Summary
Questo protocollo descrive l'imaging di singoli neuroni o cellule della cresta neurale nel vivere embrioni di zebrafish. Questo metodo è utilizzato per esaminare i comportamenti e la localizzazione cellulare di actina mediante fluorescenza confocale microscopia time-lapse.
Abstract
Il pesce zebra è un modello ideale per i comportamenti delle cellule durante lo sviluppo di imaging in vivo. Embrioni di zebrafish sono fecondati esternamente e quindi facilmente accessibile in tutte le fasi di sviluppo. Inoltre, la loro chiarezza ottica permette l'imaging ad alta risoluzione del cellulare e dinamica molecolare in ambiente naturale dell'embrione intatto. Stiamo utilizzando un approccio dal vivo imaging per analizzare i comportamenti delle cellule durante la migrazione delle cellule neurali cresta e la conseguenza e la guida degli assoni neuronali.
Immagini dal vivo è particolarmente utile per comprendere i meccanismi che regolano i processi di motilità cellulare. Per visualizzare i dettagli della motilità cellulare, come l'attività protrusiva e dinamica molecolare, è vantaggioso per etichettare le singole celle. In zebrafish, iniezione di DNA plasmidico produce un transitorio pattern di espressione del mosaico e offre vantaggi distinti rispetto ad altri metodi di etichettatura delle cellule. Per esempio, linee transgeniche spesso etichetta popolazioni di cellule intere, e quindi possono oscurare la visualizzazione delle sporgenze fine (o cambiamenti nella distribuzione molecolare) in una singola cella. Inoltre, l'iniezione di DNA alla cellula uno stadio è meno invasiva e più precisa di iniezioni di colorante nelle fasi successive.
Qui si descrive un metodo per l'etichettatura di singoli neuroni di sviluppo o cellule della cresta neurale e di imaging il loro comportamento in vivo. Iniettiamo DNA plasmidico in 1 cellula-embrioni fase, che si traduce in espressione del transgene mosaico. I vettori contengono cellule specifiche per i promotori che l'espressione dell'unità di un gene di interesse in un sottogruppo di neuroni sensoriali o cellule della cresta neurale. Forniamo esempi di cellule marcate con GFP membrana mirati o con una sonda biosensore che consente la visualizzazione di F-actina in cellule viventi 1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, e Matteo Argilla contribuito in maniera uguale a questo lavoro.
Protocol
1. Montaggio di diapositive di iniezione e diapositive di immagini
Iniezione di diapositive:
- Preparare elastomero di silicone Sylgard secondo le istruzioni del produttore.
- Utilizzare il Sylgard a legare tre microscopio vetro standard diapositive insieme da impilare una diapositiva in cima alla intersezione degli altri due diapositive, che sono disposti fianco a fianco ai bordi lunghi. La slitta superiore crea un angolo retto o "muro" tra la parte superiore e scivoli in basso.
- Lasciate Sylgard set durante la notte. Queste diapositive sono riutilizzabili.
Imaging diapositiva:
- Noi utilizziamo i rettangoli in acciaio inox tagliato le stesse dimensioni di un vetrino da microscopio standard di vetro (75mm x 25mm x 1mm), così la camera si inserisce il supporto diapositive sul palco microscopio. Un foro di 1,5 cm è tagliato al centro del rettangolo.
- Fissare a 22 mm 2 coprioggetto al rettangolo di metallo con Sylgard. Usa basta Sylgard per sigillare completamente il coprioggetto. Per l'immagine su un microscopio invertito, gli embrioni verranno montati su questo coprioggetto e ripreso dal basso.
- Lasciate Sylgard set durante la notte. Queste diapositive sono riutilizzabili e puliti con etanolo al 70% tra usi.
2. Preparazione di costrutti di DNA
Per esprimere un transgene in maniera tessuto-specifici, il gene di interesse viene clonato dietro una cellula-specifico promotore. Usiamo un elemento cis-regolamentazione del gene pesce zebra neurogenin1 (-3.1ngn1) 2 o il SOX10 gene (-4.9sox10) 3 a guidare l'espressione nei neuroni sensoriali o cellule della cresta neurale, rispettivamente. Per visualizzare la dinamica della membrana cellulare e, esprimiamo citoplasmatica o di membrana localizzate fluorofori. A immagine di F-actina distribuzione, esprimiamo il DNA che codifica per il dominio di omologia calponina utrophin fusa mCherry (UtrCH-mCherry). Il UtrCH-mCherry sonda biosensore consente la visualizzazione di F-actina, senza interferire con l'actina dinamiche 1. Noi generare questi costrutti del DNA utilizzando la Gateway Invitrogen ricombinazione strategia clonazione 4 e vettori forniti nel Tol2kit zebrafish 5.
- Genera vettore di espressione (s) utilizzando Multisite-Gateway Tecnologia e vettori da Tol2kit zebrafish 5. Plasmidi contengono la spina dorsale Tol2 da pT2KXIGDin.
- Purificare DNA plasmidico con plasmidi QIAfilter Midi Prep Kit (Qiagen Inc.) ed eluire in acqua sterile. DNA non ha bisogno di essere linearizzata per l'iniezione.
3. Iniezione di costrutti di DNA
- Diluire il DNA ad una concentrazione finale di 10-50 mg / ml di DNA in rosso fenolo 0,2% (per la visualizzazione durante l'iniezione) in acqua.
- Compilare e calibrare ago: Back-riempiono un ago tirato capillare con circa 1 soluzione di DNA microlitri e inserirla nel supporto ago della apparati di iniezione (usiamo un Picospritzer). Usando una pinza sottile, rompere la punta fuori l'ago in modo che l'apertura punta è di circa 10 mm di diametro. Misurare il diametro della goccia in olio minerale con un micrometro oculare. Regolare la durata regolazione della pressione per ottenere una goccia di circa 1 volume nl.
- Raccogliere 1-cellula embrioni in fase embrionale medio E3 (5mm NaCl, KCl 0,17 mm, 0,33 mm di CaCl 2, 0,33 mm di MgSO 4 * 7H 2 O, pH 7,0).
- Trasferire circa 30-60 embrioni alla diapositiva di iniezione e la posizione degli embrioni in un angolo ad angolo retto formano tra la parte superiore e scivoli in basso. Eliminare la maggior parte E3 in modo che gli embrioni sono tenuti alla diapositiva dalla tensione superficiale.
- Utilizzare un perno piegato dissezione di ruotare gli embrioni in modo che il cellulare è contro il muro della diapositiva iniezione.
- Utilizzare un micromanipolatore per guidare l'ago attraverso il corion embrionale, attraverso il tuorlo e nella cella singola dell'embrione. Iniettare 0,5-1 nl soluzione di DNA all'interno della cellula.
- Trasferire gli embrioni in piastre di Petri in E3 e incubare a 28.5 ° C. Se necessario, lo sviluppo può essere rallentato da incubando gli embrioni a bassa temperatura.
4. Embrioni di montaggio per l'imaging
- Rimuovere il chorions dagli embrioni con una pinza sottile circa un'ora prima di embrioni raggiungono l'età desiderata per l'imaging (circa 14-17 ore dopo la fecondazione per i nostri scopi).
- Selezionare gli embrioni con cellule marcate utilizzando un microscopio da dissezione dotato di fluorescenza. Noi utilizziamo un obiettivo 4x (ingrandimento 40X) su una portata Nikon AZ100 grazie alla sua combinazione di lunga distanza di lavoro e ad alto ingrandimento.
- Inserire un embrione in una provetta per microcentrifuga con circa 50 microlitri E3 contenente 0,2% Tricaine anestetico (concentrazione 10X).
- Aggiungere 500 microlitri 1% agarosio a basso punto di fusione nella E3 con 10 mM HEPES (mantenuta a 42 ° C), diluendo il Tricaine ad una concentrazione finale di 0,02%.
- Trasferire immediatamente l'embrione in una goccia di agarosio alcoprioggetto della diapositiva immagini utilizzando una pipetta di vetro ampio foro.
- Prima della agarosio indurisce, la posizione l'embrione così la regione con le cellule marcato è rivolto verso il basso contro il coprioggetto fondo (verso il basso dorsale per le cellule della cresta neurale e dorsolaterale giù per spinale i neuroni sensoriali).
- Assemblare camera di imaging: Coat un lato di un anello di plastica (2 cm di diametro esterno, 3 mm di altezza) con grasso al silicone vuoto e apporre la diapositiva di imaging in metallo. Cappotto l'altro lato del ring con grasso.
- Riempire la camera con E3 HEPES contenente 10 mM e 0,02% Tricaine. Chiudere la parte superiore della camera apponendo a mm 22 2 coprioggetto alla superficie superiore unta dell'anello.
5. Imaging 4D di comportamenti cella Olympus IX81 FV1000 con microscopio confocale
I dettagli della acquisizione delle immagini dipende dalle specifiche del sistema microscopio. Qui si descrive il time-lapse processo di acquisizione per il microscopio confocale FV1000 Olympus. Vedi precedente protocollo di Giove per time-lapse acquisizione con la Zeiss LSM 510 sistema confocale 6.
- Posizionare la camera di imaging nel supporto diapositive sul palco microscopio e mettere a fuoco l'embrione utilizzando un obiettivo 10X o 20X con luce trasmessa.
- Passare a un obiettivo 60X (NA di 1,2 o superiore) e concentrarsi sulla cella etichettata con epifluorescenza. Noi utilizzare un olio di immersione (UPLSAPO 60xO NA 1,35) o immersione in acqua (UPLSAPO 60xW NA 1,20) lente.
- Nel software FV (Ver. 1.7c), fare clic su XY ripetere per avviare la scansione laser.
- Regolare le impostazioni di acquisizione e controllo di acquisizione delle immagini (uscita laser, velocità di scansione, HV, guadagno, e livelli di offset) per ottimizzare il segnale mantenendo potenza del laser al minimo (25% o inferiore) per evitare danni ai tessuti e ridurre photobleaching.
- Di acquisire una serie Z, impostare i limiti superiore e inferiore della Z-Stack, insieme a passo. Assicurarsi che l'icona della profondità è impegnato in modo che l'icona Sweep XY XY e Z ha evidenziato. Avviare l'acquisizione facendo clic sull'icona Sweep XYZ.
- Di acquisire una serie di time-lapse, impostare l'intervallo di tempo e numero di punti di tempo sotto la voce TimeScan nella finestra delle impostazioni di acquisizione. Clicca l'icona Ora nella finestra di controllo Image Acquisition modo che l'icona Sweep XY ha XY (Z) e T evidenziato. Avviare l'acquisizione cliccando il (Z) XY icona Sweep T.
- In alternativa, il TimeController può essere usata per impostare un time-lapse. Questa programmazione è utile quando si generano grandi insiemi di dati, in quanto non supera l'allocazione di memoria. In dispositivo, aprire la finestra TimeController. Creare un nuovo Task Imaging. La finestra dei parametri immagine si aprirà. Fare clic sul pulsante Stato FV per aggiornare le impostazioni di acquisizione. Assicurarsi Salva ed Elimina sono controllati sotto la voce Termina. Impostare il nome del file di output e fare clic su OK per salvare le impostazioni e chiudere la finestra. Utilizzare la funzione Loop per impostare l'intervallo di tempo desiderato e il numero di punti di tempo. Clicca Ready e Start per iniziare l'acquisizione. La pausa e Z-shift funzioni possono essere utilizzate per riorientare mentre imaging.
6. Rappresentante Risultati
Le figure ed i film rappresentano esempi di neuroni sensoriali e cellule della cresta neurale etichettati con membrana mirati fluorofori o la sonda biosensore actina.
Figura 1 immagini confocale (z-proiezioni) di un Tg (ngn1: GFP-CAAX). Embrione transgenico iniettato con 25 pg ngn1: mCherry-CAAX DNA. Il mCherry-CAAX etichette un neurone rosso (A) in uno sfondo con tutte le ROHON-Beard neuroni sensoriali etichettati verde (B). C) immagine a video dei canali sia verde e rosso. Barra di scala = 50 micron.
Figura 2 confocale z-proiezioni di neuroni negli embrioni iniettati con ~ 20 pg ngn1:.. MCherry-UtrCH DNA A) ROHON-Beard neuroni sensoriali in 16,5 embrione HPF. F-actina segnale è forte in coni di crescita (punte di freccia) e sporgenze lungo gli assoni di recente formazione. B) Neuron in 20 embrione hpf mostrando forti segnali di F-actina in coni di crescita di ramificati assoni periferici (punte di freccia) e più debole segnale di centrale più matura assoni (frecce). Barra di scala = 50 micron.
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Discussion
La concentrazione ottimale di DNA iniettato può variare a seconda delle dimensioni e la forza del promotore costruire e devono essere determinati empiricamente. L'iniezione di DNA troppo può portare a embrioni non sani con la morte delle cellule esteso, mentre troppo poco si tradurrà in una piccola percentuale di embrioni iniettati esprimere il transgene. Il livello di espressione del DNA è correlata con la potenza del segnale fluoroforo, che varia da cellula a cellula. Mentre l'ordinamento degli embrioni sotto epifluorescenza, escludere quelli con livelli estremamente alti di espressione. Cellule marcate che appaiono molto luminose di solito mostrano anche segni evidenti di tossicità, come la morfologia anormale delle cellule, delle molecole mislocalization tag, e la morte cellulare. Una iniezione di DNA tipico rese il 5-10% degli embrioni che sono adatti per l'imaging.
L'F-actina biosensore in grado di funzionare in maniera dominante negativo quando espressa ad alti livelli. Se il promotore-driven espressione è problematico, il biosensore può essere espressa ubiquitariamente iniettando mRNA. Il vantaggio di iniezione di mRNA è che i livelli di espressione può essere controllata regolando la concentrazione di mRNA. Singole cellule in questi embrioni vengono etichettati da co-iniezione di costruire un DNA che contiene una cellula specifica espressione di guida promotore di una membrana fluoroforo-localizzata. Abbiamo usato questo metodo per l'immagine di F-actina in cellule della cresta neurale 7.
Noi spesso effettuare la cella singola tecnica di etichettatura a rughe d'espressione transgenica. Per esempio, l'iniezione di un-3.1ngn1: mcherry plasmide in embrioni del Tg (-3.1ngn1: GFP) linea singola etichetta neuroni sensoriali rosso in uno sfondo di neuroni verde. Questa strategia permette di esaminare il comportamento di una singola cella nel contesto della popolazione intera cella.
Ci concentriamo qui sulle immagini neurali e dei comportamenti delle cellule neurali cresta e distribuzione di actina. Tuttavia, il metodo generale di etichettatura mosaico specifici delle cellule dei tessuti mediante iniezione di DNA plasmidico può essere ampliato per essere utilizzato con proteine di fusione fluorescenti così come altre sonde geneticamente codificate biosensore. La combinazione di queste tecniche può permettere agli investigatori di visualizzare la localizzazione subcellulare di molecole specifiche, nonché meccanismi di segnalazione in vivo.
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Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da NIH R01 NS042228 di MCH I FV1000 Olympus confocale è stata acquisita con una strumentazione NIH condiviso S10RR023717 concedere al Dipartimento di Zoologia UW (PI Bement Bill).
Erica Andersen, Namrata Asuri, e Matteo Argilla contribuito in maniera uguale a questo articolo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | A5040-250G | |
| Sylgard Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 184 | |
| QIAfilter Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12243 | |
| Low melting point agarose | Invitrogen | 15517-014 | |
| Picospritzer | Parker Hannifin Corporation | 051-0302-900 |
References
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