Summary
इस प्रोटोकॉल zebrafish भ्रूण में रहने वाले व्यक्ति या न्यूरॉन्स के तंत्रिका शिखा कोशिकाओं की इमेजिंग का वर्णन करता है. इस विधि के सेलुलर व्यवहार और actin स्थानीयकरण प्रतिदीप्ति confocal माइक्रोस्कोपी समय चूक का उपयोग की जांच करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
Abstract
zebrafish इमेजिंग vivo में विकास के दौरान सेल के व्यवहार के लिए एक आदर्श मॉडल है. Zebrafish भ्रूण बाह्य निषेचित कर रहे हैं और इस तरह आसानी से विकास के सभी चरणों में सुलभ है. इसके अलावा, उनके ऑप्टिकल स्पष्टता बरकरार भ्रूण के प्राकृतिक वातावरण में सेल और आणविक गतिशीलता के उच्च संकल्प इमेजिंग की अनुमति देता है. हम एक जीवित इमेजिंग दृष्टिकोण का उपयोग कर रहे हैं तंत्रिका शिखा सेल प्रवास और परिणाम और neuronal axons की मार्गदर्शन के दौरान सेल व्यवहार का विश्लेषण.
लाइव इमेजिंग तंत्र है कि सेल गतिशीलता की प्रक्रिया को विनियमित समझने के लिए विशेष रूप से उपयोगी है. आगे फैलनेवाला गतिविधि और सेल गतिशीलता के आणविक गतिशीलता के विवरण जैसे, कल्पना, यह व्यक्ति की कोशिकाओं लेबल के लिए फायदेमंद है. Zebrafish में, डीएनए प्लाज्मिड इंजेक्शन पैदावार एक क्षणिक मोज़ेक अभिव्यक्ति पैटर्न और अन्य सेल लेबलिंग तरीकों पर अलग लाभ प्रदान करता है है. उदाहरण के लिए, ट्रांसजेनिक लाइनों अक्सर पूरे सेल आबादी लेबल और इस प्रकार किसी एकल कक्ष (या वितरण में आणविक परिवर्तन) में ठीक protrusions के दृश्य अस्पष्ट हो सकता है. इसके अलावा, डीएनए के एक सेल मंच पर इंजेक्शन कम आक्रामक और बाद में चरणों में डाई इंजेक्शन की तुलना में अधिक सटीक है.
यहाँ हम व्यक्ति के विकास न्यूरॉन्स या तंत्रिका शिखा कोशिकाओं और इमेजिंग vivo में उनके व्यवहार लेबल के लिए एक विधि का वर्णन. हम एक सेल चरण भ्रूण, मोज़ेक transgene अभिव्यक्ति में जो परिणाम में प्लास्मिड डीएनए इंजेक्षन. वैक्टर सेल विशिष्ट प्रमोटरों होते हैं कि संवेदी न्यूरॉन्स या तंत्रिका शिखा कोशिकाओं की एक सबसेट में ब्याज की एक जीन की अभिव्यक्ति ड्राइव. हम झिल्ली लक्षित GFP के साथ या कि 1 कोशिकाओं में रहने वाले एफ actin के दृश्य की अनुमति देता है एक biosensor जांच के साथ लेबल की कोशिकाओं के उदाहरण देते हैं.
एरिका एंडरसन, नम्रता Asuri, और मैथ्यू क्ले इस काम के लिए समान रूप से योगदान दिया.
Protocol
1. इंजेक्शन स्लाइड और इमेजिंग स्लाइड्स की सभा
इंजेक्शन स्लाइड्स:
- Sylgard सिलिकॉन elastomer निर्माता के निर्देशों के अनुसार तैयार करें.
- बांड तीन मानक कांच खुर्दबीन Sylgard का प्रयोग करें एक साथ दो अन्य स्लाइड्स, जो लंबे किनारों पर पक्ष द्वारा साइड की व्यवस्था कर रहे हैं के चौराहे के शीर्ष पर एक स्लाइड stacking द्वारा स्लाइड. शीर्ष स्लाइड सही - angled एक कोने या ऊपर और नीचे स्लाइड्स के बीच "दीवार" बनाता है.
- Sylgard रातोंरात सेट. इन स्लाइड्स को पुन: प्रयोज्य हैं.
इमेजिंग स्लाइड:
- हम स्टेनलेस स्टील आयत एक मानक गिलास खुर्दबीन स्लाइड (75mm एक्स 25mm 1mm एक्स) के एक ही आकार में कटौती का उपयोग करें ताकि कक्ष खुर्दबीन मंच पर स्लाइड धारक फिट बैठता है. आयत के केंद्र में एक 1.5 सेमी छेद काट रहा है.
- प्रत्यय एक 22 मिमी 2 Sylgard साथ धातु आयत coverslip. बस Sylgard पर्याप्त का प्रयोग अच्छी तरह से coverslip मुहर. एक उलटा माइक्रोस्कोप पर छवि करने के लिए, भ्रूण इस coverslip पर घुड़सवार हो जाएगा और नीचे से imaged.
- Sylgard रातोंरात सेट. इन स्लाइड्स को पुन: प्रयोज्य और उपयोग करता है के बीच 70% इथेनॉल के साथ साफ कर रहे हैं.
2. डीएनए constructs तैयार
एक ऊतक के विशिष्ट तरीके में एक transgene व्यक्त करने के लिए, ब्याज की जीन एक सेल विशिष्ट प्रमोटर पीछे क्लोन है. हम zebrafish neurogenin1 जीन (3.1ngn1 -) के एक सीआईएस नियामक तत्व 2 या sox10 (4.9sox10) जीन 3 संवेदी न्यूरॉन्स या तंत्रिका शिखा कोशिकाओं में अभिव्यक्ति ड्राइव, क्रमशः का उपयोग करें. सेल और झिल्ली गतिशीलता कल्पना करने के लिए, हम cytoplasmic व्यक्त या झिल्ली स्थानीयकृत fluorophores. छवि वितरण एफ-actin करने के लिए, हम डीएनए एन्कोडिंग utrophin calponin अनुरूपता डोमेन mCherry (UtrCH - mCherry) के लिए जुड़े हुए व्यक्त करते हैं. UtrCH mCherry biosensor जांच actin एक गतिशीलता के साथ हस्तक्षेप के बिना एफ actin के दृश्य की अनुमति देता है. हम इन डीएनए के constructs Invitrogen गेटवे पुनर्संयोजन - आधारित क्लोनिंग 4 रणनीति और zebrafish Tol2kit में 5 प्रदान वैक्टर का उपयोग उत्पन्न करते हैं.
- अभिव्यक्ति वेक्टर (ओं) zebrafish Tol2kit 5 से एकाधिक साइट - गेटवे प्रौद्योगिकी और वैक्टर का उपयोग कर उत्पन्न करता है. प्लास्मिड pT2KXIGDin से Tol2 रीढ़ की हड्डी होते हैं.
- QIAfilter प्लाज्मिड Midi तैयारी (QIAGEN इंक) किट और बाँझ पानी में elute साथ प्लाज्मिड डीएनए शुद्ध. डीएनए के लिए इंजेक्शन के लिए linearized जा जरूरत नहीं है.
3. डीएनए constructs के इंजेक्शन
- 0.2% पानी में phenol लाल (इंजेक्शन दौरान दृश्य के लिए) में 10-50 डीएनए / μg मिलीलीटर के अंतिम एकाग्रता के लिए डीएनए पतला.
- भरें और सुई जांचना: लगभग 1 μl डीएनए समाधान के साथ एक केशिका सुई खींच वापस भरने के लिए और यह इंजेक्शन तंत्र की सुई धारक (हम Picospritzer उपयोग) में सम्मिलित. एक ठीक संदंश का प्रयोग, जैसे कि टिप खोलने के व्यास में लगभग 10 मिमी है सुई बंद टिप को तोड़ने. खनिज तेल में एक नेत्र सुक्ष्ममापी के साथ छोटी बूंद के व्यास उपाय. लगभग 1 nl मात्रा की एक छोटी बूंद पाने के दबाव की अवधि सेटिंग समायोजित.
- E3 भ्रूण मध्यम (NaCl 5mm, 0.17mM KCl, 0.33mM 2 CaCl, 0.33mM MgSO 4 * 7 2 हे, 7.0 पीएच) में 1-सेल चरण भ्रूण लीजिए.
- इंजेक्शन स्लाइड और सही कोण ऊपर और नीचे स्लाइड के बीच का गठन कोने में भ्रूण की स्थिति के लिए लगभग 30-60 भ्रूण स्थानांतरण. E3 इतना है कि भ्रूण सतह तनाव द्वारा स्लाइड करने के लिए आयोजित कर रहे हैं के सबसे निकालें.
- तुला विदारक पिन का उपयोग करने के लिए बारी बारी से भ्रूण तो सेल इंजेक्शन स्लाइड की दीवार के खिलाफ है.
- भ्रूण chorion के माध्यम से की जर्दी के माध्यम से और भ्रूण के एकल कक्ष में सुई, गाइड micromanipulator का प्रयोग करें. सेल में 0.5-1 nl डीएनए समाधान इंजेक्षन.
- E3 और सेते में पेट्री डिश में 28.5 पर भ्रूण का स्थानांतरण डिग्री सेल्सियस यदि आवश्यक हो, कम तापमान पर भ्रूण incubating द्वारा विकास धीमा हो सकता है है.
4. इमेजिंग के लिए बढ़ते भ्रूण
- एक घंटे के बारे में ठीक संदंश के साथ भ्रूण से chorions निकालें से पहले भ्रूण इमेजिंग (हमारे प्रयोजनों के लिए लगभग 14-17 घंटे के बाद निषेचन) के लिए वांछित उम्र तक पहुँचने.
- लेबल एक विदारक प्रतिदीप्ति के साथ सुसज्जित खुर्दबीन का उपयोग कोशिकाओं के साथ भ्रूण का चयन करें. हम लंबे समय तक काम दूरी और उच्च वृद्धि के अपने संयोजन की वजह से एक Nikon AZ100 गुंजाइश पर एक 4X उद्देश्य (40x बढ़ाई) का उपयोग करें.
- लगभग 50 μl E3 0.2% Tricaine संवेदनाहारी (10X एकाग्रता) युक्त के साथ एक microfuge ट्यूब में एक भ्रूण रखें.
- 10 मिमी (42 ° सी में रखा) HEPES, 0.02% की एक अंतिम एकाग्रता Tricaine गिराए के साथ 500 μl 1% E3 में कम पिघलने बिंदु agarose जोड़ें.
- तुरंत एक agarose बूंद में भ्रूण स्थानांतरणइमेजिंग स्लाइड की एक विस्तृत बोर कांच विंदुक का उपयोग coverslip.
- इससे पहले agarose hardens, भ्रूण की स्थिति तो लेबल कोशिकाओं के साथ क्षेत्र के नीचे के नीचे coverslip (तंत्रिका शिखा कोशिकाओं और रीढ़ की हड्डी संवेदी न्यूरॉन्स के लिए नीचे dorsolateral के लिए पृष्ठीय नीचे) के खिलाफ का सामना करना पड़ रहा है.
- इमेजिंग चैम्बर इकट्ठा: कोट सिलिकॉन वैक्यूम तेल और धातु इमेजिंग स्लाइड करने के लिए प्रत्यय के साथ एक प्लास्टिक की अंगूठी (2 सेमी बाहरी व्यास, 3 मिमी उच्च) के एक तरफ. कोट अंगूठी के दूसरी ओर तेल के साथ.
- कक्ष E3 10 मिमी HEPES और 0.02% Tricaine युक्त के साथ भरें. चैम्बर शीर्ष अंगूठी के शीर्ष greased सतह के लिए एक 22 मिमी 2 coverslip affixing द्वारा सील .
5. 4D ओलिंप FV1000 confocal पर सेल व्यवहार के IX81 खुर्दबीन के साथ इमेजिंग
छवि अधिग्रहण का विवरण अपने खुर्दबीन प्रणाली की बारीकियों पर निर्भर करेगा. यहाँ हम समय चूक ओलिंप FV1000 confocal खुर्दबीन के लिए अधिग्रहण प्रक्रिया का वर्णन. Zeiss LSM 510 confocal 6 प्रणाली के साथ समय चूक के अधिग्रहण के लिए पिछले जौव प्रोटोकॉल देखें.
- इमेजिंग चैम्बर स्लाइड धारक में खुर्दबीन मंच पर प्लेस और संचारित प्रकाश के तहत एक 10X या 20X उद्देश्य भ्रूण का उपयोग पर ध्यान केंद्रित.
- एक 60x उद्देश्य (1.2 या उच्चतर के एनए) के लिए स्विच और epifluorescence के साथ लेबल कक्ष पर ध्यान केंद्रित. हम या तो एक तेल (60xO UPLSAPO 1.35 एनए) विसर्जन या विसर्जन पानी लेंस (UPLSAPO 60xW एनए 1.20) का उपयोग करें.
- FV सॉफ्टवेयर (1.7c वर) में, XY लेजर स्कैनिंग शुरू दोहराने पर क्लिक करें.
- अधिग्रहण सेटिंग्स और छवि अधिग्रहण नियंत्रण लेजर उत्पादन, स्कैन गति, एचवी, लाभ, और ऑफसेट स्तर को समायोजित करने के लिए संकेत अनुकूलन, जबकि एक न्यूनतम (25% या कम) में लेसर शक्ति रखने के लिए ऊतकों को नुकसान को रोकने और कम photobleaching.
- एक जेड श्रृंखला के अधिग्रहण के लिए, z - ढेर के ऊपरी और निचली सीमाओं कदम आकार के साथ साथ, सेट. सुनिश्चित करें कि गहराई आइकन इतनी लगी हुई है कि XY स्वीप आइकन XY और जेड पर प्रकाश डाला गया है. XYZ स्वीप आइकन पर क्लिक करके अधिग्रहण शुरू करो.
- एक श्रृंखला के समय चूक प्राप्त करने के लिए, अधिग्रहण सेटिंग्स विंडो में TimeScan शीर्षक के अंतर्गत समय और समय अंक के अंतराल संख्या सेट. छवि अधिग्रहण नियंत्रण विंडो में समय चिह्न ताकि XY स्वीप आइकन XY (जेड) और टी पर प्रकाश डाला गया है क्लिक करें. XY (जेड) टी स्वीप आइकन पर क्लिक करके अधिग्रहण शुरू करो.
- वैकल्पिक रूप से, TimeController एक समय चूक सेट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस प्रोग्रामिंग में उपयोगी है जब बड़े डेटा सेट पैदा करने, के रूप में यह स्मृति आवंटन से अधिक नहीं करता है. डिवाइस के तहत, TimeController खिड़की खोलने के लिए. एक नया इमेजिंग कार्य बनाएँ. छवि पैरामीटर विंडो खुलेगा. FV स्थिति अधिग्रहण सेटिंग्स को अद्यतन करने के लिए बटन क्लिक करें. सुनिश्चित करें सहेजें और हटाएँ बर्खास्त शीर्षक के तहत जाँच कर रहे हैं. आउटपुट फ़ाइल नाम सेट और सेटिंग्स सहेजने और विंडो बंद के लिए ठीक क्लिक करें. लूप फ़ंक्शन का उपयोग करने के लिए इच्छित समय और समय अंक के अंतराल संख्या सेट. तैयार पर क्लिक करें और अधिग्रहण शुरू प्रारंभ. रोकें और जेड पारी कार्य जबकि इमेजिंग refocus करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
6. प्रतिनिधि परिणाम
आंकड़े और फिल्मों संवेदी न्यूरॉन्स और तंत्रिका शिखा कोशिकाओं झिल्ली लक्षित fluorophores या actin biosensor जांच के साथ लेबल के उदाहरण को दर्शाती है.
चित्रा 1 एक टीजी (ngn1: GFP-caax) के Confocal छवियाँ (z-अनुमानों): mCherry - caax डीएनए ट्रांसजेनिक 25 के साथ स्नातकोत्तर ngn1 इंजेक्शन भ्रूण . mCherry - CAAX लेबल हरे सभी Rohon दाढ़ी लेबल संवेदी न्यूरॉन्स के साथ एक पृष्ठभूमि में एक न्यूरॉन लाल (ए) (बी) सी) हरे और लाल दोनों चैनलों के विलय छवि . स्केल बार = 50 सुक्ष्ममापी.
चित्रा 2 Confocal z-~ 20 ngn1 स्नातकोत्तर इंजेक्शन के साथ भ्रूण में न्यूरॉन्स की: अनुमानों. MCherry - UtrCH डीएनए) Rohon दाढ़ी 16.5 HPF भ्रूण में संवेदी न्यूरॉन. एफ actin संकेत विकास शंकु (arrowheads) में और नवगठित axons साथ protrusions में मजबूत बी) 20 HPF भ्रूण में न्यूरॉन branched परिधीय (arrowheads) अक्षतंतु और अधिक परिपक्व मध्य में कमजोर संकेत के विकास शंकु में मजबूत संकेत एफ actin दिखा. axons (तीर). स्केल बार = 50 सुक्ष्ममापी.
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Discussion
इंजेक्शन डीएनए के इष्टतम एकाग्रता आकार और प्रमोटर की ताकत के आधार पर निर्माण और empirically निर्धारित किया जाना चाहिए अलग अलग होंगे. बहुत ज्यादा डीएनए इंजेक्शन व्यापक कोशिका मृत्यु के साथ अस्वास्थ्यकर भ्रूण करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, जबकि बहुत कम इंजेक्शन भ्रूण transgene व्यक्त की एक बहुत छोटे से अनुपात में परिणाम होगा. डीएनए की अभिव्यक्ति के स्तर fluorophore संकेत है, जो सेल से सेल को बदलता है की ताकत के साथ संबद्ध है. जबकि epifluorescence के तहत भ्रूण छँटाई, अभिव्यक्ति की अत्यंत उच्च स्तर के साथ उन लोगों को बाहर. लेबल कोशिकाओं है कि बहुत उज्ज्वल दिखाई देते हैं आमतौर पर भी विषाक्तता के असामान्य सेल आकारिकी, टैग अणुओं की mislocalization, और कोशिका मृत्यु के रूप में स्पष्ट संकेत दिखा. एक ठेठ डीएनए इंजेक्शन पैदावार भ्रूण के 5-10% है कि इमेजिंग के लिए उपयुक्त हैं.
एफ - actin biosensor एक प्रमुख नकारात्मक फैशन समारोह में जब उच्च स्तर पर व्यक्त कर सकते हैं. यदि प्रमोटर - संचालित अभिव्यक्ति समस्याग्रस्त है, biosensor mRNA इंजेक्शन द्वारा सर्वत्र व्यक्त कर सकते हैं. mRNA इंजेक्शन के लाभ यह है कि अभिव्यक्ति के स्तर mRNA की एकाग्रता का समायोजन करके नियंत्रित किया जा सकता है. इन भ्रूण में व्यक्तिगत कोशिकाओं के डीएनए के सह इंजेक्शन द्वारा चिह्नित कर रहे हैं एक झिल्ली स्थानीयकृत fluorophore के सेल विशिष्ट प्रमोटर ड्राइविंग अभिव्यक्ति युक्त निर्माण. हम तंत्रिका शिखा 7 कोशिकाओं में इस दृष्टिकोण एफ actin छवि का इस्तेमाल किया है.
हम अक्सर बाहर ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति लाइनों में लेबलिंग एकल कोशिका तकनीक ले. उदाहरण के लिए, एक 3.1ngn1 इंजेक्शन: mcherry टीजी की भ्रूण में प्लाज्मिड (3.1ngn1: GFP) लाइन व्यक्तिगत संवेदी हरी न्यूरॉन्स की पृष्ठभूमि में लाल न्यूरॉन्स लेबल होगा. इस रणनीति के पूरे सेल की आबादी के संदर्भ के भीतर एक व्यक्ति सेल के व्यवहार की परीक्षा की अनुमति देता है.
हम यहाँ इमेजिंग तंत्रिका और तंत्रिका शिखा सेल व्यवहार और actin के वितरण पर ध्यान केंद्रित. हालांकि, ऊतक डीएनए प्लाज्मिड इंजेक्शन द्वारा विशिष्ट मोज़ेक सेल लेबलिंग के सामान्य विधि फ्लोरोसेंट संलयन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रोटीन अन्य आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग biosensor जांच के साथ प्रयोग के लिए विस्तारित किया जा सकता है. इन तकनीकों के संयोजन जांचकर्ताओं विशेष के अणुओं की subcellular स्थानीयकरण के रूप में के रूप में अच्छी तरह vivo में संकेतन तंत्र कल्पना करने के लिए अनुमति दे सकते हैं .
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Acknowledgments
यह काम R01 NIH द्वारा समर्थित किया गया NS042228 मातृ एवं शिशु स्वास्थ्य ओलिंप FV1000 confocal एक NIH साझा UW जूलॉजी विभाग (पीआई विधेयक Bement) इंस्ट्रूमेंटेशन S10RR023717 अनुदान के साथ अधिग्रहण कर लिया था.
एरिका एंडरसन, नम्रता Asuri, और मैथ्यू क्ले इस पत्र के लिए समान रूप से योगदान दिया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | A5040-250G | |
| Sylgard Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 184 | |
| QIAfilter Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12243 | |
| Low melting point agarose | Invitrogen | 15517-014 | |
| Picospritzer | Parker Hannifin Corporation | 051-0302-900 |
References
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