Summary
Abbiamo dimostrato l'utilità di citometria a flusso multicolore per informazioni dettagliate caratterizzazione fenotipica e funzionale del totale così come sottoinsiemi memoria di CD4 + e CD8 + T nei macachi rhesus, il modello ideale per l'HIV / AIDS studi vaccino.
Abstract
Il modello di macaco rhesus è attualmente il miglior modello disponibile per l'HIV-AIDS rispetto alla comprensione della patogenesi e per lo sviluppo di vaccini e terapie
Protocol
Le procedure per l'analisi dettagliate fenotipica e funzionale del totale così come sottoinsiemi di cellule T di memoria può essere diviso in quattro parti: 1) Preparazione delle cellule e stimolazione antigenica, 2) indicatore colorazione superficiale, 3) colorazione delle citochine intracellulari e 4) La citometria a flusso analisi.
1. Preparazione delle cellule e la stimolazione antigenica
- Sia appena isolato e crio-conservato le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) sono stati utilizzati in questo protocollo. Le PBMC sono state isolate da campioni venoso eparinizzato o citrato sangue dei macachi rhesus per sedimentazione gradiente di densità con Ficoll-Hypaque (Histopaquen-1077, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Aliquote di PBMC sono stati congelati e conservati in 90% di FCS e 10% di DMSO in azoto liquido.
- Quando si utilizza la crio-conservato PBMC, le fiale di surgelati PBMC sono stati rimossi da azoto liquido e rapidamente scongelato in un bagno d'acqua 37 C, delicatamente mescolato, lavati con RPMI-1640 (Hyclone laboratori, Logan, UT) per rimuovere il supporto di congelamento e risospese in mezzi di comunicazione completo [CM; RPMI-1640 integrano con il 10% di siero FCS (Hyclone laboratori), 2mM L-glutamina (Sigma-Aldrich), 100U/ml penicillina / streptomicina (Invitrogen), e colto in 6 - piastre da coltura tissutale overnight a 37 ° C in un umidificata al 5% CO 2 nell'atmosfera. La mattina seguente, conteggio delle cellule vitali sono stati determinati dal trypan blu metodo di esclusione del colorante e risospese in CM.
- Le cellule sono state trattate in modo diverso per non specifici contro l'antigene specifico per la stimolazione seguita da analisi di citochine: (a) Per i non-specifica stimolazione con forbolo miristato 12-13-acetato (PMA) e ionomicina (I) (Sigma-Aldrich, S. Louis, MO), aliquote di cellule in un volume di 0,1 ml (1,0 x 10 6 cellule / pozzetto) sono stati placcati in singoli pozzetti di piastre a 96 pozzetti tessuto cultura (BD Biosciences, Franklin lago, NJ). Il PMA e ionomicina sono stati utilizzati ad una concentrazione finale di 50ng/ml e 500ng/ml, rispettivamente. Il volume totale finale per l'96-pozzetti coltura tissutale è 0.2ml/well: (b) Per la stimolazione antigene specifico, 1,0 x 10 6 cellule in un volume di 1,0 ml sono stati placcati in singoli pozzetti di piastre tessuto 24-ben cultura (BD Biosciences , Franklin lago, NJ), dove i pozzi sono stati pre-trattati come descritto in precedenza con modifica 9. In breve, il 24-piastre da coltura tissutale sono stati rivestiti con 2,5 mg / ml / pozzetto di capra anti-topo IgG (H + L) (Kierkegaard e Perry Laboratorio, Gaithersburg, MD) nella soluzione di 50 mM Tris (PH 8,6) per 4 ° C durante la notte. La mattina seguente sono stati lavati i piatti due volte con PBS sterile e co-stimolatorie mAb CD49d, clone 9F10 (BD Biosciences, San Jose, CA) sono stati aggiunti a 10 mcg / ml / pozzetto seguito da incubazione per un'ora a 37 ° C. Dopo l'incubazione, le piastre sono state lavate due volte con PBS sterile a temperatura ambiente. Gli antigeni di interesse (tra cui cocktail di sei peptidi busta HIV 8 sono stati aggiunti ad una concentrazione finale di 10μg/ml di ogni peptide. Pozzi supplementari con le cellule in CM solo sono stati preparati come controllo negativo. Il volume totale finale per ciascun pozzetto delle 24 -pozzetti coltura tissutale era 1,0 ml.
- Le cellule sono state coltivate per 6 ore a 37 ° C in un umidificata al 5% CO 2 nell'atmosfera. Brefeldin A (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) è stato aggiunto alla cultura in 10μg/ml per la finale di 4,5 ore di stimolazione. Successivamente, le cellule sono state trasferite in provette da 5 ml in polipropilene e lavate con acqua fredda (4 ° C), tampone di lavaggio di flusso (Dulbecco PBS (DPBS, Ca 2 / Mg 2-libero; Life Technology, Rockville, MD) con 2% di siero FCS), e poi elaborati per la colorazione con i vari anticorpi fluorescenza etichettati.
2. Marcatori di superficie immunofluorescenza colorazione
- Cellule stimolate sono stati colorati con 1UL vivo / morto risolvibile acqua colorante fluorescente reattiva a 4 ° C al buio per 30 minuti, una volta lavate con tampone lavaggio freddo flusso.
- Poi, i seguenti opportunamente titolato fluorescenza marcati anticorpi monoclonali sono stati aggiunti alle cellule: anti-CD3 PE-Cy7 (SP34-2), anti-CD8 Alexa700 (RPA-T8), anti-CD28-PerCP Cy5.5 (L293) , anti-CD95 APC (DX2) e anti CD4 Pacific Blue (OKT4), il tutto da BD Biosciences (Franklin lago, NJ), ad eccezione di CD4 blu pacific (OKT4) da eBioscience (San Diego, CA). Le cellule sono state incubate per 30 minuti a 4 ° C al buio.
- Per ogni esperimento sia compensazione controlli e fluorescenza meno uno (FMO) 10,11 controlli sono stati utilizzati. Controlli di compensazione sono stati utilizzati per determinare la coeffecients spillover di ogni individuo macchia in altri rivelatori. Per i controlli di compensazione, un set completo di tubi contenenti sospensioni cellulari da uno di scimmia sono stati marcati con fluorescenti coniugati mAb singolarmente come macchie di colore. FMO è una combinazione di macchie multicolore che contiene tutti i reagenti, ma quello di interesse e viene utilizzato per determinare il confine tra un positivo unpopolazione ° negativo duplicando auto-fluorescenza livello e dati presenti nel campione completamente colorato.
- Cellule colorate sono state poi lavate con tampone di lavaggio freddo flusso, e fissati in fissazione / permeabilizzazione soluzione (BD Biosciences, San Jose, CA) per almeno 10 minuti (in questa fase le cellule possono essere conservate durante la notte a 4 ° C al buio) prima di eseguire la colorazione intracellulare di citochine.
3. Citochine colorazione intracellulare
- Cellule fissate sono state lavate con tampone flusso di lavaggio, e poi Perm / Tampone di lavaggio (BD Biosciences, San Jose, CA) è stato aggiunto in base alle istruzioni del costruttore. In breve, le cellule sono state incubate in 0,1 ml di Perm 1X / Tampone di lavaggio per 10 minuti a 4 ° C al buio.
- Successivamente, le cellule sono state incubate con il opportunamente titolato FITC anti-IFN-γ (B27) e PE-etichettati anti-IL-2 (MQ1-17H12) per 60 minuti a 4 ° C al buio.
- Quindi le cellule sono state lavate due volte con la soluzione di permeabilizzazione
- Dopo l'ultimo lavaggio, le cellule sono state risospese in 1% paraformaldeide in DPBS e sottoposti ad analisi di citometria a flusso entro 24 ore.
4. Analisi di citometria a flusso
- Le celle colorate sono state acquisite su un citometro a flusso II LSR (BD Biosciences, San Jose, CA) o ciano ADP (Dako, Carpinteria, CA). FACS dati sono stati analizzati utilizzando il software FlowJo (Albero Star, Ashland, OR).
- Figura. 1 mostra lo schema gating utilizzate per le analisi dei diversi sottogruppi di cellule T da un animale rappresentativo. I linfociti sono stati gated tramite forward scatter (FSC) rispetto side scatter (SSC), e poi vivere linfociti sono stati identificati sulla base di SSC e aqua-negativi popolazione. Le cellule T sono state poi identificato da CD3 espressione seguita dalla rilevazione dei CD4 + CD8-(cellule T CD4 +) e CD4-CD8 + (cellule T CD8 +) popolazioni nel CD3 + popolazione di cellule T. CD4 + e CD8 + T sono stati ulteriormente distinti in diversi sottoinsiemi sulla base di CD28 e CD95 espressione ingenua (Tn, CD28 + CD95-), la memoria centrale (Tcm, CD28 + CD95 +) e la memoria effettrici (Tem, CD28-CD95 +) cellule come descritto in letteratura 5, 10.
- Figura. 2 mostra come i diversi sottoinsiemi di cellule CD4 + e CD8 + T è stata valutata la capacità funzionale in termini di produzione di citochine (INF-γ e / o IL-2) in risposta alla stimolazione con PMA e ionomicina (PMA + I).
5. Rappresentante FACS dati
Composizione PBMC in macachi rhesus è stata determinata mediante analisi FACS. La figura 1 mostra lo schema gating utilizzate per le analisi dei diversi sottogruppi di cellule T da un animale rappresentativo. I linfociti sono stati gated tramite forward scatter (FSC) rispetto side scatter (SSC), e poi vivere linfociti sono stati identificati sulla base di SSC e aqua-negativi popolazione. Le cellule T sono state poi identificate da CD3 espressione. CD4 + CD8-(cellule T CD4 +) e CD4-CD8 + (cellule T CD8 +) popolazioni nel CD3 + popolazione di cellule T sono stati determinati. Come mostrato nella Figura 2, il CD4 + e CD8 + T sono stati ulteriormente distinti in diversi sottoinsiemi sulla base di CD28 e CD95 espressione ingenua (Tn, CD28 + CD95-), la memoria centrale (Tcm, CD28 + CD95 +) e la memoria effettrici (Tem, CD28-CD95 +) delle cellule. Figura 2A mostra INF-γ e IL-2 produzione in CD4 non stimolata e PMA / ionomicina stimolato + cellule T, e sottoinsiemi, e 2B figura mostra INF-γ e IL-2 produzione non stimolata e PMA / ionomicina stimolato cellule T CD8 +, e sottoinsiemi Notare i profili delle citochine distinte provocato dalla stimolazione in ogni sottogruppo.
Figura 1. Strategia di gating utilizzate per l'analisi di citometria a flusso della composizione PBMC in rhesus macqaues. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande della figura 1.
Figura 2. (A) profilo di produzione di citochine di cellule CD4 + T totale e sottoinsiemi. (B) profilo di produzione di citochine del totale delle cellule T CD8 + e sottoinsiemi. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di 2a, o qui per una versione più grande di figura 2b.
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Acknowledgments
Dr. Pramod Nehete e la signora Bharti Nehete macaco di sangue e campioni PBMC; Questo lavoro è stato parzialmente supportato con fondi dal NIH concedere AI 46969, e tutti i terreni di coltura cellulare sono stati prodotti dai Media Central Laboratory, che è finanziato dal NIH concedere CA 16672.
Materials
Solution and Buffers |
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Activation agents |
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Cytokine secretion inhibitors |
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Antibodies |
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References
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