Summary
Dieses Protokoll beschreibt Abbildung von einzelnen Neuronen oder Neuralleistenzellen in lebenden Zebrafisch-Embryonen. Diese Methode wird verwendet, um zelluläre Verhaltensweisen und Aktin-Lokalisierung mittels Fluoreszenz konfokalen Zeitraffer-Mikroskopie zu untersuchen.
Abstract
Der Zebrafisch ist ein ideales Modell für die Bildgebung Zelle Verhaltensweisen während der Entwicklung in vivo. Zebrafisch-Embryos werden extern befruchtet und damit leicht zugänglich in allen Phasen der Entwicklung. Darüber hinaus ermöglicht die optische Klarheit hochauflösende Bildgebung von Zell-und molekulare Dynamik in die natürliche Umgebung des intakten Embryo. Wir sind mit einem Live-Imaging-Ansatz zur Zelle Verhalten während Neuralleiste Zellmigration und das Auswachsen und Führung des neuronalen Axonen zu analysieren.
Live-Bildgebung ist besonders hilfreich für das Verständnis der Mechanismen, die Zellbewegung Prozesse regulieren. Zur Visualisierung Details der Zellbewegung, wie protrusive Aktivität und Molekulardynamik, ist es vorteilhaft, einzelne Zellen markieren. In Zebrafisch, ergibt Plasmid-DNA Injektion eine vorübergehende Mosaik Expressionsmuster und bietet deutliche Vorteile gegenüber anderen Zellmarkierung Methoden. Zum Beispiel, transgenen Linien oft label gesamten Zellpopulationen und damit kann die Visualisierung der feinen Vorsprünge (oder Veränderungen in der molekularen Verteilung) in einer einzelnen Zelle im Dunkeln. Darüber hinaus ist die Injektion von DNA in der Ein-Zell-Stadium weniger invasiv und präziser als Farbstoff Injektionen in späteren Phasen.
Hier beschreiben wir eine Methode zur Kennzeichnung von einzelnen Entwicklungsländern Neuronen oder Neuralleistenzellen und Imaging ihr Verhalten in vivo. Wir injizieren Plasmid-DNA in 1-Zell-Stadium Embryonen, die in Mosaik Transgenexpression Ergebnisse. Die Vektoren enthalten Zell-spezifische Promotoren, fahren die Expression eines Gens von Interesse in einer Untergruppe von sensorischen Neuronen oder Neuralleistenzellen. Wir geben Beispiele von Zellen mit Membran gezielt GFP oder mit einem Biosensor-Sonde, die Visualisierung von F-Aktin ermöglicht in lebenden Zellen mit 1 bezeichnet.
Erica Andersen, Namrata Asuri und Matthew Lehm trugen gleichermaßen zu dieser Arbeit.
Protocol
1. Versammlung der Injektion Dias und Imaging-Folien
Injection Folien:
- Bereiten Sylgard Silikon-Elastomer gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Verwenden Sie die Sylgard zu binden drei Standard-Objektträger aus Glas zusammen durch das Stapeln einer Folie auf der Oberseite der Kreuzung der beiden anderen Folien, die side-by-side angeordnet sind an den langen Kanten. Der Oberschlitten schafft eine rechtwinklige Ecke oder "Mauer" zwischen oben und unten gleitet.
- Lassen Sylgard gesetzt Nacht. Diese Folien sind wiederverwendbar.
Imaging slide:
- Wir verwenden Edelstahl rechteckig zugeschnitten auf die gleiche Größe eines Standard-Glasobjektträger (75mm x 25mm x 1mm), so dass die Kammer passt den Diahalter auf dem Mikroskoptisch. Ein 1,5 cm großes Loch in der Mitte des Rechtecks schneiden.
- Bringen Sie eine 22 mm 2 Deckglas auf das Metall Rechteck mit Sylgard. Verwenden Sie gerade genug Sylgard gründlich Deckglasränder. Um das Bild auf einem inversen Mikroskop wird Embryonen auf dieser Deckglas montiert werden und bebildert von der Unterseite.
- Lassen Sylgard gesetzt Nacht. Diese Folien sind wiederverwendbar und gereinigt mit 70% Ethanol zwischen den Anwendungen.
2. Vorbereitung von DNA-Konstrukten
Um auszudrücken, ein Transgen in einer Gewebe-spezifischen Art und Weise wird das Gen von Interesse hinter einer Zell-spezifische Promotor kloniert. Wir verwenden eine cis-regulatorische Element des Zebrafisch-Gen neurogenin1 (-3.1ngn1) 2 oder die SOX10 Gen (-4.9sox10) 3 zum Ausdruck in sensorischen Neuronen oder Neuralleistenzellen Laufwerk bzw.. Zur Visualisierung Zelle und Membran Dynamik, drücken wir zytoplasmatische oder Membran-lokalisierte Fluorophore. Um das Bild F-Aktin-Verteilung, drücken wir DNA, die das Calponin Homologie Domäne von Utrophin fusioniert mCherry (UtrCH-mCherry). Die UtrCH-mCherry Biosensor-Sonde ermöglicht die Visualisierung von F-Aktin ohne Beeinträchtigung Aktindynamik 1. Wir erzeugen diese DNA-Konstrukte mit dem Invitrogen Gateway-Rekombination-basierte Klonen Strategie 4 und Vektoren in der Zebrafisch Tol2kit 5 vorgesehen.
- Generieren Expressionsvektor (s) mit Multisite-Gateway-Technologie und Vektoren aus dem Zebrafisch Tol2kit 5. Plasmide enthalten die TOL2 Rückgrat von pT2KXIGDin.
- Purify Plasmid-DNA mit QIAfilter Plasmid Midi Prep Kit (QIAGEN Inc.) und eluieren in sterilem Wasser. DNA muss nicht zur Injektion linearisiert werden.
3. Die Injektion von DNA-Konstrukten
- Verdünnen Sie die DNA auf eine Endkonzentration von 10-50 pg / ml DNA in 0,2% Phenolrot (für die Visualisierung während der Injektion) in Wasser.
- Fill und kalibrieren Nadel: Back-füllen gezogen Kapillarnadel mit etwa 1 ul DNA-Lösung und setzen Sie sie in den Nadelhalter des Injektionsgeräts (wir verwenden eine Picospritzer). Mit einer feinen Pinzette, brechen die Spitze vor der Nadel, so dass die Spitze Öffnung ca. 10 mm im Durchmesser ist. Messen Sie den Durchmesser des Tropfens in Mineralöl mit einem Okularmikrometer. Stellen Sie den Druck Dauer Einstellung auf ein Tröpfchen von ca. 1 nl Volumen zu bekommen.
- Sammeln Sie 1-Zell-Stadium Embryos in E3 Embryo Medium (5mm NaCl, 0,17 mm KCl, 0,33 mm CaCl 2, 0,33 mm MgSO 4 * 7H 2 O, pH 7,0).
- Transfer ca. 30-60 Embryonen zur Injektion schieben und die Position der Embryonen in den rechten Winkel Ecke zwischen der oberen und unteren Folien gebildet. Entfernen Sie die meisten der E3 so, dass die Embryonen, um die Folie durch die Oberflächenspannung gehalten werden.
- Verwenden Sie einen gebogenen Sezieren pin Embryonen zu drehen, so wird die Zelle gegen die Wand der Injektion gleiten.
- Verwenden Sie einen Mikromanipulator, um die Nadel durch den Embryo Chorion Führung durch das Eigelb und in die einzelne Zelle des Embryos. Inject 0,5-1 nl DNA-Lösung in die Zelle.
- Übertragen Sie die Embryonen in Petrischalen in E3 und inkubieren bei 28,5 ° C. Falls erforderlich, kann die Entwicklung durch Inkubieren Embryonen bei einer niedrigeren Temperatur verlangsamt werden.
4. Montage Embryonen für die Bildgebung
- Entfernen Sie das Chorion von Embryonen mit feinen Pinzetten etwa eine Stunde vor Embryonen die gewünschte Alter für die Bildgebung (ca. 14-17 Stunden nach der Befruchtung für unsere Zwecke) zu erreichen.
- Wählen Embryonen mit markierten Zellen mit einem Binokular mit Fluoreszenz ausgestattet. Wir verwenden ein 4X Objektiv (40-facher Vergrößerung) auf einem Nikon AZ100 Umfang wegen seiner Kombination aus großem Arbeitsabstand und starker Vergrößerung.
- Ein Embryo in eine Mikrozentrifugenröhrchen mit etwa 50 ul E3 mit 0,2% Tricaine Betäubung (Konzentration 10X).
- Add 500 ul 1% Agarose für niedrigen Schmelzpunkt in E3 mit 10 mM HEPES (gehalten bei 42 ° C), Verdünnung der Tricaine bis zu einer Endkonzentration von 0,02%.
- Sofortüberweisung der Embryo in einem Agarose-Drop auf dieDeckglas der bildgebenden Dia mit einer breiten Bohrung Glaspipette.
- Bevor die Agarose erhärtet, Position des Embryos, so dass die Region mit markierten Zellen nach unten gegen den Boden Deckglas (dorsal unten für Neuralleistenzellen und dorsolateral bis zum Rückenmark sensorischen Neuronen).
- Montieren Bildgebung Kammer: Coat eine Seite eines Kunststoff-Ring (2 cm Außendurchmesser, 3 mm hoch) mit Silikon Vakuumfett und bringen das Metall Bildgebung gleiten. Coat auf der anderen Seite des Rings mit Fett.
- Füllen Sie die Kammer mit E3 mit 10 mM HEPES und 0,02% Tricaine. Seal der Kammer oben durch die Anbringung eines 22 mm 2 Deckglas nach oben gefettete Oberfläche des Ringes.
5. 4D-Bildgebung von Zell-Verhalten auf dem Olymp FV1000 konfokalen Mikroskop mit IX81
Die Details der Bildaufnahme wird auf die Besonderheiten Ihres Mikroskop-System ab. Hier beschreiben wir die Zeitraffer-Übernahme-Prozess für die Olympus FV1000 konfokalen Mikroskop. Siehe vorherige JoVE Protokoll für Zeitraffer-Aufnahme mit dem Zeiss LSM 510 konfokalen System 6.
- Legen Sie die Imaging-Kammer in den Diahalter auf dem Mikroskoptisch und konzentrieren sich auf den Embryo mit einem 10X oder 20X Ziel unter Durchlicht.
- Wechseln Sie zu einem 60X Objektiv (NA von 1,2 oder höher) und konzentrieren sich auf markierten Zelle mit Epifluoreszenz. Wir verwenden entweder eine Öl-Immersion (UPLSAPO 60xO NA 1,35) oder Eintauchen in Wasser (UPLSAPO 60xW NA 1,20) Objektiv.
- In der FV-Software (Version 1.7c), auf XY zu wiederholen, um Laser-Scanning zu beginnen.
- Passen Erwerb Einstellungen und Bildaufnahme Kontrollen (Laserleistung, Scan-Geschwindigkeit, HV, Verstärkung und Offset-Werte) zu signalisieren, zu optimieren und dabei Laserleistung auf ein Minimum (25% oder niedriger) zu Gewebeschäden zu verhindern und zu reduzieren Ausbleichen.
- Zum Erwerb einer Z-Serie, stellen Sie den oberen und unteren Grenzen der z-Stack, zusammen mit Schrittweite. Sicherstellen, dass die Tiefe Symbol so engagiert, dass die XY Sweep icon XY und Z hervorgehoben hat. Erfassung starten, indem Sie die XYZ-Sweep-Symbol.
- Zum Erwerb einer Zeitraffer-Serie, das Zeitintervall und Anzahl von Zeitpunkten unter dem TimeScan Rubrik der Übernahme Fenster Einstellungen. Klicken Sie auf das Icon in der Zeit Image Acquisition Control Window, so dass die XY Sweep icon XY (Z) und T hervorgehoben hat. Starten Übernahme durch Klicken auf die XY (Z) T Sweep-Symbol.
- Alternativ kann die TimeController verwendet werden, um die Einrichtung eines Zeitraffer werden. Diese Programmierung ist nützlich bei der Generierung großer Datenmengen, wie sie nicht mehr als Speicherzuweisung. Unter Gerät öffnen TimeController Fenster. Erstellen Sie eine neue Imaging Task. Das Bild-Parameter-Fenster wird geöffnet. Klicken Sie auf den FV Status, um Erwerb Einstellungen zu aktualisieren. Stellen Sie sicher, Speichern und Löschen sind unter der Überschrift Terminate überprüft. Set Ausgang Dateinamen ein und klicken auf OK, um die Einstellungen zu speichern und das Fenster schließen. Verwenden Sie die Loop-Funktion, um das gewünschte Zeitintervall und Anzahl der Zeitpunkte festgelegt. Klicken Sie auf Fertig und Start der Akquisition zu beginnen. Die Pause und Z-Shift-Funktion kann verwendet werden, um während Bildgebung konzentrieren werden.
6. Repräsentative Ergebnisse
Die Figuren und Filme zeigen Beispiele von sensorischen Neuronen und Neuralleistenzellen mit Membran-gezielte Fluorophore oder die Aktin-Biosensor-Sonde markiert.
Abbildung 1 Konfokale Bilder (z-Projektionen) einer Tg (ngn1: gfp-CAAX). Transgenen Embryos mit 25 injiziert pg ngn1: mCherry-CAAX DNA. Die mCherry-CAAX Etiketten ein Neuron rot (A) in einem Hintergrund mit allen Rohon-Beard sensorischen Neuronen gekennzeichnet grün (B). C) zusammengefügte Bild der beiden grünen und roten Kanälen. Balken = 50 um.
Abbildung 2 Confocal z-Projektionen von Neuronen in Embryonen mit ~ 20 pg ngn1 injiziert:.. MCherry-UtrCH DNA A) Rohon-Beard sensorischen Neurons in 16,5 hpf Embryo. F-Aktin-Signal wird in das Wachstum Kegel (Pfeilspitzen) und in Vorsprüngen entlang neugebildeten Axone stark. B) Neuron in 20 hpf Embryo starke F-Aktin-Signal zeigt in Wachstum Kegel von verzweigten peripheren Axon (Pfeilspitzen) und schwächeres Signal in reiferen zentralen Axone (Pfeile). Balken = 50 um.
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Discussion
Die optimale Konzentration der injizierten DNA variiert je nach Größe und Stärke der Promotor-Konstrukt und sollten empirisch ermittelt werden. Die Injektion von zu viel DNA kann zu ungesunden Embryonen mit umfangreichen Zelltod führen, während zu wenig in einem sehr kleinen Teil der injizierten Embryonen exprimieren das Transgen führen wird. Die DNA-Expression korreliert mit der Stärke des Fluorophor-Signal, das von Zelle zu Zelle variiert. Während Sortierung Embryonen unter Epifluoreszenz, schließen diejenigen mit sehr hohen Ebenen des Ausdrucks. Markierten Zellen, die sehr hell erscheinen in der Regel auch zeigen offensichtliche Anzeichen von Toxizität, wie abnormal Zellmorphologie, mislocalization von markierten Molekülen und Zelltod. Ein typisches DNA-Injektion liefert 5-10% der Embryonen, die für Bildgebung werden.
Die F-Aktin-Biosensor kann in einer dominant negativen Weise funktionieren, wenn auf einem hohen Niveau zum Ausdruck gebracht. Wenn Promotor getriebene Expression ist problematisch, kann der Biosensor ubiquitär durch die Injektion von mRNA ausgedrückt werden. Der Vorteil der mRNA Injektion ist, dass die Expression durch Anpassung der Konzentration der mRNA gesteuert werden kann. Einzelne Zellen in diese Embryonen werden durch Co-Injektion von DNA markierten Konstrukts mit einem Zell-spezifischen Promotor die Expression einer Membran-lokalisierten Fluorophor. Wir haben diesen Ansatz auf Bild F-Aktin verwendet in Neuralleiste Zellen 7.
Wir haben oft die Durchführung der Single-Cell-Kennzeichnung Technik in transgenen Mimikfalten. Zum Beispiel, Injizieren a-3.1ngn1: mCherry Plasmid in Embryonen von Tg (-3.1ngn1: gfp) Linie einzelnen sensorischen Neuronen in einem roten Hintergrund der grünen Neuronen Etikett. Diese Strategie ermöglicht die Untersuchung des Verhaltens einer einzelnen Zelle im Kontext der gesamten Zellpopulation.
Wir konzentrieren uns hier auf die Bildgebung neuronaler und Neuralleiste Zelle Verhaltensweisen und Aktin-Distribution. Allerdings kann die allgemeine Methode der gewebespezifischen Mosaik Zellmarkierung von DNA-Plasmid Injektion für die Verwendung mit fluoreszierenden Fusionsproteinen sowie andere genetisch kodierte Biosensor-Sonden erweitert werden. Die Kombination dieser Techniken können die Ermittler subzelluläre Lokalisation von spezifischen Molekülen sowie Signaltechnik Mechanismen in vivo sichtbar zu machen.
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Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom NIH R01 unterstützt NS042228 zu MCH Die Olympus FV1000 konfokalen mit einem NIH gemeinsame Instrumente zu gewähren S10RR023717 der UW Zoologisches Institut (PI Bill Bement) erworben wurde.
Erica Andersen, Namrata Asuri und Matthew Lehm trugen gleichermaßen zu dieser Veröffentlichung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | A5040-250G | |
| Sylgard Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 184 | |
| QIAfilter Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12243 | |
| Low melting point agarose | Invitrogen | 15517-014 | |
| Picospritzer | Parker Hannifin Corporation | 051-0302-900 |
References
- Burkel, B. M., von Dassow, G., Bement, W. M. Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin. Cell motility and the cytoskeleton. 64, 822-832 (2007).
- Blader, P., Plessy, C., Strahle, U. Multiple regulatory elements with spatially and temporally distinct activities control neurogenin1 expression in primary neurons of the zebrafish embryo. Mech Dev. 120, 211-218 (2003).
- Wada, N., Javidan, Y., Nelson, S., Carney, T. J., Kelsh, R. N., Schilling, T. F. Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull. Development. 132, 3977-3988 (2005).
- Cheo, D. L., Titus, S. A., Byrd, D. R., Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. Concerted assembly and cloning of multiple DNA segments using in vitro site-specific recombination: functional analysis of multi-segment expression clones. Genome Res. 14, 2111-2120 (2004).
- Kwan, K. M., Fujimoto, E., Grabher, C., Mangum, B. D., Hardy, M. E., Campbell, D. S., Parant, J. M., Yost, H. J., Kanki, J. P., Chien, C. B. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Dev Dyn. 236, 3088-3099 (2007).
- O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J Vis Exp. 24, (2009).
- Berndt, J. D., Clay, M. R., Langenberg, T., Halloran, M. C. Rho-kinase and myosin II affect dynamic neural crest cell behaviors during epithelial to mesenchymal transition in vivo. Dev Biol. 324, 236-244 (2008).
