Summary
Este protocolo descreve imagens de neurônios individuais ou de células da crista neural em embriões vivos zebrafish. Este método é usado para examinar comportamentos e localização celular actina microscopia de fluorescência usando lapso de tempo confocal.
Abstract
O peixe-zebra é um modelo ideal para comportamentos imagens de células durante o desenvolvimento in vivo. Embriões fertilizados peixe-zebra são externamente e, portanto, facilmente acessível em todas as fases de desenvolvimento. Além disso, sua claridade óptica permite imagens de alta resolução de celular e dinâmica molecular no ambiente natural do embrião intacto. Estamos usando uma abordagem imagens ao vivo para analisar comportamentos durante a migração de células da crista neural celular e no crescimento e orientação dos axônios dos neurônios.
Imagens ao vivo é particularmente útil para a compreensão dos mecanismos que regulam os processos de motilidade celular. Para visualizar detalhes da motilidade celular, como a atividade protrusiva e dinâmica molecular, é vantajoso para rotular células individuais. Em peixes-zebra, a injeção de DNA plasmídeo produz um padrão de expressão transitória mosaico e oferece benefícios distintos sobre os métodos de rotulagem outras células. Por exemplo, linhagens transgênicas muitas vezes rótulo populações de células inteiras e, portanto, pode obscurecer a visualização das saliências finas (ou mudanças na distribuição molecular) em uma única célula. Além disso, a injeção de DNA na fase unicelular é menos invasivo e mais preciso do que injeções de corante em fases posteriores.
Aqui nós descrevemos um método para a rotulagem de neurônios individuais em desenvolvimento ou células da crista neural e imagem o seu comportamento in vivo. Nós injetar DNA plasmídeo em uma célula de embriões palco, o que resulta em expressão do transgene mosaico. Os vetores contêm células específicas promotores que a expressão da unidade de um gene de interesse em um subconjunto de neurônios sensoriais ou células da crista neural. Nós fornecemos exemplos de células marcadas com GFP membrana alvo ou com uma sonda biosensor que permite a visualização de F-actina em células vivas 1.
Erica Andersen, Namrata Asuri e Mateus Barro contribuíram igualmente para este trabalho.
Protocol
1. Montagem de slides injeção e slides de imagens
Slides injecção:
- Prepare Sylgard elastômero de silicone de acordo com instruções do fabricante.
- Use o Sylgard de vínculo de vidro para microscópio padrão três slides juntos pelo empilhamento de um slide em cima do cruzamento de outras duas lâminas, que são dispostas lado a lado nas bordas longas. O slide superior cria um ângulo recto, ou "muro" entre o topo eo fundo slides.
- Deixe Sylgard set durante a noite. Estes slides são reutilizáveis.
Slides de imagens:
- Nós usamos retângulos de aço inoxidável cortado para o mesmo tamanho de um slide padrão de vidro de microscópio (75mm x 25mm x 1mm) para a câmara se encaixa no suporte de slides no palco microscópio. Um buraco de 1,5 cm é cortada no centro do retângulo.
- Apor a 22 mm 2 lamela para o retângulo de metal com Sylgard. Use apenas o suficiente para Sylgard completamente selar a lamela. A imagem em um microscópio invertido, embriões será montado neste lamínulas e fotografada do fundo.
- Deixe Sylgard set durante a noite. Estes slides são reutilizáveis e limpas com etanol a 70% entre os usos.
2. Preparação de construções de DNA
Para expressar um transgene em um tecido específico maneira, o gene de interesse é clonado por trás de um promotor de células específicas. Nós usamos um elemento cis-reguladora do gene neurogenin1 zebrafish (-3.1ngn1) 2 ou o gene SOX10 (-4.9sox10) 3 a unidade expressão em neurônios sensoriais ou células da crista neural, respectivamente. Para visualizar a dinâmica da membrana celular e, expressamos citoplasmática ou membrana localizada fluoróforos. A distribuição de imagens F-actina, expressamos DNA que codifica o domínio de homologia calponin de utrophin fundido a mCherry (UtrCH-mCherry). O UtrCH-mCherry sonda biossensor permite a visualização de F-actina, sem interferir com a dinâmica da actina 1. Nós gerar esses DNA construções usando o Gateway Invitrogen recombinação estratégia baseada em quatro clonagem e vetores fornecidas no Tol2kit zebrafish 5.
- Gerar vetor de expressão (s) utilizando Multisite-Gateway Tecnologia e vetores da Tol2kit zebrafish 5. Plasmídeos contém a espinha dorsal da Tol2 pT2KXIGDin.
- Purificar DNA plasmídeo com QIAfilter Plasmid Midi Prep kit (QIAGEN Inc.) e eluir em água estéril. DNA não precisa ser linearizada para a injecção.
3. Injeção de DNA construções
- Diluir o DNA para uma concentração final de 10-50 DNA mcg / ml em 0,2% de vermelho de fenol (para a visualização durante a injeção) em água.
- Encher e calibrar agulha: Back-fill puxou uma agulha capilar com cerca de 1 mL de solução de DNA e inseri-lo no porta-agulha do aparelho de injeção (usamos um Picospritzer). Usando uma pinça fina, quebra a ponta fora a agulha de modo que uma abertura é de aproximadamente 10 mm de diâmetro. Medir o diâmetro da gota de óleo mineral com um micrômetro ocular. Ajustar a configuração duração pressão para obter uma gota de aproximadamente 1 volume nl.
- Coletar uma célula embriões em estágio embrionário em meio E3 (NaCl 5mM, 0.17mm KCl, CaCl 2 0,33 mm, 0,33 mm MgSO 4 * 7H 2 O, pH 7,0).
- Transferência de cerca de 30-60 embriões para o slide de injeção ea posição dos embriões no canto ângulo reto formado entre o topo eo fundo slides. Remover a maioria da E3 de modo que os embriões são mantidos para o slide pela tensão superficial.
- Use um alfinete dobrado dissecando embriões para rodar assim que o celular é contra a parede do slide injeção.
- Use um micromanipulador para guiar a agulha através do córion do embrião, através da gema e na única célula do embrião. 0,5-1 injetar DNA nl solução para dentro da célula.
- Transferir os embriões em placas de Petri na E3 e incubar a 28,5 ° C. Se necessário, o desenvolvimento pode ser retardado por incubação de embriões em temperatura mais baixa.
4. Embriões de montagem para imagens
- Remover o córions dos embriões com uma pinça fina cerca de uma hora antes de embriões atingem a idade desejada para a imagem latente (cerca de 14-17 horas pós-fertilização para os nossos propósitos).
- Selecionar embriões com células marcadas utilizando um microscópio de dissecação equipados com fluorescência. Usamos um objetivo 4X (aumento de 40 vezes) em um escopo AZ100 Nikon devido à sua combinação de distância de trabalho longa e alta ampliação.
- Coloque um embrião em um tubo de microcentrífuga com cerca de 50 E3 l contendo 0,2% tricaina anestésico (concentração 10X).
- Adicionar 500 mL 1% agarose de baixo ponto de fusão na E3 com 10 mM HEPES (mantida a 42 ° C), diluindo o tricaina para uma concentração final de 0,02%.
- Transferir imediatamente o embrião em uma queda de agarose àlamela do slide de imagens usando uma pipeta de vidro grande furo.
- Antes da agarose endurece, a posição do embrião para a região com células marcadas é voltada para baixo contra a lamela inferior (baixo dorsal para as células da crista neural e dorsolateral para baixo para os neurônios sensoriais espinhais).
- Montagem de câmara de imagem: Revestir um lado de um anel de plástico (2 cm de diâmetro externo, 3 mm de altura) com graxa de silicone a vácuo e apor ao slide de imagens de metal. Brasão do outro lado do ringue com graxa.
- Encher a câmara com E3 contendo 10 mM HEPES e tricaina 0,02%. Seal no topo da câmara com a aposição de 22 mm 2 lamela para a superfície superior do anel untada.
5. 4D imagem de comportamentos célula em Olympus IX81 FV1000 confocal com microscópio
Os detalhes da aquisição de imagem vai depender das especificidades de seu sistema de microscópio. Aqui nós descrevemos o processo de aquisição de lapso de tempo para o FV1000 Olympus microscópio confocal. Ver JOVE protocolo anterior para aquisição de lapso de tempo com o sistema confocal Zeiss LSM 510 6.
- Coloque a câmara de imagens no suporte de slides sobre o estágio do microscópio e se concentrar no embrião através de um ou 10X 20X objetivo sob luz transmitida.
- Mudar para um objetivo 60X (NA de 1.2 ou superior) e se concentrar em células marcadas com epifluorescência. Nós usar um óleo de imersão (UPLSAPO 60xO NA 1,35) ou água de imersão (UPLSAPO 60xW NA 1,20) lente.
- No software FV (Ver 1.7c), clique em XY repetir para começar a varredura a laser.
- Ajustar as configurações de aquisição e controle de aquisição de imagem (laser de saída, velocidade de digitalização, HV, ganho, e os níveis de offset) para otimizar o sinal, mantendo a potência do laser, no mínimo (25% ou menos) para evitar danos nos tecidos e reduzir a fotodegradação.
- Para adquirir um Z-series, definir os limites superior e inferior da pilha z-, juntamente com o tamanho do passo. Verifique se o ícone de profundidade está engajada para que o ícone de varredura XY XY e Z tem destaque. Iniciar aquisição, clicando no ícone de varredura XYZ.
- Para adquirir uma série de lapso de tempo, defina o intervalo de tempo e número de pontos no tempo sob o título TimeScan na janela Configurações de Aquisição. Clique no ícone de tempo na janela de Controle de Aquisição de Imagens para que o ícone de varredura XY tem XY (Z) e T destaque. Iniciar aquisição, clicando no XY (Z) de varredura ícone T.
- Alternativamente, o TimeController pode ser usado para configurar um lapso de tempo. Esta programação é útil ao gerar grandes conjuntos de dados, já que não exceda a alocação de memória. Em dispositivo, abrir a janela TimeController. Criar uma imagem nova tarefa. A janela de parâmetros de imagem será aberta. Clique no botão Status FV para atualizar as configurações de aquisição. Certifique-se de Salvar e Excluir são verificadas sob o título Terminate. Definir o nome do arquivo de saída e clique em OK para salvar as configurações e fechar a janela. Use a função Loop para definir o intervalo de tempo desejado eo número de pontos do tempo. Clique e Pronto Iniciar para começar a aquisição. O Pause e shift-Z funções pode ser usado para redirecionar enquanto imagem.
6. Resultados representante
Os números e os filmes retratam exemplos de neurônios sensoriais e células da crista neural rotulados com membrana-alvo fluoróforos ou a sonda biosensor actina.
Figura 1 imagens Confocal (z-projeções) de um (ngn1: GFP-caax) Tg. Embrião transgênico injetados com 25 pg ngn1: mCherry-caax DNA. Os rótulos mCherry-CAAX um neurônio vermelho (A) em um fundo com todos os neurônios Rohon Beard-sensorial marcadas de verde (B). C da imagem) Merged de ambos os canais verde e vermelho. Barra de escala = 50 mm.
Figura 2 Confocal z-projeções de neurônios em embriões injetados com ~ 20 pg ngn1:.. MCherry-UtrCH DNA A) neurônio Rohon Beard-sensorial em 16,5 embrião hpf. F-actina sinal é forte em cones de crescimento (setas) e saliências ao longo dos axônios recém-formado. B) Neuron em 20 hpf embrião mostrando sinal de F-actina forte em cones de crescimento de axônio periférico ramificada (setas) e sinal fraco no centro mais maduro axônios (setas). Barra de escala = 50 mm.
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Discussion
A concentração ótima de DNA injetado irá variar dependendo do tamanho e da força do promotor construir e deve ser determinada empiricamente. Injeção de DNA em excesso pode levar a embriões doentia com a morte celular extensa, enquanto que muito pouco irá resultar em uma proporção muito pequena de embriões injetados expressando o transgene. O nível de expressão de DNA se correlaciona com a força do sinal fluoróforo, que varia de célula para célula. Embora a triagem de embriões sob epifluorescência, excluir aqueles com níveis extremamente elevados de expressão. Células marcadas que aparecem muito brilhantes geralmente também mostram sinais óbvios de toxicidade, tais como a morfologia das células anormais, mislocalization de moléculas marcadas, e morte celular. A injeção de DNA típico rendimentos 5-10% de embriões que são adequados para a imagem.
O biossensor F-actina pode funcionar de uma forma dominante negativo quando expresso em níveis elevados. Se o promotor-driven expressão é problemática, o biossensor pode ser expressa ubiquitously através da injeção de mRNA. A vantagem da injeção de mRNA é que os níveis de expressão pode ser controlada pelo ajuste da concentração de mRNA. Células individuais nestes embriões são rotulados por co-injeção de DNA contendo construir uma célula específica expressão condução promotor de um fluoróforo membrana localizada. Nós temos usado essa abordagem para a imagem F-actina nas células da crista neural 7.
Muitas vezes realizar a técnica de rotulagem de uma única célula nas linhas de expressão transgênica. Por exemplo, injetando a-3.1ngn1: mcherry plasmídeo em embriões da Tg (-3.1ngn1: gfp) linha vai etiqueta individual neurônios sensoriais vermelha em um fundo de neurônios verde. Esta estratégia permite o exame do comportamento de uma célula individual dentro do contexto da população de células inteiras.
Nós nos focamos em imagens neurais e comportamentos das células da crista neural e distribuição de actina. No entanto, o método geral de tecido rotulagem específica mosaico de células por meio de injeção de DNA plasmidial podem ser expandidos para uso com proteínas de fusão fluorescentes, bem como outros geneticamente codificado sondas biosensor. Combinando estas técnicas podem permitir que os investigadores para visualizar localização subcelular de moléculas específicas, bem como mecanismos de sinalização in vivo.
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Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo NIH R01 NS042228 para MCH O FV1000 Olympus confocal foi adquirido com uma instrumentação compartilhada NIH conceder S10RR023717 ao Departamento de Zoologia UW (PI Bement Bill).
Erica Andersen, Namrata Asuri e Mateus Barro contribuíram igualmente para este papel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | A5040-250G | |
| Sylgard Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 184 | |
| QIAfilter Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12243 | |
| Low melting point agarose | Invitrogen | 15517-014 | |
| Picospritzer | Parker Hannifin Corporation | 051-0302-900 |
References
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- Blader, P., Plessy, C., Strahle, U. Multiple regulatory elements with spatially and temporally distinct activities control neurogenin1 expression in primary neurons of the zebrafish embryo. Mech Dev. 120, 211-218 (2003).
- Wada, N., Javidan, Y., Nelson, S., Carney, T. J., Kelsh, R. N., Schilling, T. F. Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull. Development. 132, 3977-3988 (2005).
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