Summary
Dit protocol beschrijft beeldvorming van individuele neuronen of neurale cellen in levende zebravis embryo's. Deze methode wordt gebruikt om cellulaire gedrag en actine lokalisatie met behulp van fluorescentie confocal time-lapse microscopie bestuderen.
Abstract
De zebravis is een ideaal model voor beeldvorming cel gedrag tijdens de ontwikkeling in vivo. Zebravis embryo's worden extern bevrucht en dus gemakkelijk te bereiken in alle stadia van ontwikkeling. Bovendien, hun optische helderheid maakt hoge resolutie imaging van cel-en moleculaire dynamica in de natuurlijke omgeving van de intacte embryo. We maken gebruik van een live-imaging benadering naar cel gedrag te analyseren tijdens de neurale lijst cel migratie en de uitgroei en begeleiding van neuronale axonen.
Live-imaging is vooral nuttig voor het begrijpen van mechanismen die celmotiliteit processen te reguleren. Te visualiseren details van celbeweeglijkheid, zoals stuwend activiteit en moleculaire dynamica, is het voordelig om individuele cellen label. In de zebravis, plasmide DNA injectie levert een voorbijgaande mozaïek expressiepatroon en biedt duidelijke voordelen ten opzichte van andere cel etikettering methoden. Bijvoorbeeld, transgene lijnen vaak label hele cel populaties en kan dus visualisatie van de boete uitsteeksels (of veranderingen in de moleculaire distributie) in een enkele cel onduidelijk. Daarnaast, injectie van DNA in de een-cellig stadium is minder invasief en preciezer dan kleurstof injecties in latere stadia.
Hier beschrijven we een methode voor het labelen van de individuele ontwikkeling van neuronen of neurale cellen en imaging hun gedrag in vivo. We injecteren plasmide DNA in een-cellig stadium embryo's, wat resulteert in mozaïek transgenexpressie. De vectoren bevatten cel-specifieke promotors die rijden expressie van een gen van interesse in een subset van de sensorische neuronen of neurale lijst cellen. Wij bieden voorbeelden van cellen gelabeld met membraan gerichte GFP of met een biosensor sonde die visualisatie van F-actine laat in levende cellen 1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, en Matthew Clay droegen ook voor dit werk.
Protocol
1. Montage van injectie dia's en dia's imaging
Injectie dia's:
- Bereid Sylgard siliconenelastomeer volgens de instructies van de fabrikant.
- Gebruik de Sylgard voor het verlijmen van drie standaard glazen microscoopglaasjes bij elkaar door het stapelen de ene dia op de top van het kruispunt van de andere twee dia's, die side-by-side zijn gerangschikt op de lange zijden. De bovenste dia maakt een haakse hoek of 'muur' tussen de boven-en onderkant dia's.
- Laat Sylgard 's nachts in te stellen. Deze dia's zijn herbruikbaar.
Imaging slide:
- We maken gebruik van roestvrij staal, rechthoeken gesneden dezelfde grootte van een standaard glas microscoopglaasje (75mm x 25mm x 1 mm), zodat de kamer past de diahouder op de microscoop podium. Een 1,5 cm gat wordt gesneden in het midden van de rechthoek.
- Aanbrengen van een 22 mm 2 dekglaasje aan de metalen rechthoek met Sylgard. Gebruik net genoeg Sylgard grondig te verzegelen het dekglaasje. Om beeld op een omgekeerde microscoop, zal embryo's worden gemonteerd op deze dekglaasje en afgebeeld van de bodem.
- Laat Sylgard 's nachts in te stellen. Deze dia's zijn herbruikbaar en gereinigd met 70% ethanol tussen toepassingen.
2. Voorbereiding van DNA-constructen
Om uitdrukking te geven een transgen in een weefsel-specifieke wijze, is het gen van belang gekloond achter een cel-specifieke promoter. We maken gebruik van een cis-regulerende element van de zebravis neurogenin1 gen (-3.1ngn1) 2 of de sox10 gen (-4.9sox10) 3 tot expressie rijden in sensorische neuronen of neurale cellen, respectievelijk. Te visualiseren cel en membraan dynamiek, drukken we cytoplasmatische of membraan-gelokaliseerde fluoroforen. Om de afbeelding F-actine distributie, drukken we DNA dat codeert voor het calponin homologie domein van utrofine gefuseerd aan mCherry (UtrCH-mCherry). De UtrCH-mCherry biosensor sonde maakt visualisatie van de F-actine zonder zich te bemoeien met actine dynamiek 1. We genereren deze DNA-constructen met behulp van de Invitrogen Gateway recombinatie gebaseerde klonen strategie 4 en vectoren die in de zebravis Tol2kit 5.
- Genereer expressievector (s) met behulp van meerdere locaties-Gateway Technologie en vectoren van de zebravis Tol2kit 5. Plasmiden bevatten de Tol2 ruggengraat van pT2KXIGDin.
- Zuiver plasmide DNA met QIAfilter Plasmide Midi Prep (Qiagen Inc) en elueren in steriel water. DNA hoeft niet te worden gelineariseerd voor injectie.
3. Injectie van DNA-constructen
- Verdun het DNA tot een eindconcentratie van 10-50 ug / ml DNA in 0,2% fenol rood (voor visualisatie tijdens de injectie) in water.
- Vullen en te kalibreren naald: een getrokken capillaire naald Back-vullen met ongeveer 1 ui DNA-oplossing en plaats deze in de naaldhouder van de injectie apparaat (we gebruiken een Picospritzer). Met een fijne tang, breek de tip van de naald zodanig dat de tip opening is ongeveer 10 mm in diameter. Meet de diameter van de druppel in minerale olie met een oculair micrometer. Pas onder druk duur instelling om een druppel van ongeveer 1 nl volume te krijgen.
- Verzamel een-cellig stadium embryo's in de E3 embryo medium (5mm NaCl, 0.17mM KCl, 0,33 mm CaCl2, 0,33 mm MgSO 4 * 7H 2 O, pH 7,0).
- Transfer ongeveer 30-60 embryo's op de injectie schuiven en de positie van de embryo's in de juiste hoek hoek gevormd tussen de boven-en onderkant dia's. Verwijder het merendeel van de E3, zodat de embryo's worden gehouden op het glaasje door de oppervlaktespanning.
- Gebruik een gebogen pin ontleden om embryo's te draaien, zodat de cel wordt tegen de wand van de injectie dia.
- Gebruik een micromanipulator om de naald te begeleiden bij de embryo chorion, door middel van de dooier en in de cel van het embryo. Injecteer 0,5-1 nl DNA-oplossing in de cel.
- Breng de embryo's in petrischalen in E3 en incubeer bij 28,5 ° C. Indien nodig, kan de ontwikkeling worden vertraagd door incuberen embryo's bij lagere temperatuur.
4. Montage van embryo's voor imaging
- Haal de chorions uit de embryo's met mooie tang ongeveer een uur voordat embryo's bereiken van de gewenste leeftijd voor imaging (ongeveer 14-17 uur na de bevruchting voor onze doeleinden).
- Selecteer de embryo's met gelabelde cellen met behulp van een dissectiemicroscoop uitgerust met een fluorescentie. We maken gebruik van een 4X doelstelling (40x vergroting) op een Nikon AZ100 bereik vanwege de combinatie van een lange werkafstand en een hoge vergroting.
- Plaats een embryo in een microfugebuis met ongeveer 50 ul E3 met 0,2% tricaïne verdoving (10X concentratie).
- Voeg 500 ul van 1% een laag smeltpunt agarose in E3 met 10 mM HEPES (bewaard bij 42 ° C), verdunning van de tricaïne tot een uiteindelijke concentratie van 0,02%.
- Onmiddellijk overdracht van de embryo in een agarose dalen tot dedekglaasje van de beeldvorming glijbaan met een brede boring glazen pipet.
- Voordat de agarose verhardt, de positie van de embryo, zodat de regio met gelabelde cellen naar beneden tegen de onderkant dekglaasje (dorsale die voor neurale cellen en dorsolaterale naar beneden voor spinale sensorische neuronen).
- Monteer de beeldvorming kamer: Coat de ene kant van een plastic ring (2 cm buitendiameter, 3 mm hoog) met siliconen vacuüm vet en brengt op de metalen beeldvorming dia. Smeer de andere kant van de ring met vet.
- Vul de kamer met de E3 die 10 mM HEPES en 0,02% tricaïne. Dicht de kamer boven door het aanbrengen van een 22 mm 2 dekglaasje naar de top ingevette oppervlak van de ring.
5. 4D beeldvorming van de cel gedrag op de Olympus FV1000 confocale microscoop met IX81
De details van het beeld overname zal afhangen van de details van uw microscoop systeem. Hier beschrijven we de time-lapse acquisitie proces voor de Olympus FV1000 confocale microscoop. Zie vorige Jove protocol voor time-lapse overname met de Zeiss LSM 510 confocale systeem 6.
- Plaats de beeldvorming kamer in de dia houder op de microscoop podium en concentreer je op het embryo met behulp van een 10X of 20X doelstelling van doorvallend licht.
- Schakel over naar een 60X objectief (NA van 1,2 of hoger) en de focus op het label cel epifluorescentie. We maken gebruik van zowel een olie-immersie (UPLSAPO 60xO NA 1,35) of onderdompeling in water (UPLSAPO 60xW NA 1,20) lens.
- In de FV-software (Ver 1.7c), klikt u op XY herhalen om laser scanning beginnen.
- Pas de overname instellingen en beeldacquisitie controles (laser output, scansnelheid, HV, gain en offset niveaus) om signaal te optimaliseren terwijl laser vermogen op een minimum (25% of lager) om beschadiging van het weefsel te voorkomen en fotobleking te verminderen.
- Tot verwerving van een Z-serie, stelt u de boven-en ondergrens van de z-stack, samen met stapgrootte. Zorg ervoor dat de diepte icoon is zo betrokken dat de XY Sweep icoon XY-en Z-gemarkeerd is. Start overname door te klikken op het XYZ Sweep icoon.
- Tot verwerving van een time-lapse-serie, stel het tijdsinterval en het aantal tijdstippen onder de TimeScan rubriek van de Overname venster Instellingen. Klik op het Time-pictogram in de Image Acquisition Control venster, zodat de XY Sweep icoon XY (Z) en T gemarkeerd heeft. Start overname door te klikken op de XY (Z) T Sweep icoon.
- Als alternatief kan de TimeController worden gebruikt voor het opzetten van een time-lapse. Deze programmering is handig bij het genereren van grote datasets, omdat het niet meer dan het toewijzen van geheugen. Onder apparaat, opent TimeController raam. Maak een nieuwe Imaging taak. Het beeld parameter venster wordt geopend. Klik op de FV Status knop om de overname te werken. Zorg ervoor dat Opslaan en Verwijderen worden gecontroleerd onder de rubriek beëindigen. Stel output bestandsnaam en klik op OK om instellingen op te slaan en het venster te sluiten. Gebruik maken van de Loop-functie om de gewenste tijd interval en het aantal tijdstippen in te stellen. Klik op Klaar en op Start om acquisitie te beginnen. De Pauze en Z-shift-functies kunnen worden gebruikt om tijdens beeldvorming heroriënteren.
6. Representatieve resultaten
De cijfers en filmpjes tonen voorbeelden van sensorische neuronen en neurale crest cellen gelabeld met membraan-gerichte fluoroforen of de actine biosensor sonde.
Figuur 1 confocale beelden (z-projecties) van een Tg (ngn1: GFP-caax). Transgene embryo geïnjecteerd met 25 pg ngn1: mCherry-caax DNA. De mCherry-CAAX labels een neuron rood (A) in een achtergrond met alle ROHON-Beard gelabeld sensorische neuronen groen (B). C) samengevoegde afbeelding van zowel de groene en rode kanalen. Schaalbalk = 50 pm.
Figuur 2 Confocale z-projecties van neuronen in embryo geïnjecteerd met ~ 20 pg ngn1:.. MCherry-UtrCH DNA A) ROHON-Beard sensorische neuron in 16,5 hpf embryo. F-actine-signaal is sterk in groei kegels (pijlpunten) en in de uitsteeksels langs de nieuw gevormde axonen. B) Neuron in 20 HPF embryo sterk F-actine-signaal laten zien in de groei kegels van vertakte perifere axon (pijlpunten) en zwakker het signaal in de meer volwassen centrale axonen (pijlen). Schaalbalk = 50 pm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De optimale concentratie van geïnjecteerde DNA zal variëren afhankelijk van de grootte en de sterkte van de promotor en de bouw moet empirisch vastgesteld worden. Injectie van te veel DNA kan leiden tot ongezonde embryo's met uitgebreide celdood, terwijl er te weinig zal resulteren in een zeer klein deel van de geïnjecteerde embryo's de uiting van de transgen. De DNA-expressie correleert met de sterkte van het fluorofoor-signaal, dat varieert van cel naar cel. Terwijl het sorteren van embryo's onder epifluorescentie, uit te sluiten die met extreem hoge niveaus van expressie. Gelabelde cellen die verschijnen zeer heldere meestal ook vertonen duidelijke tekenen van toxiciteit, zoals abnormale cel morfologie, mislocalization van gelabelde moleculen, en celdood. Een typische DNA-injectie geeft 5-10% van de embryo's die geschikt zijn voor beeldvorming.
De F-actine biosensor kan functioneren in een dominant negatieve manier uitgedrukt op een hoog niveau. Als promotor-driven expressie is problematisch, kan de biosensor rode draad uitgedrukt door het injecteren van mRNA. Het voordeel van mRNA injectie is dat de expressie niveaus kunnen worden gecontroleerd door het aanpassen van de concentratie van mRNA. Individuele cellen in deze embryo's worden gelabeld door co-injectie van een DNA-construct met een cel-specifieke promoter rijden expressie van een membraan-gelokaliseerde fluorofoor. We hebben gebruik gemaakt van deze aanpak om de afbeelding F-actine in neurale lijst cellen 7.
We vaak het uitvoeren van de single-cell labeling techniek in transgene expressie lijnen. Bijvoorbeeld, het injecteren van een-3.1ngn1: mCherry plasmide in embryo's van Tg (-3.1ngn1: GFP) lijn zal label individuele sensorische neuronen rood in een achtergrond van groene neuronen. Deze strategie maakt het onderzoek van het gedrag van een individuele cel in de context van de hele cel bevolking.
Wij richten ons hier op beeldvorming neurale en de neurale lijst cel gedrag en actine distributie. Echter, de algemene methode van weefsel-specifieke mozaïek cellen etikettering door DNA-plasmide injectie worden uitgebreid voor gebruik met fluorescerende fusie-eiwitten en andere genetisch gecodeerd biosensor sondes. De combinatie van deze technieken kunnen laten onderzoekers subcellulaire lokalisatie van specifieke moleculen evenals signalisatie-mechanismen in vivo te visualiseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door NIH R01 NS042228 naar MCH De Olympus FV1000 confocale werd verworven met een gezamenlijke NIH instrumentatie te verlenen S10RR023717 aan de UW Zoölogie Department (PI Bill Bement).
Erica Andersen, Namrata Asuri, en Matthew Clay droegen ook aan deze krant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | A5040-250G | |
| Sylgard Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 184 | |
| QIAfilter Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12243 | |
| Low melting point agarose | Invitrogen | 15517-014 | |
| Picospritzer | Parker Hannifin Corporation | 051-0302-900 |
References
- Burkel, B. M., von Dassow, G., Bement, W. M. Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin. Cell motility and the cytoskeleton. 64, 822-832 (2007).
- Blader, P., Plessy, C., Strahle, U. Multiple regulatory elements with spatially and temporally distinct activities control neurogenin1 expression in primary neurons of the zebrafish embryo. Mech Dev. 120, 211-218 (2003).
- Wada, N., Javidan, Y., Nelson, S., Carney, T. J., Kelsh, R. N., Schilling, T. F. Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull. Development. 132, 3977-3988 (2005).
- Cheo, D. L., Titus, S. A., Byrd, D. R., Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. Concerted assembly and cloning of multiple DNA segments using in vitro site-specific recombination: functional analysis of multi-segment expression clones. Genome Res. 14, 2111-2120 (2004).
- Kwan, K. M., Fujimoto, E., Grabher, C., Mangum, B. D., Hardy, M. E., Campbell, D. S., Parant, J. M., Yost, H. J., Kanki, J. P., Chien, C. B. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Dev Dyn. 236, 3088-3099 (2007).
- O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J Vis Exp. 24, (2009).
- Berndt, J. D., Clay, M. R., Langenberg, T., Halloran, M. C. Rho-kinase and myosin II affect dynamic neural crest cell behaviors during epithelial to mesenchymal transition in vivo. Dev Biol. 324, 236-244 (2008).
