Summary
Bu protokol zebrafish embriyolar yaşayan tek tek nöronların veya nöral krest hücreleri görüntüleme açıklar. Bu yöntem, floresan konfokal zaman atlamalı mikroskopi kullanılarak cep davranışlar ve aktin lokalizasyonu incelemek için kullanılır.
Abstract
Zebra balığı, in vivo geliştirme sırasında görüntüleme hücre davranışları için ideal bir model . Zebra balığı embriyolar dışarıdan döllenmiş ve gelişimin her aşamasında böylece kolayca ulaşılabilir. Ayrıca, doğal ortamda sağlam embriyonun hücre ve moleküler dinamiği yüksek çözünürlüklü görüntüleme, optik netlik sağlar. Biz nöral krest hücrelerinin göç ve nöron akson akıbet ve rehberlik sırasında hücre davranışlarını analiz etmek için canlı bir görüntüleme yaklaşımı kullanıyor.
Canlı görüntüleme, hücre hareketi süreçleri düzenleyen mekanizmalar anlamak için yararlıdır. Gibi çıkıntılı aktivite ve moleküler dinamik olarak hücre hareketi detayları, görselleştirmek için, tek tek hücrelerin etiketlemek için avantajlıdır. Zebra balığı, plazmid DNA enjeksiyonu, geçici bir mozaik ifade desenini verim ve diğer hücre etiketleme yöntemleri üzerinde farklı avantajlar sunuyor. Örneğin, transgenik çizgiler genellikle tüm hücre popülasyonlarının etiket ve böylece tek bir hücrenin ince çıkıntılar (veya moleküler dağılımında değişiklikler) görselleştirme gizleyebilir. Buna ek olarak, tek hücreli aşamada DNA enjeksiyonu, daha az invazif ve daha sonraki aşamada boya enjeksiyonu çok daha hassas.
Burada bireysel gelişmekte olan nöronların veya nöral krest hücreleri ve görüntüleme in vivo olarak davranışlarını etiketleme için bir yöntem açıklanmaktadır . Biz mozaik transgen ifadesi sonuçları 1-hücreli dönem embriyoların, plazmid DNA enjekte edilir. Vektörlerin hücre özel rehberleri içeren duyusal nöronların veya nöral krest hücrelerinin bir alt kümesi olan ilgi bir gen sürücü ifadesi. Biz membran hedef GFP ile veya canlı hücreleri 1 F-aktin görselleştirme sağlayan bir biyosensör probu ile işaretli hücrelerin örnekler sunuyor.
Erica Andersen, Namrata Asuri ve Matthew Kil, bu çalışmaya eşit katkıda bulundu.
Protocol
1. Enjeksiyon slaytlar ve görüntüleme slaytlar Meclisi
Enjeksiyon slaytlar:
- Sylgard silikon elastomer üreticinin talimatlarına göre hazırlayın.
- Bond üç standart cam mikroskop Sylgard kullanın kesiştiği uzun kenarları yan yana düzenlenmiş olan diğer iki slaytlar, üstüne bir slayt istifleme birlikte slaytlar. Üst slayt dik açılı bir köşesinde ya da üst ve alt slaytlar arasında "duvar" oluşturur.
- Sylgard gecede ayarlanmış olsun. Bu slaytları yeniden kullanılabilir.
Görüntüleme slayt:
- Odasına mikroskop sahnede slayt sahibinin uygun şekilde standart bir cam mikroskop lamı (75mm x 25mm x 1mm) aynı boyutta kesilmiş paslanmaz çelik dikdörtgenler kullanın. 1,5 cm delik dikdörtgenin merkezinde kesilir.
- Sylgard metal dikdörtgen yapıştırmayın 22 mm 2 lamel. Iyice lamel mühür yeterli Sylgard kullanın. Inverted mikroskop görüntü, embriyolar bu lamel üzerine monte edilebilir ve alttan görüntülenmiş.
- Sylgard gecede ayarlanmış olsun. Bu slaytları yeniden kullanılabilir ve kullanımlar arasında% 70'lik alkol ile temizlenmelidir.
2. DNA yapılarının hazırlanması
Transgen bir doku belirli bir şekilde ifade etmek için, faiz gen hücre özel bir organizatörü arkasında klonlanmış. Biz zebrafish neurogenin1 gen (3.1ngn1) bir cis-düzenleyici element 2 ya da duyusal nöronların veya nöral krest hücrelerinden ifade sürücü sox10 gen (-4.9sox10) 3, sırasıyla kullanın. Hücre ve membran dinamikleri görselleştirmek için, sitoplazmik ifade veya membran lokalize fluorophores. F-aktin dağıtım için, kodlayan DNA mCherry (UtrCH-mCherry) erimiş utrophin calponin homoloji etki alanı ifade eder. UtrCH mCherry biyosensör prob aktin dinamikleri 1 ile müdahale olmadan F-aktin görselleştirme sağlar. Biz rekombinasyon tabanlı klonlama stratejisi 4 ve zebrafish Tol2kit 5 sağlanan vektörler Invitrogen Gateway kullanarak bu DNA yapıları oluşturur.
- Zebrafish Tol2kit 5 Multisite-Gateway Teknolojisi ve vektörler kullanarak ifade vektör (ler) oluşturun. Plazmidler pT2KXIGDin gelen Tol2 omurgası içerir.
- QIAfilter Plazmid Midi Hazırlık kiti (QIAGEN A.Ş.) ve steril su Zehir ile plazmid DNA arındırın. DNA enjeksiyon için lineerleştirilmiş olması gerekmez.
3. DNA yapıları Enjeksiyon
- Su,% 0.2 fenol kırmızısı (enjeksiyon sırasında görünüm için) nihai konsantrasyonu 10-50 mg / ml DNA DNA sulandırınız.
- Iğne doldurun ve kalibre: yaklaşık 1 ul DNA çözümü ile çekilmiş bir kılcal iğne Geri dolgu ve iğne tutucu (bir Picospritzer) enjeksiyon aparat takın. , Ince bir forseps kullanarak, iğne ucu açıklığı yaklaşık 10 mm çapında olduğu gibi kapalı ucunu kırmak. Oküler mikrometre ile mineral yağ damlacık çapı ölçülür. Nl hacmi yaklaşık 1 Bir damla almak için baskı süresi ayarını ayarlayın.
- E3 embriyo orta (5mM NaCl, 0.17mM KCl, CaCl 2 0.33mM, 0.33mM MgSO 4 * 7H 2 O, pH 7.0) 1-hücreli aşamada embriyoların toplayın.
- Enjeksiyon slayt ve konumu, üst ve alt slaytlar arasında oluşan dik açı köşesinde embriyoların yaklaşık 30-60 embriyoların transferi. Embriyoların, yüzey gerilimi tarafından slayt düzenlenen E3 böylece en çıkarın.
- Bükülmüş bir diseksiyon pin hücre enjeksiyonu slayt duvara böylece embriyolar döndürmek için kullanın.
- Yumurta sarısı ve embriyo tek bir hücreye, embriyonun koryon üzerinden iğne kılavuzu mikromanipülatör kullanın. 0.5-1 nl DNA çözümü hücre içine enjekte edilir.
- 28.5 E3 ve inkübe Petri kapları içine embriyo transferine ° C Gerekirse, geliştirme, düşük sıcaklıkta embriyolar inkübe edilmesiyle önlenebilir.
4. Görüntüleme için Montaj embriyolar
- Embriyolar görüntüleme (amaçlar için yaklaşık 14-17 saat sonrası döllenme) için istenilen yaş ulaşmadan önce yaklaşık bir saat ince forseps ile embriyoların chorions çıkarın.
- Floresan ile donatılmış bir diseksiyon mikroskobu kullanılarak etiketli hücreler embriyo seçin. Biz uzun çalışma mesafesi ve yüksek büyütme kombinasyonu nedeniyle Nikon AZ100 kapsamı 4X objektif (40X büyütme) kullanın.
- Bir embriyo yaklaşık 50 ul E3% 0.2 Tricaine anestezi (10X konsantrasyonda) içeren bir mikrofuge'de tüp içine yerleştirin.
- Tricaine seyreltilmesi% 0.02 nihai konsantrasyonu 10 mM HEPES (42 ° C sıcaklıkta tutulan), 500 ul E3% 1 düşük erime noktası agaroz ekleyin.
- Hemen bir agaroz açılan embriyo transferigeniş bir delik cam pipet kullanarak görüntüleme slayt lamel.
- Agaroz sertleşir önce etiketli hücreleri ile bölgenin alt lamel (nöral krest hücreleri ve spinal duyusal nöronlar için aşağı dorsolateral sırt aşağı) karşı aşağı bakacak şekilde, embriyonun konumu.
- Görüntüleme odasının birleştirin: Coat bir tarafı plastik, metal görüntüleme slayt silikon vakum yağ ve yapıştırmayın ile bir halka (2 cm dış çapı 3 mm, yüksek). Gres yağıyla halka diğer tarafında ceket.
- E3 içeren 10 mM HEPES ve% 0.02 Tricaine odasının doldurun. Halka iyi yağlanmış yüzey 22 mm 2 lamel iliştirilmesi odasının üst Seal.
5. Olympus FV1000 konfokal IX81 mikroskobu ile hücre davranışlarının 4D görüntüleme
Görüntü elde detayları mikroskop sistemi özelliklerine bağlıdır. Burada Olympus FV1000 konfokal mikroskop için geçen zaman satın alma süreci tanımlamak. Zeiss LSM 510 konfokal sistemi 6 time-lapse edinimi için önceki vallahi protokol bakın.
- Mikroskop sahnede slayt sahibinin görüntüleme odasına yerleştirin ve iletilen ışık altında 10X veya 20X objektif kullanılarak embriyo odaklanmak.
- 60X objektif (1.2 veya daha yüksek NA) geçin ve Epifloresans ile etiketli hücre odaklanmak. Biz ya immersiyon yağı (UPLSAPO 60xO NA 1.35) ya da su altında kalacak (UPLSAPO 60xW NA 1.20) lens kullanabilirsiniz.
- FV yazılımı (Sür 1.7c), lazer tarama XY tekrar başlamak için tıklayın.
- Satın alma ayarları ve görüntü elde etme denetimleri (lazer çıkış, tarama hızı, HV, kazanç ve ofset seviyeleri) en az (% 25 veya daha düşük), doku hasarı önlemek ve photobleaching azaltmak için lazer güç tutarak sinyal optimize etmek için ayarlayın.
- Z-serisi elde etmek için, adım büyüklüğü ile birlikte, z yığının alt ve üst sınırları belirler. Derinlik simgesi XY Sweep simgesini XY ve Z vurgulanan o kadar meşgul olduğundan emin olun. XYZ Sweep simgesini tıklayarak satın alma başlayın.
- Hızlandırılmış bir zaman serisi elde etmek için, Toplama Ayarlar penceresinde TimeScan başlığı altında bir zaman aralığı ve zaman noktalarının sayısını ayarlamak. XY Sweep simgesini XY (Z) ve T vurgulanan böylece Image Acquisition Kontrol Pencerede Zaman Simgesi tıklayın. XY (Z) T Sweep simgesini tıklayarak satın alma başlayın.
- Alternatif olarak, TimeController bir zaman atlamalı kurmak için kullanılabilir. Büyük veri kümeleri oluştururken bellek ayırma aşmadığı Bu programlama, yararlı olur. Aygıt altında, TimeController pencere açın. Yeni bir görüntüleme Görev oluşturun. Görüntü parametre penceresi açılacaktır. Satın alma ayarlarını güncellemek için FV Durum düğmesini tıklatın. Emin olun Kaydet ve Sil sonlandırın başlığı altında kontrol edilir. Çıktı dosyası adı ayarlayın ve ayarları kaydetmek ve pencereyi kapatmak için Tamam'ı tıklatın. Loop fonksiyonu, zaman noktalarında istenen zaman aralığı ve sayı ayarlamak için kullanın. Hazır tıklayın ve satın alma işlemini başlatmak için Başlat. Duraklat ve Z-shift fonksiyonları ise görüntüleme yeniden odaklanabilmek için kullanılabilir.
6. Temsilcisi Sonuçlar
Rakamlar ve film örnekleri, membran hedefli fluorophores veya aktin biyosensör probu ile etiketlenmiş duyusal nöronlar ve nöral krest hücrelerinden tasvir.
Şekil 1 bir Tg (ngn1: GFP-caax) Konfokal görüntüleri (z-projeksiyonları): mCherry-caax DNA 25 pg ngn1 ile enjekte edilen transgenik embriyo. MCherry CAAX etiketler yeşil etiketli tüm Rohon Sakal duyusal nöronlar ile arka planda bir nöron kırmızı (A) (B) yeşil ve kırmızı kanalları C) Birleştirilmiş görüntü. Ölçek çubuğu = 50 mm.
Şekil 2 Konfokal z projeksiyonları ~ 20 pg ngn1 ile enjekte edilen embriyolar nöronların:. MCherry-UtrCH DNA A) 16,5 hpf embriyo Rohon Sakal duyusal nöron. F-aktin sinyal büyüme konisi (ok başları) ve yeni kurulan aksonlar boyunca çıkıntılar güçlü B) Nöron 20 hpf embriyonun büyüme konileri dallı periferik akson (ok başları) ve daha olgun merkezi zayıf sinyal güçlü F-aktin sinyali gösteren aksonlar (oklar). Ölçek çubuğu = 50 mm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
DNA enjekte optimum konsantrasyon organizatörü büyüklüğü ve gücü oluşturmak ve ampirik olarak tespit edilmelidir bağlı olarak değişecektir. Transgen ifade enjekte embriyo çok küçük bir oranı çok az neden olurken çok fazla DNA enjeksiyonu, geniş hücre ölümü ile sağlıksız embriyolar yol açabilir. DNA ekspresyon seviyesi hücreden hücreye değişir fluorofor sinyal gücü ile ilişkilidir. Epifloresans altında embriyolar sıralama iken, son derece yüksek seviyede ifade olanlar dahil değildir. Çok parlak görünür etiketli hücreler genellikle aynı zamanda, anormal hücre morfolojisi, etiketli molekülleri, mislocalization ve hücre ölümü gibi bariz işaretler, toksisite göstermektedir. Tipik bir DNA enjeksiyonu,% 5-10 görüntüleme için uygun embriyo elde edilir.
F-aktin biyosensör yüksek seviyelerde ifade edildiğinde, baskın bir negatif moda işlev görebilir. Organizatörü odaklı ifade sorunlu ise, biyosensör mRNA enjekte ederek yayg ifade edilebilir. MRNA enjeksiyon avantajı ekspresyon düzeyleri mRNA konsantrasyonu ayarlanması ile kontrol edilebilir. Bu embriyolar tek tek hücrelerin, hücre özel bir membran lokalize fluorofor organizatörü sürüş ifade içeren bir DNA ko-enjeksiyon etiketli. Biz bu yaklaşım, nöral krest hücrelerinden 7 F-aktin kullandık .
Biz genellikle transgenik ifade çizgileri tek hücreli etiketleme tekniği yürütmek. Örneğin, bir 3.1ngn1 enjekte: Tg embriyolara mcherry plazmid (-3.1ngn1: GFP) hattı, kırmızı, yeşil nöronların bir arka plan bireysel duyusal nöronlar etiket. Bu strateji, tüm hücre popülasyonunun kapsamında ayrı bir hücre davranışlarını inceleme sağlar.
Biz burada görüntüleme nöral ve nöral krest hücre davranışları ve aktin dağıtım odaklanır. Ancak, genel bir yöntem DNA plazmid enjeksiyon ile doku özgü mozaik hücre etiketleme floresan füzyon proteinleri gibi diğer genetik olarak kodlanmış biyosensör probları ile kullanmak için genişletilebilir. Bu tekniklerin birleştiren araştırmacılar, belirli moleküllerin hücre içi lokalizasyonu gibi in vivo sinyal mekanizmasını görselleştirmek için izin verebilirsiniz .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu çalışma NS042228 MCH Olympus FV1000 konfokal UW Zooloji Bölümü (PI Bill Bement) için bir NIH paylaşılan enstrümantasyon hibe S10RR023717 ile satın alındı R01 NIH tarafından desteklenmiştir.
Erica Andersen, Namrata Asuri ve Matthew Kil bu kağıt eşit katkıda bulunmuştur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | A5040-250G | |
| Sylgard Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 184 | |
| QIAfilter Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12243 | |
| Low melting point agarose | Invitrogen | 15517-014 | |
| Picospritzer | Parker Hannifin Corporation | 051-0302-900 |
References
- Burkel, B. M., von Dassow, G., Bement, W. M. Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin. Cell motility and the cytoskeleton. 64, 822-832 (2007).
- Blader, P., Plessy, C., Strahle, U. Multiple regulatory elements with spatially and temporally distinct activities control neurogenin1 expression in primary neurons of the zebrafish embryo. Mech Dev. 120, 211-218 (2003).
- Wada, N., Javidan, Y., Nelson, S., Carney, T. J., Kelsh, R. N., Schilling, T. F. Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull. Development. 132, 3977-3988 (2005).
- Cheo, D. L., Titus, S. A., Byrd, D. R., Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. Concerted assembly and cloning of multiple DNA segments using in vitro site-specific recombination: functional analysis of multi-segment expression clones. Genome Res. 14, 2111-2120 (2004).
- Kwan, K. M., Fujimoto, E., Grabher, C., Mangum, B. D., Hardy, M. E., Campbell, D. S., Parant, J. M., Yost, H. J., Kanki, J. P., Chien, C. B. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Dev Dyn. 236, 3088-3099 (2007).
- O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J Vis Exp. 24, (2009).
- Berndt, J. D., Clay, M. R., Langenberg, T., Halloran, M. C. Rho-kinase and myosin II affect dynamic neural crest cell behaviors during epithelial to mesenchymal transition in vivo. Dev Biol. 324, 236-244 (2008).
