Summary
Этот протокол описывает изображения отдельных нейронов или нервных клеток гребня в живых рыбок данио эмбрионов. Этот метод используется для изучения поведения и сотовой локализации актина с помощью флуоресцентной конфокальной покадровой микроскопии.
Abstract
Данио является идеальной моделью для работы с изображениями камера поведения в процессе развития в естественных условиях. Данио рерио эмбрионы внешне оплодотворенной и, следовательно, легко доступны на всех этапах развития. Более того, их оптическая прозрачность позволяет высоким разрешением клеточной и молекулярной динамики природной среды нетронутыми эмбриона. Мы используем подход жить изображений для анализа поведения ячейки во время нейронные миграции клеток гребня и результатом и руководства нейронных аксонов.
Живая изображения особенно полезна для понимания механизмов, регулирующих процессы клеточной подвижности. Чтобы представить себе детали клеточной подвижности, таких как выступающими деятельности и молекулярная динамика, это выгодно для обозначения отдельных ячеек. В данио рерио, ДНК плазмиды инъекция дает переходный характер экспрессии мозаики и предлагает явные преимущества перед другими методами маркировки клеток. Например, трансгенные линии часто этикетке всей популяции клеток и таким образом может заслонить визуализации тонких выступов (или изменений в молекулярно-массовое распределение) в одну ячейку. Кроме того, введение ДНК в один-клеточной стадии менее инвазивных и более точных, чем краситель инъекции на более поздних этапах.
Здесь мы опишем метод маркировки отдельных развивающихся нейронов или нервных клеток гребня и визуализации их поведение в естественных условиях. Мы вводят плазмиды ДНК в 1-клеточной стадии эмбриона, в результате чего мозаика выражение трансгена. Векторы содержат ячейки конкретных промоутеров, которые управляют выражение гена в подмножество сенсорных нейронов или нервных клеток гребня. Мы предоставляем примеры клетки помечены мембраны целевых GFP или биосенсор зонд, который позволяет визуализировать F-актина в живых клетках 1.
Эрика Андерсена, Namrata Asuri, и Мэтью Клей способствовали в равной степени к этой работе.
Protocol
1. Ассамблея инъекции слайдов и визуализация слайдов
Инъекция слайдов:
- Подготовка Sylgard силиконового эластомера в соответствии с инструкциями производителя.
- Используйте Sylgard для соединения трех стандартных микроскопом стеклах вместе, складывая один слайд на вершине пересечении двух других слайды, которые расположены бок о бок на длинных краев. Верхнем слайде создает прямоугольный угол или "стены" между верхней и нижней слайдов.
- Давайте Sylgard набор на ночь. Эти слайды являются многоразовыми.
Изображений слайд:
- Мы используем нержавеющей стали вырезать прямоугольники с тем же размером со стандартный микроскопический слайд стекла (75 мм х 25 мм х 1 мм), так что камера подходит держателя слайдов на столик микроскопа. 1,5 см, вырезать отверстие в центре прямоугольника.
- Прикрепите 22 мм 2 покровное к металлической прямоугольник с Sylgard. Используйте ровно столько Sylgard тщательно печать покровное. Чтобы изображение на инвертированный микроскоп, эмбрионы будут установлены на этой покровное и изображение получено с дном.
- Давайте Sylgard набор на ночь. Эти слайды являются многоразовыми и очищается на 70% этанола между применениями.
2. Подготовка конструкций ДНК
Чтобы выразить трансгена в тканеспецифические образом, интерес гена клонируется за ячейке конкретных промоутера. Мы используем цис-регуляторных элементов гена данио neurogenin1 (-3.1ngn1) 2 или sox10 гена (-4.9sox10) 3 водить выражение в сенсорных нейронов или нервных клеток гребня, соответственно. Для визуализации клеток и мембраны динамика, мы выражаем цитоплазматические мембраны или локализованные флуорофоров. Чтобы создать образ F-актин распределения, мы выражаем ДНК, кодирующей домен calponin гомологии атрофин слит с mCherry (UtrCH-mCherry). UtrCH-mCherry биосенсор зонда позволяет визуализировать F-актин, не мешая актина динамики 1. Мы генерируем эти конструкции ДНК использованием шлюза Invitrogen рекомбинации стратегия, ориентированная на клонирование 4 и векторы представлены в данио Tol2kit 5.
- Создание вектора экспрессии (ы) с помощью Многоузловое-Gateway Технология и векторы из данио Tol2kit 5. Плазмиды содержат Tol2 позвоночник от pT2KXIGDin.
- Purify плазмидной ДНК плазмиды с QIAfilter Midi Подготовка комплекта (QIAGEN Inc) и элюируются в стерильной воде. ДНК не должны быть линеаризованной для инъекций.
3. Введение ДНК-конструкции
- Развести ДНК, чтобы конечная концентрация 10-50 мкг / мл ДНК в 0,2% фенола красного (для визуализации во время инъекций) в воде.
- Заполнить и калибровать иглы: Назад заполнения вытащил капиллярной иглой с приблизительно 1 мкл раствора ДНК и вставить ее в держатель иглы инъекции аппарата (мы используем Picospritzer). Использование тонких щипцов, сломать кончик иглы так, чтобы кончик открытия составляет примерно 10 мм в диаметре. Измерьте диаметр капли в минерального масла с окулярного микрометра. Отрегулируйте давление настройки длительности, чтобы получить капли объемом около 1 п.
- Соберите 1-клеток эмбрионов этап в E3 среда эмбриона (5 мМ NaCl, 0.17mM KCl, CaCl 2 0,33 мм, 0,33 мм MgSO 4 * 7H 2 O, рН 7,0).
- Передача примерно 30-60 эмбрионов слайд инъекции и положение эмбриона в правом углу угол, образуемый между верхней и нижней слайдов. Удалите большинство Е3 так, что эмбрионы проходят в слайд поверхностным натяжением.
- Используйте изогнутые рассекает контактный вращаться эмбрионов так ячейка к стене инъекции слайда.
- Использование микроманипулятора для руководства иглу через эмбрион хориона, через желток и в одной клетки эмбриона. Inject 0.5-1 п раствора ДНК в клетку.
- Трансфер эмбрионов в чашки Петри в Е3 и инкубировать при 28,5 ° C. При необходимости, развитие может быть замедлено путем инкубации эмбрионов при более низкой температуре.
4. Монтаж эмбрионов для работы с изображениями
- Удалить chorions из эмбрионов с мелкими пинцетом примерно за час до эмбрионы достигают желаемого возраста для работы с изображениями (примерно 14-17 часов после оплодотворения для наших целей).
- Выберите эмбрионов с использованием меченых клеток вскрытии микроскоп с флуоресценции. Мы используем 4X цели (увеличение 40х) на сферу Nikon AZ100 из-за его сочетание большое рабочее расстояние и большом увеличении.
- Место эмбрион в микроцентрифужную трубка с примерно 50 мкл E3, содержащий 0,2% Tricaine анестезии (10X концентрации).
- Добавить 500 мкл 1% низкой температурой плавления агарозы в E3 10 мМ HEPES (хранятся при температуре 42 ° С), разбавляя Tricaine до конечной концентрации 0,02%.
- Сразу передачи эмбриона в агарозном падение напокровное из изображений слайд, используя широкий стекла отверстия пипетки.
- Перед агарозном затвердевает, положение эмбриона так регионе с мечеными клетками вниз от нижнего покровного (спинной вниз для нервных клеток гребня и дорсолатеральной вниз для спинальных сенсорных нейронов).
- Соберите изображения камеры: Пальто с одной стороны пластиковым кольцом (2 см наружный диаметр, 3 мм) с силиконовой смазки вакуумного и прикрепите к слайду изображений металла. Пальто другой стороне кольца с жиром.
- Заполнить камеру с Е3, содержащем 10 мМ HEPES и 0,02% Tricaine. Уплотнение камеры сверху нанесения 22 мм 2 покровное к началу смазанные поверхности кольца.
5. 4D визуализации клеточных поведения на Олимпе FV1000 конфокальной микроскопии с IX81
Подробности захвата изображения будет зависеть от специфики вашего микроскопа. Здесь мы опишем покадровой процесс приобретения для Olympus FV1000 конфокальной микроскопии. Смотреть предыдущий Юпитера протокол для покадровой приобретения с Zeiss LSM 510 конфокальной системы 6.
- Место изображения камеры в держатель слайдов на столик микроскопа и сосредоточиться на эмбрион использованием 10X или 20X цель в проходящем свете.
- Переключить на 60X цели (НС 1.2 или выше) и сосредоточиться на меченую клетку с epifluorescence. Мы используем либо масло погружения (UPLSAPO 60xO NA 1,35) или погружение в воду (UPLSAPO 60xW NA 1,20) линзы.
- В FV программного обеспечения (версия 1.7c), нажмите на XY повторить начать лазерного сканирования.
- Отрегулируйте приобретение настройки и получения изображений управления (лазера, скорость сканирования, HV, усиление и смещение уровней) для оптимизации сигнала, сохраняя при этом мощность лазера, как минимум (25% или ниже), чтобы предотвратить повреждения тканей и снижения фотообесцвечивания.
- Для приобретения Z-серии, установить верхний и нижний пределы Z-Stack, наряду с шагом. Убедитесь, что глубина значок занимается, так что значок XY развертки имеет XY и Z выделены. Начало приобретение, нажав на значок XYZ Sweep.
- Для приобретения покадровой серии, установить временной интервал и количество временных точек под TimeScan заголовок в окне Приобретение Настройки. Нажмите Время иконка в окне управления Приобретение изображения так, чтобы значок XY развертки имеет XY (Z) и T выделены. Начало приобретение, нажав XY (Z) T развертки значок.
- Кроме того, TimeController может быть использован для создания покадровой. Это программирование полезно при генерации больших наборов данных, так как она не превышает распределения памяти. В области Device, открытого TimeController окна. Создать новую Задачу Imaging. Окно изображения параметр будет открытым. Нажмите кнопку FV статус обновить приобретение настройки. Убедитесь в том, сохранять и удалять сообщения проверяются под заголовком Terminate. Установить имя выходного файла и нажмите кнопку ОК, чтобы сохранить настройки и закрыть окно. Используйте Loop функцию, чтобы установить необходимый интервал времени и количество временных точек. Нажмите кнопку Готово и Пуск, чтобы начать покупки. Пауза и Z-сдвиг функции могут быть использованы для переориентации в то время как изображения.
6. Представитель Результаты
Цифры и фильмов изображают примеры сенсорных нейронов и нервных клеток гребня, меченных мембранно-целевых флуорофоров или зонд актина биосенсоров.
Рисунок 1 конфокальной изображений (г-проекций) Tg (ngn1: GFP-caax). Трансгенных эмбрионов вводят с 25 пг ngn1: mCherry-caax ДНК. MCherry-CAAX этикетки одного нейрона красный () в фоновом со всеми Rohon-Борода сенсорных нейронов помечены зеленым цветом (В). C) Объединенные образ как зеленый и красный каналы. Шкала бар = 50 мкм.
Рисунок 2 конфокальной г-проекций нейронов в эмбрионы вводят ~ 20 пг ngn1:.. MCherry-UtrCH ДНК) Rohon-Борода сенсорного нейрона в 16,5 HPF эмбриона. F-актин сигнал сильный роста конусов (наконечники стрел) и выступы по вновь образованных аксонами. B) Нейрон в 20 HPF эмбрион показывает сильную F-актин сигнал роста конусов разветвленных периферических аксонов (наконечники стрел) и слабый сигнал в более зрелых центральной аксоны (стрелки). Шкала бар = 50 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Оптимальная концентрация вводили ДНК будет варьироваться в зависимости от размера и силы промоутер строительства и должен быть определен эмпирически. Инъекция слишком много ДНК может привести к нездоровым эмбрионов с обширной гибель клеток, в то время слишком мало приведет к очень небольшой части вводят эмбрионы выражения трансгена. Уровень экспрессии ДНК коррелирует с силой флуорофора сигнал, который меняется от клетки к клетке. При сортировке эмбрионов под epifluorescence, исключить те с чрезвычайно высоким уровнем экспрессии. Меченых клеток, которые появляются очень яркие как правило, также показывают явные признаки токсичности, таких, как ненормальные морфологии клетки, mislocalization меченых молекул и гибели клеток. Типичный инъекции ДНК дает 5-10% эмбрионов, пригодных для работы с изображениями.
F-актин биосенсор может функционировать в доминирующих отрицательных моды при выраженных на высоком уровне. Если промоутер управляемой выражение проблематично, биосенсоров может быть выражена повсеместно, вводя мРНК. Преимущество мРНК инъекции в том, что уровни экспрессии можно управлять, регулируя концентрацию мРНК. Отдельные клетки в этих эмбрионов помечены совместное введение ДНК-конструкции содержащих клеточных конкретных промоутер вождения выражение мембраны локализованных флуорофора. Мы использовали этот подход для изображения F-актина в нервные клетки гребня 7.
Мы часто выполняют одноклеточные маркировки техники в трансгенных линий выражения. Например, потребители инъекционных-3.1ngn1: mcherry плазмиды в эмбрионы Tg (-3.1ngn1: GFP) линии будет наклейка сенсорных нейронов красного фоне зеленой нейронов. Эта стратегия позволяет исследовать поведение отдельной клетки в контексте всей клеточной популяции.
Мы сосредоточимся на изображение нервной и нервного гребня ячейки поведения и актин распределения. Тем не менее, общий метод ткани конкретных маркировки ячейка мозаики ДНК плазмиды инъекция может быть расширен для использования с флуоресцентных белков слияния, а также другие генетически закодированы биосенсор зондов. Сочетание этих методов может позволить следователям визуализировать субклеточные локализации специфических молекул, а также сигнальных механизмов в естественных условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана NIH R01 NS042228 к MCH Olympus FV1000 конфокальной была приобретена с приборами NIH общие грант S10RR023717 к UW кафедре зоологии (П. И. Билл Бемент).
Эрика Андерсена, Namrata Asuri, и Мэтью Клей способствовали в равной степени к этой статье.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | A5040-250G | |
| Sylgard Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 184 | |
| QIAfilter Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12243 | |
| Low melting point agarose | Invitrogen | 15517-014 | |
| Picospritzer | Parker Hannifin Corporation | 051-0302-900 |
References
- Burkel, B. M., von Dassow, G., Bement, W. M. Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin. Cell motility and the cytoskeleton. 64, 822-832 (2007).
- Blader, P., Plessy, C., Strahle, U. Multiple regulatory elements with spatially and temporally distinct activities control neurogenin1 expression in primary neurons of the zebrafish embryo. Mech Dev. 120, 211-218 (2003).
- Wada, N., Javidan, Y., Nelson, S., Carney, T. J., Kelsh, R. N., Schilling, T. F. Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull. Development. 132, 3977-3988 (2005).
- Cheo, D. L., Titus, S. A., Byrd, D. R., Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. Concerted assembly and cloning of multiple DNA segments using in vitro site-specific recombination: functional analysis of multi-segment expression clones. Genome Res. 14, 2111-2120 (2004).
- Kwan, K. M., Fujimoto, E., Grabher, C., Mangum, B. D., Hardy, M. E., Campbell, D. S., Parant, J. M., Yost, H. J., Kanki, J. P., Chien, C. B. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Dev Dyn. 236, 3088-3099 (2007).
- O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J Vis Exp. 24, (2009).
- Berndt, J. D., Clay, M. R., Langenberg, T., Halloran, M. C. Rho-kinase and myosin II affect dynamic neural crest cell behaviors during epithelial to mesenchymal transition in vivo. Dev Biol. 324, 236-244 (2008).
