Summary
Vi visar nyttan av multicolor flödescytometri för detaljerad fenotypisk och funktionell karakterisering av den totala såväl som delmängder minne av CD4 + och CD8 + T-celler i rhesus makaker, den ideala modellen för hiv / aids-vaccin studier.
Abstract
Den rhesus makak-modellen är för närvarande det bästa tillgängliga modellen för hiv-aids vad gäller ökad förståelse för uppkomsten och utvecklingen av vaccin och läkemedel
Protocol
Förfarandena för detaljerad fenotypisk och funktionella analyser av det totala liksom delar minne av T-celler kan delas in i fyra delar: 1) Cell förberedelse och antigen stimulering, 2) Yta markör färgning, 3) intracellulära cytokiner färgning och 4) Flödescytometri analyser.
1. Cellberedningen och antigena stimulering
- Både nyligen isolerade samt kryo-bevarade perifera mononukleära blodceller (PBMC) användes i detta protokoll. Den PBMC var isolerade från hepariniserade eller citrerad venösa blodprov av Rhesus makaker av densitetsgradient sedimentering med Ficoll-Hypaque (Histopaquen-1077, Sigma-Aldrich, ST. Louis). Lika delar av PBMC förvarades frysta i 90% FCS och 10% DMSO i flytande kväve.
- När du använder kryo-bevarade PBMC var injektionsflaskor med frysta PBMC bort från flytande kväve och snabbt tinade i en 37 C vattenbad, försiktigt blandas, tvättas med RPMI-1640 (HyClone laboratorier, Logan, UT) för att ta bort frysningen medellång och resuspenderas helt media [cm; RPMI-1640 komplettera med 10% värmeinaktiveras FCS (HyClone laboratorier), 2 mm L-glutamin (Sigma-Aldrich), 100U/ml penicillin / streptomycin (Invitrogen), och odlas i 6 - väl vävnadskultur plattorna vid 37 ° C i en fuktig 5% CO 2 atmosfär. Nästa morgon var lönsamma celler bestäms av trypan-blå färg utanförskap metod och resuspenderas i CM.
- Cellerna behandlas olika för icke-specifika kontra antigenspecifika stimulering följt av cytokin analyser: (a) För icke-specifik stimulering med phorbol 12-myristate 13-acetat (PMA) och Ionomycin (I) (Sigma-Aldrich, St Louis, MO), alikvoter av celler i en volym av 0,1 ml (1,0 x 10 6 celler / brunn) var klädd i enskilda brunnar i 96-hålsplattor vävnadsodling (BD Biosciences, Franklin sjö, NJ). Den PMA och Ionomycin användes vid en slutlig koncentration av 50ng/ml och 500ng/ml, respektive. Det slutliga totala volymen för 96-såväl vävnadsodling platta 0.2ml/well: (b) För antigenspecifikt stimulering, var 1,0 x 10 6 celler i en volym 1,0 ml klädd i enskilda brunnar i 24-brunnars plattor vävnadsodling (BD Biosciences , Franklin sjö, NJ), där brunnar förbehandlade som tidigare beskrivits med modifikation 9. Kortfattat var 24-och vävnadsodling plattor belagda med 2,5 mikrogram / ml / brunn get-anti-mus-IgG (H + L) (Kierkegaard och Perry Laboratory, Gaithersburg, MD) i 50 mM Tris (pH 8,6) under 4 ° C över natten. Nästa morgon Plattorna tvättas två gånger med sterilt PBS och co-stimulerande mAb CD49d, klon 9F10 (BD Biosciences, San Jose, Kalifornien) lades till vid 10 mikrogram / ml / brunn följt av inkubation under en timme vid 37 ° C. Efter inkubation var plattorna tvättas två gånger med sterilt PBS vid rumstemperatur. De antigener av intresse (inklusive cocktail av sex hiv kuvert peptider 8 lades till en slutlig koncentration av 10μg/ml av varje peptid. Ytterligare brunnar med celler i CM bara var förberedda som negativ kontroll. Det slutliga totala volymen för varje brunn på 24 brunnar vävnadskultur plattan var 1,0 ml.
- Cellerna odlades i 6 timmar vid 37 ° C i en fuktig 5% CO 2 atmosfär. Brefeldin A (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) lades till kulturen på 10μg/ml för den sista 4,5 timmar av stimulering. Därefter var de celler överfördes till 5 rör ml polypropylen och tvättas med kallt (4 ° C) flöde tvättbuffert (Dulbecco är PBS (DPBS, Ca 2 / Mg 2-gratis, Life-teknik, Rockville, MD) med 2% värmeinaktiveras FCS) och sedan bearbetas för färgning med olika märkt fluorescens antikroppar.
2. Immunfluorescens yta markörer färgning
- Stimulerade celler var först färgades med 1ul levande / döda fastställbara aqua fluorescerande reaktiv färg vid 4 ° C i mörker i 30 minuter, tvättade en gång med kallt flöde tvättbuffert.
- Sedan följande titreras lämplig fluorescens-märkta monoklonala antikroppar lades till cellerna: Anti-CD3 PE-Cy7 (SP34-2), anti-CD8 Alexa700 (RPA-T8), anti-CD28 PerCP-cy5.5 (L293) , anti-CD95 APC (DX2) och anti CD4 Pacific Blue (OKT4), alla från BD Biosciences (Franklin sjö, NJ), utom CD4 Pacific Blue (OKT4) från eBioscience (San Diego, CA). Cellerna inkuberades i 30 minuter vid 4 ° C i mörker.
- För varje experiment både ersättning kontroller och fluorescens minus en (FMO) kontrollerar 10,11 utnyttjades. Ersättning kontroller utnyttjas för att bestämma spridningseffekter coeffecients varje enskild fläck i andra detektorer. För ersättning kontroller var en komplett uppsättning av rör som innehåller cellsuspensioner från en av apa som färgats med fluorescerande konjugerad Mab individuellt som enda färg fläckar. FMO är en mångfärgad fläckar kombination som innehåller alla reagenser, men en av intresse och används för att bestämma gränsen mellan en positiv ennd negativ befolkningsutveckling genom att duplicera auto-fluorescens nivå och uppgifter som finns i fullt betsad prov.
- Färgade celler har sedan tvättas med kallt flöde tvättbuffert, och fast i fixering / permeabilization lösning (BD Biosciences, San Jose, CA) i minst 10 minuter (i detta skede cellerna kan lagras över natten vid 4 ° C i mörker) Innan du utför intracellulär cytokin färgning.
3. Intracellulär cytokin färgning
- Fast celler tvättas med flödet tvättbuffert och sedan Perm / Tvättbuffert (BD Biosciences, San Jose, Kalifornien) lades enligt tillverkarens anvisningar. Kortfattat var cellerna inkuberas i 0,1 ml av 1X Perm / Tvättbuffert i 10 minuter vid 4 ° C i mörker.
- Därefter var de celler inkuberas med lämpligt titrerade FITC-märkt anti-IFN-γ (B27) och PE-märkta anti-IL-2 (MQ1-17H12) i 60 minuter vid 4 ° C i mörker.
- Då cellerna spolades två gånger till med permeabilization lösningen
- Efter den sista tvätten var cellerna resuspenderas i 1% paraformaldehyd i DPBS och utsätts för Flödescytometri analys inom 24 timmar.
4. Flödescytometri analys
- Den färgade celler förvärvades en LSR II flödescytometer (BD Biosciences, San Jose, Kalifornien) eller Cyan ADP (Dako, Carpinteria, CA). FACS data analyserades med hjälp av FlowJo programvara (Tree Star, Ashland, OR).
- Figur. 1 visar gating systemet använts för analyser av olika undergrupper T-cell från en representant djur. Lymfocyterna först gated via Forward Scatter (FSC) kontra sidospridning (SSC), och sedan leva lymfocyter har identifierats baserat på SSC och vattenbruk negativ befolkningsutveckling. T-cellerna var då positivt identifierats av CD3-uttryck följt av detektion av CD4 + CD8-(CD4 + T-celler) och CD4-CD8 + (CD8 + T-celler) populationer inom det CD3 + T-cell population. CD4 + och CD8 + T-cellerna var mer framstående i olika undergrupper på grundval av CD28 och CD95 uttryck som naiva (Tn, CD28 + CD95-), centrala minne (TCM, CD28 + CD95 +) och effektor minne (TEM, CD28-CD95 +) celler som beskrivna i litteraturen 5, 10.
- Figur. 2 visar hur de olika undergrupper av CD4 + och CD8 + T celler undersöktes för funktionsförmåga i form av cytokin produktion (INF-γ och / eller IL-2) som svar på stimulering med PMA och ionomycin (PMA + I).
5. Representant FACS uppgifter
PBMC sammansättningen hos rhesus makaker bestämdes med hjälp av FACS analys. Figur 1 visar gating systemet använts för analyser av olika undergrupper T-cell från en representant djur. Lymfocyterna först gated via Forward Scatter (FSC) kontra sidospridning (SSC), och sedan leva lymfocyter har identifierats baserat på SSC och vattenbruk negativ befolkningsutveckling. Den T-celler har sedan identifieras av CD3 uttryck. CD4 + CD8-(CD4 + T-celler) och CD4-CD8 + (CD8 + T-celler) populationer inom det CD3 + var T-cell population bestäms också. Som visas i figur 2, var CD4 + och CD8 + T celler mer framstående i olika undergrupper på grundval av CD28 och CD95 uttryck som naiva (Tn, CD28 + CD95-), centrala minne (TCM, CD28 + CD95 +) och effektor minne (TEM, CD28-CD95 +) celler. Figur 2A visar INF-γ och IL-2 produktion i ostimulerade och PMA / ionomycin stimuleras CD4 + T celler, och delmängder, och Figur 2B visar INF-γ och IL-2 produktion i ostimulerade och PMA / ionomycin stimuleras CD8 + T-celler, och delmängder Notera den distinkta cytokin profilerna framkallas genom stimulering i varje undergrupp.
Figur 1. Gating strategi som används för flödescytometrisk analys av PBMC sammansättning i rhesus macqaues. Vänligen klicka här för att se en större version av figur 1.
Figur 2. (A) cytokinproduktionen profil totala CD4 + T-celler och delmängder. (B) cytokinproduktionen profil totala CD8 + T-celler och delmängder. Vänligen klicka här för att se en större version av 2a, eller här för en större version av figur 2b.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dr Pramod Nehete och fru Bharti Nehete för makak blod och PBMC prover, Detta arbete har delvis stöd av medel från NIH bidrag AI 46.969, och alla cellodling media producerades av Central Media Laboratory, som finansieras av NIH bidrag CA 16.672.
Materials
Solution and Buffers |
|||
|
|||
Activation agents |
|||
|
|||
Cytokine secretion inhibitors |
|||
|
|||
Antibodies |
|||
|
References
- Ogg, G. S. Quantitation of HIV-1-specific cytotoxic T lymphocytes and plasma load of viral RNA. Science. 279, 2103-2106 (1998).
- Borrow, P., Lewicki, H., Hahn, B. H., Shaw, G. M., Oldstone, M. B. Virus-specific CD8+ cytotoxic T-lymphocyte activity associated with control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 infection. J Virol. 68, 6103-6110 (1994).
- Koup, R. A. Temporal association of cellular immune responses with the initial control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 syndrome. J Virol. 68, 4650-4655 (1994).
- Walker, J. M., Maecker, H. T., Maino, V. C., Picker, L. J. Multicolor flow cytometric analysis in SIV-infected rhesus macaque. Methods Cell Biol. 75, 535-557 (2004).
- Pitcher, C. J. Development and homeostasis of T cell memory in rhesus macaque. J Immunol. 168, 29-43 (2002).
- Jung, T., Schauer, U., Heusser, C., Neumann, C., Rieger, C. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. J Immunol Methods. 159, 197-207 (1993).
- Keeney, T. S., Nomura, L. E., Maecker, H. T., Sastry, K. J. Flow cytometric analysis of macaque whole blood for antigen-specific intracellular cytokine production by T lymphocytes. J Med Primatol. 32, 23-30 (2003).
- Gauduin, M. C. Optimization of intracellular cytokine staining for the quantitation of antigen-specific CD4+ T cell responses in rhesus macaques. J Immunol Methods. 288, 61-79 (2004).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J Immunol Methods. 243, 77-97 (2000).
- De Rosa, S. C., Herzenberg, L. A., Roederer, M. 11-color 13-parameter flow cytometry: identification of human naive T cells by phenotype, function, and T-cell receptor diversity. Nat Med. 7, 245-248 (2001).
- Tung, J. W., Parks, D. R., Moore, W. A., Herzenberg, L. A. New approaches to fluorescence compensation and visualization of FACS data. Clin Immunol. 110, 277-283 (2004).
