세포로 다릅니다 형광단 신호의 강도와 연결합니다. epifluorescence 아래의 배아를 정렬하지만, 표현의 매우 높은 수준들을 제외할 수 있습니다. 매우 밝은 표시 라벨이 세포는 일반적으로 또한 비정상적 세포 형태, 태그 분자의 mislocalization 및 세포 사망과 같은 독성의 명백한 증거를 보여줍니다. 일반적인 DNA 주입이 영상에 적합합니다 배아의 50~10%을 산출.
높은 수준의 표현 때 F - 굴지의 바이오 센서는 주로 부정적인 방식으로 기능을 수 있습니다. 모터 구동 표현은 문제가있다면, 바이오 센서는 mRNA를 주사하여 ubiquitously 표현하실 수 있습니다. mRNA 주입의 장점은 표현의 수준이 mRNA의 농도를 조절하여 제어할 수있다. 이 배아에서 개별 전지 멤브레인 -화된 형광단의 세포 특정 모터 구동 표현을 포함하는 구조 DNA의 공동 주사로 표시됩니다. 우리는 신경 능선 세포 7 이미지 F - 굴지이 접근 방식을 사용하고 있습니다.
우리는 종종 유전자 변형 표현 라인에 단일 셀 라벨링 기술을 수행합니다. 예를 들어, A - 3.1ngn1 주사 : TG의 배아에 mcherry는 플라스미드 (- 3.1ngn1 : GFP) 라인은 녹색 뉴런의 배경에 빨간 각 감각 뉴런 레이블을 것입니다. 이 전략은 전체 세포 인구의 컨텍스트 내에서 개별 세포의 행동 검사 수 있습니다.
우리는 이미징 신경 및 신경 능선 세포의 행동과 굴지의 유통에 여기에 중점을두고 있습니다. 그러나, DNA 플라스미드 주사로 조직을 특정 모자이크 셀 라벨링의 일반적인 방법은 형광 융합 단백질뿐만 아니라 다른 유전자 암호화된 바이오 센서 프로브와 함께 사용하기위한 확장하실 수 있습니다. 이러한 기술을 결합하는 것은 조사관은 특정 분자의 subcellular 지방화뿐만 아니라 생체내에서 신호 메커니즘을 시각화하도록 할 수 있습니다.
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Acknowledgments
이 작품은 MCH 올림푸스 FV1000 공촛점에 NS042228이 UW 동물학과 (PI 빌 베먼트)에 NIH 공유 장비 부여 S10RR023717로 인수되었다 NIH R01에 의해 지원되었다.
에리카 앤더슨, Namrata Asuri, 그리고 매튜 클레이는이 종이에 똑같이 기여.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | A5040-250G | |
| Sylgard Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 184 | |
| QIAfilter Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12243 | |
| Low melting point agarose | Invitrogen | 15517-014 | |
| Picospritzer | Parker Hannifin Corporation | 051-0302-900 |
References
- Burkel, B. M., von Dassow, G., Bement, W. M. Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin. Cell motility and the cytoskeleton. 64, 822-832 (2007).
- Blader, P., Plessy, C., Strahle, U. Multiple regulatory elements with spatially and temporally distinct activities control neurogenin1 expression in primary neurons of the zebrafish embryo. Mech Dev. 120, 211-218 (2003).
- Wada, N., Javidan, Y., Nelson, S., Carney, T. J., Kelsh, R. N., Schilling, T. F. Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull. Development. 132, 3977-3988 (2005).
- Cheo, D. L., Titus, S. A., Byrd, D. R., Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. Concerted assembly and cloning of multiple DNA segments using in vitro site-specific recombination: functional analysis of multi-segment expression clones. Genome Res. 14, 2111-2120 (2004).
- Kwan, K. M., Fujimoto, E., Grabher, C., Mangum, B. D., Hardy, M. E., Campbell, D. S., Parant, J. M., Yost, H. J., Kanki, J. P., Chien, C. B. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Dev Dyn. 236, 3088-3099 (2007).
- O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J Vis Exp. 24, (2009).
- Berndt, J. D., Clay, M. R., Langenberg, T., Halloran, M. C. Rho-kinase and myosin II affect dynamic neural crest cell behaviors during epithelial to mesenchymal transition in vivo. Dev Biol. 324, 236-244 (2008).
