細胞運動やゼブラフィッシュ胚における個々の神経細胞と神経堤細胞のアクチン細胞骨格のライブイメージング

Summary

このプロトコルは、ゼブラフィッシュ胚の生体内で個々の神経細胞や神経堤細胞のイメージングを説明します。このメソッドは、蛍光共焦点タイムラプス顕微鏡を使用して細胞の行動とアクチンの局在を調べるために使用されます。

Abstract

ゼブラフィッシュは 、in vivo での開発時に画像セルの動作に最適なモデルです。ゼブラフィッシュの胚は外部から受精と開発のすべての段階でこのように簡単にアクセスされています。また、それらの光学的透明度はそのまま胚の自然環境における細胞と分子動力学の高分解能イメージングが可能になります。我々は、神経堤細胞の移動と神経軸索の伸長やガイダンス中の細胞の挙動を分析するライブイメージングの手法を使用しています。

ライブイメージングは​​、細胞運動のプロセスを制御するメカニズムを理解するために特に便利です。このような突出活動や分子動力学などの細胞の運動性の詳細を、可視化するために、それは個々の細胞を標識することが有利である。ゼブラフィッシュでは、プラスミドDNAの注入は一時的なモザイクの発現パターンが得られますし、他の細胞標識法に比べて明確な利点を提供しています。例えば、トランスジェニック系統は、多くの場合、全体の細胞集団をラベル付けするため、単セルの微細な突起（または分子の分布の変化）の視覚化を不明瞭にすることがあります。さらに、1細胞期でのDNAの注入は低侵襲と後の段階で染料を注射よりも正確です。

ここでは、個々の開発神経細胞や神経堤細胞とイメージング、in vivoでその動作を標識する方法を説明します。私たちは、モザイクのトランスジーン発現の結果1細胞期胚、中にプラスミドDNAを注入する。ベクトルは、その感覚神経細胞や神経堤細胞のサブセットに関心のある遺伝子のドライブの発現を細胞特異的プロモーターが含まれています。我々は、膜標的GFP、またはセル^1を生体内でF -アクチンの可視化を可能にするバイオセンサープローブで標識された細胞の例を示します。

エリカアンデルセン、Namrata Asuri、そしてマシュークレイがこの作品にも同様に貢献した。

Protocol

1。注射のスライドとイメージングスライドの組み立て

インジェクションのスライド：

1. 製造元の指示に従ってSylgardのシリコーンエラストマーを準備します。
2. 長い端に並べて配置している他の二つのスライドの交差点、の上にあるスライドを積み重ねることによって一緒にスライドする債券三つの標準ガラスの顕微鏡にSylgardを使用してください。上のスライドは、直角の角または上部と下部のスライドの間に"壁"を作成します。
3. Sylgardが一夜設定してみましょう。これらのスライドは、再利用可能です。

イメージングのスライド：

1. チャンバーは顕微鏡のステージ上でスライドホルダーに合うように、我々は標準的なガラスの顕微鏡スライド（75ミリメートルX 25ミリメートルX 1ミリメートル）の同じ大きさにカットステンレス鋼の長方形を使用してください。 1.5cmの穴は長方形の中央にカットされます。
2. Sylgardと金属の長方形に貼付22ミリメートル²カバースリップ。徹底的にカバースリップをシールするだけで十分なSylgard使用。倒立顕微鏡上の画像に、胚は、このカバーに取り付けられ、底部から撮像されます。
3. Sylgardが一夜設定してみましょう。これらのスライドは、再利用可能と利用の間に70％エタノールで洗浄です。

2。 DNA構築物の調製

組織特異的に遺伝子を発現させるために、目的の遺伝子は、細胞特異的プロモーターの後ろにクローン化されます。我々はそれぞれ、感覚ニューロンまたは神経堤細胞での発現を駆動するためにゼブラフィッシュneurogenin1遺伝子（- ^3.1ngn1）2またはSOX10遺伝子（- ^4.9sox10）3のシス調節エレメントを使用してください。細胞と細胞膜ダイナミクスを可視化するために、我々は、細胞質または細胞膜に局在する蛍光物質を表現する。画像F -アクチンの分布に、我々は、mCherry（UtrCH - mCherry）と融合したユートロフィンのカルポニン相同ドメインをコードするDNAを発現する。 UtrCH - mCherryバイオセンサープローブは、アクチンダイナミクス¹に干渉することなく、F -アクチンの可視化が可能になります。我々は、組換えベースのクローニング戦略⁴とゼブラフィッシュTol2kit ⁵に設けベクトルインビトロジェンのゲートウェイを使用して、これらのDNAコンストラクトを生成します。

1. ゼブラフィッシュTol2kit ⁵からマルチサイト-ゲートウェイテクノロジーとベクトルを用いて発現ベクター（s）を生成する。プラスミドはpT2KXIGDinからTol2はバックボーンが含まれています。
2. QIAfilterプラスミドミディプレップキット（QIAGEN社）でプラスミドDNAを精製し、滅菌水で溶出する。 DNAは、注射のために線形化する必要はありません。

3。 DNA構築物の注入

1. 水の0.2％フェノールレッド（注入時の可視化のための）10〜50μg/ mlのDNAの最終濃度にDNAを希釈する。
2. 針を記入し、キャリブレーション：約1μlのDNA溶液を引っ張らキャピラリー針を埋戻し及び噴射装置（我々はPicospritzerを使用）のニードルホルダーに挿入します。微細な鉗子を使用して、先端の開口部の直径が約10mmとなるように針から先端を破る。接眼マイクロメータを持つ鉱物油の液滴の直径を測定する。約1 nlの量の液滴を得るために設定圧力の持続時間を調整します。
3. E3胚の培地（5mMの塩化ナトリウム、0.17mMのKCl、0.33mMのCaCl _2、0.33mMのMgSO ₄ · 7H ₂ O、pH7.0）に、1細胞期胚を収集する。
4. 上部と下部のスライドの間に形成された直角の角にある胚はインジェクションのスライドおよび位置する約30〜60胚を転送します。胚は、表面張力によってスライドして開かれるようにE3の大部分を取り除く。
5. 細胞は、注入のスライドの壁になるように、胚を回転させる曲がった解剖ピンを使用してください。
6. 卵黄を通じて、胚の単一のセルに、胚の絨毛膜を通して針を導くためにマイクロマニピュレーターを使用してください。セルに0.5から1 nlのDNA溶液を注入。
7. 28.5でE3とインキュベートのペトリ皿に胚を移す℃に必要に応じて、開発はより低い温度で胚をインキュベートすることによって遅くすることができます。

4。イメージング用取付胚

1. 胚は、イメージング（我々の目的のために約14〜17時間後に受精）の希望の年齢に達する前に、時間に関する細かいピンセットを用い、胚からchorionsを削除します。
2. 蛍光装備解剖顕微鏡を用いて標識細胞と胚を選択してください。我々は、理由長作動距離と高倍率のその組み合わせのニコンAZ100の範囲で4倍対物レンズ（40X倍率）を使用してください。
3. 約50μlのE3が0.2％Tricaine麻酔薬を（10X濃度）含有する微量遠心管に胚を置きます。
4. 0.02％の最終濃度にTricaineを希釈し、10mMのHEPES（42 ° Cで保管）、とのE3で500μlの1％低融点アガロースを追加。
5. 即時にアガロースドロップに胚を移す広口径のガラスピペットを用いてイメージングスライドのカバースリップ。
6. アガロースが固まる前に標識された細胞を持つ地域がボトムのカバースリップ（神経堤細胞と脊髄感覚ニューロンのためのダウン背用背ダウン）に対して下に向くように、胚を置きます。
7. 金属製のイメージングスライドへのシリコーンの真空グリースや貼付でコーティングプラスチックリング（2センチメートル外径、高さ3mm）の片側：イメージングチャンバーを組み立てます。グリースとリングの反対側のコート。
8. 10mMのHEPES、0.02％Tricaineを含むE3でチャンバーを埋める。リングの上部に油を塗った表面は22 MM ²カバーガラスを貼付することによりチャンバーの上部をシール。

5。 IX81顕微鏡とオリンパスFV1000共焦点上での細胞挙動の4Dイメージング

画像取得の詳細については、顕微鏡システムの仕様に依存します。ここでは、オリンパスFV1000共焦点顕微鏡のためのタイムラプス取得プロセスを説明します。ツァイスLSM 510共焦点システム⁶で時間経過の取得のための前のJoveのプロトコルを参照してください。

1. 顕微鏡のステージ上でスライドホルダーにイメージング室を置き、透過光下で10倍または20倍対物レンズを使用して、胚に焦点を当てる。
2. 60X目標（1.2以上のNA）に切り替え、落射蛍光で標識された細胞に焦点を当てる。我々は、どちら油浸（UPLSAPO 60xO NA 1.35）または水浸漬（UPLSAPO 60xW NA 1.20）レンズを使用してください。
3. FVソフトウェア（バージョン1.7c）で、レーザーのスキャンを開始するためにXYの繰り返しをクリックしてください。
4. 組織の損傷を防ぎ、退色を軽減するために最小（25％以下）でレーザパワーを維持しながら信号を最適化するための取得設定と画像取得のコントロール（レーザ出力、走査速度、HV、ゲイン、およびオフセットのレベル）を調整する。
5. Z -シリーズを取得するには、ステップサイズと一緒に、Z -スタックの上限と下限を設定します。奥行きアイコンがXYスイープアイコンがXYとZハイライト表示さ​​れているように従事されていることを確認します。 XYZのスイープのアイコンをクリックして、買収を開始します。
6. タイムラプスシリーズを取得するには、TimeScan取得の設定]ウィンドウで、見出しの下の時点の時間間隔と回数を設定します。 XYスイープのアイコンがXY（Z）とT強調表示になるように画像集録コントロールウィンドウでの時刻のアイコンをクリックします。 XY（Z）Tのスイープのアイコンをクリックして、買収を開始します。
7. また、TimeControllerはタイムラプスを設定するために使用することができます。大規模なデータセットを生成するときにそれがメモリの割り当てを超えていないとしてこのプログラミングでは、便利です。 [デバイス]の下で、TimeControllerウィンドウを開きます。新しいイメージングタスクを作成します。画像のパラメータウィンドウが開きます。買収の設定を更新するFV Status]ボタンをクリック。 makeは必ず保存して終了見出しの下にチェックされる削除。出力ファイル名を設定し、設定を保存し、ウィンドウを閉じます[OK]をクリックします。の時点の希望の時間間隔と回数を設定するには、ループ機能を使用してください。レディクリックして、取得を開始する起動します。一時停止およびZは、シフト機能をイメージングしながら再び集中するために使用することができます。

6。代表的な結果

フィギュアや映画は感覚神経や膜をターゲットとした蛍光体やアクチンバイオセンサープローブで標識された神経堤細胞の例を表しています。

図1 TG（ngn1：GFP - CAAX）の共焦点画像（Z -突起）。：mCherry - CAAXの DNA 25とPG ngn1を注入されたトランスジェニック胚。 mCherry - CAAXラベルラベルの付いたすべてのRohon -ビアード感覚ニューロンと背景の1つのニューロン赤（A）グリーン（B）。緑と赤の両方のチャネルのC）マージされた画像。スケールバー= 50μmの。

図2共焦点z軸の突起〜20 pgのngn1を注入胚の神経細胞の：。。mCherry - UtrCHの DNA 16.5 HPFの胚で）Rohon -ビアード感覚ニューロン。 F -アクチンのシグナルは成長円錐（矢印）で、新しく形成された軸索に沿って突起に強いです。B）20 HPFの胚のニューロンは、分岐した末梢軸索（矢印）と、より成熟した中枢の弱い信号の成長円錐での強力なF -アクチンのシグナルを示す軸索（矢印）。スケールバー= 50μmの。

Discussion

注入されたDNAの最適濃度は、構築と経験的に決定されるべきであるプロモーターの大きさと強さによって異なります。あまりにも多くのDNAの注入が少なすぎる遺伝子を発現注入胚の非常に小さな割合につながる一方、大規模な細胞死と不健康な胚につながることができます。 DNAの発現レベルは細胞から細胞へ変化する蛍光物質のシグナルの強さと相関する。落射蛍光下で胚をソートしながら、表現の非常に高いレベルのものを除外。非常に明るく見える標識された細胞は、通常、またそのような異常な細胞の形態、タグ付けされた分子のmislocalization、および細胞死などの毒性の明らかな兆候を、示す。典型的なDNAの注入は、イメージングに適した胚の5-10％が得られます。

高いレベルで発現したとき、F -アクチンのバイオセンサーは、ドミナントネガティブな方法で機能することができます。プロモーター主導の表現が問題になる場合、バイオセンサーは、mRNAを注入することにより、遍在的に発現することができます。 mRNAの注入の利点は、発現レベルは、mRNAの濃度を調整することによって制御できることです。これらの胚の個々の細胞は細胞膜に局在する蛍光体の細胞特異的プロモーター駆動式を含むDNA構築物の同時注入によって標識されています。我々は、神経堤細胞⁷で画像のF -アクチンへのこのアプローチを使用している。

私たちはしばしば、トランスジェニック発現株では、単一細胞標識法を行う。例えば、- 3.1ngn1を注入：Tgの胚にmcherryはプラスミド（- 3.1ngn1：GFP）のラインが緑のニューロンの背景に赤色の個々の感覚神経をラベルする。この戦略は、全体の細胞集団のコンテキスト内で個々の細胞の挙動の検討が可能になります。

我々は、イメージング神経と神経堤細胞の挙動とアクチンの分布に焦点を絞ります。しかし、DNAプラスミドの注入による組織特異的モザイクの細胞標識の一般的な方法は、蛍光融合タンパク質だけでなく、他の遺伝的に符号化されたバイオセンサープローブで使用するために拡張することができます。これらのテクニックを組み合わせることで、研究者は特定の分子の細胞内局在性だけでなく、in vivoでのシグナル伝達機構を視覚化できるようにすることができます。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)	Sigma-Aldrich	A5040-250G
Sylgard Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	184
QIAfilter Plasmid Midi Kit	Qiagen	12243
Low melting point agarose	Invitrogen	15517-014
Picospritzer	Parker Hannifin Corporation	051-0302-900