Summary
Demonstramos a utilidade da multicolor citometria de fluxo para caracterização fenotípica e funcional detalhada do total, bem como subconjuntos memória de CD4 + e CD8 + T em macacos rhesus, o modelo ideal para estudos de HIV / AIDS vacina.
Abstract
O modelo de macaco rhesus é atualmente o melhor modelo disponível para o HIV-AIDS com respeito à compreensão da patogênese, bem como para o desenvolvimento de vacinas e terapêutica
Protocol
Os procedimentos para a análise detalhada fenotípica e funcional do total, bem como subconjuntos de memória das células T pode ser dividido em quatro partes: 1) a preparação de células e estimulação antigênica, 2) coloração da superfície marcador, 3) coloração de citocinas intracelulares e 4) citometria de fluxo análises.
1. Preparação celular e estimulação antigênica
- Ambos os recém-isoladas, bem como crio-preservado células mononucleares do sangue periférico (PBMC) foram utilizados neste protocolo. O PBMC foram isoladas de amostras venosas heparinizado ou citratado sangue de macacos rhesus por sedimentação gradiente de densidade Ficoll-Hypaque (Histopaquen-1077, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Alíquotas de PBMC foram armazenadas congeladas em FCS a 90% e DMSO 10% em nitrogênio líquido.
- Ao usar o crio-preservado PBMC, os frascos de PBMC congelados foram retirados do nitrogênio líquido e descongeladas rapidamente em banho-maria 37 C, delicadamente misturados, lavadas com RPMI-1640 (HyClone laboratórios, logan, UT) para remover o meio de congelamento e re-suspensas em meio completo [CM; RPMI-1640 suplemento com 10% inativado pelo calor FCS (HyClone laboratórios), 2mM de L-glutamina (Sigma-Aldrich), 100U/ml penicilina / estreptomicina (Invitrogen), e cultivadas em 6 - placas de cultura de tecido bem durante a noite a 37 ° C em 5% CO 2 umidificado atmosfera. Na manhã seguinte, contagens de células viáveis foram determinados pelo método de exclusão de tripan azul-dye e re-suspenso no CM.
- As células foram tratadas de forma diferente para não-específica contra antígenos específicos estímulo seguido por análises de citocinas: (a) Para os não-específicas de estimulação com forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) e Ionomicina (I) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), alíquotas de células em um volume de 0,1 ml (1,0 x 10 6 células / poço) foram plaqueadas em poços individuais de placas de 96 poços de cultura de tecidos (BD Biosciences, Franklin lago, NJ). O PMA e Ionomicina foram usados na concentração final de 50ng/mL e 500ng/ml, respectivamente. O volume final total de 96 poços da placa de cultura de tecidos é 0.2ml/well: (b) Para a estimulação antígeno específico, 1.0 x 10 6 células em um volume de 1,0 ml foram semeadas em poços individuais de placas de 24 poços de cultura de tecidos (BD Biosciences , Franklin lago, NJ), onde os poços foram pré-tratados conforme descrito anteriormente com modificações 9. Resumidamente, a placas de 24 poços de cultura de tecido foram revestidas com 2,5 mg / ml / poço de cabra anti-IgG de rato (H + L) (Kierkegaard e Perry Laboratory, Gaithersburg, MD) em solução Tris 50 mM (pH 8,6) para 4 ° C durante a noite. Na manhã seguinte, as placas foram lavadas duas vezes com PBS estéril e co-estimulatórias mAb CD49d, clone 9F10 (BD Biosciences, San Jose, CA) foram adicionados a 10 mcg / ml / poço seguido de incubação durante uma hora a 37 ° C. Após a incubação, as placas foram lavadas duas vezes com PBS estéril à temperatura ambiente. Os antígenos de interesse (incluindo cocktail de seis peptídeos envelope HIV 8 foram adicionados a uma concentração final de 10μg/ml de cada peptídeo. Poços adicionais com as células de CM só foram preparadas como controle negativo. O volume final total para cada poço dos 24 bem-placa de cultura de tecidos foi de 1,0 ml.
- As células foram cultivadas por seis horas a 37 ° C em 5% CO 2 umidificado atmosfera. Brefeldin A (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) foi adicionada à cultura no 10μg/ml para a final 4,5 horas de estimulação. Posteriormente, as células foram transferidas para 5 tubos de polipropileno ml e lavados com água fria (4 ° C) tampão de lavagem de fluxo (PBS Dulbecco (DPBS, Ca 2 / Mg 2-livre, tecnologias de Vida, Rockville, MD) com 2% inativado pelo calor FCS), e em seguida processados para a coloração de fluorescência com os vários anticorpos marcados.
2. Imunofluorescência marcadores de superfície coloração
- Células estimuladas foram inicialmente coradas com 1ul fixable aquático vivo / morto corante fluorescente reativa a 4 ° C no escuro por 30 minutos, lavado uma vez com tampão frio fluxo de lavagem.
- Então, o seguinte adequadamente titulada fluorescência marcado anticorpos monoclonais foram adicionados às células: anti-CD3 PE-Cy7 (SP34-2), anti-CD8 Alexa700 (RPA-T8), CD28-anti-PerCP cy5.5 (L293) , anti-CD95 APC (DX2) e anti CD4 Pacific Blue (OKT4), todos da BD Biosciences (Franklin lago, NJ), exceto CD4 Pacific Blue (OKT4) de eBioscience (San Diego, CA). As células foram incubadas por 30 minutos a 4 ° C no escuro.
- Para cada experimento compensação de controles e de fluorescência menos um (FMO) controla 10,11 foram utilizados. Controles de compensação foram utilizados para determinar a coeffecients spillover de cada indivíduo mancha em outros detectores. Para os controles de compensação, um conjunto completo de tubos contendo suspensões de células de um dos macacos foram coradas com conjugado fluorescente mAb individualmente como manchas de cor única. FMO é uma combinação coloração multicolor que contém todos os reagentes, mas a de interesse e é utilizada para determinar o limite entre um positivo umand populacional negativo, duplicando auto-fluorescência nível e os dados presentes na amostra totalmente manchado.
- Células coradas foram então lavadas com tampão de fluxo de lava fria, e fixado em fixação / permeabilização solução (BD Biosciences, San Jose, CA) para pelo menos 10 minutos (nesta fase as células podem ser armazenadas durante a noite a 4 ° C no escuro) antes de realizar a coloração de citocinas intracelulares.
3. Coloração de citocinas intracelulares
- Células fixadas foram lavadas com tampão de lavagem de fluxo, e depois Perm / Tampão de lavagem (BD Biosciences, San Jose, CA) foi adicionado de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, as células foram incubadas em 0,1 ml do Perm 1X / Tampão de lavagem para 10 minutos a 4 ° C no escuro.
- Posteriormente, as células foram incubadas com o adequadamente titulada FITC-rotuladas anti-IFN-γ (B27) e PE-rotuladas anti-IL-2 (MQ1-17H12) durante 60 minutos a 4 ° C no escuro.
- Em seguida, as células foram lavadas mais duas vezes com a solução de permeabilização
- Após a última lavagem, as células foram re-suspensas em paraformaldeído 1% em DPBS e submetidas a análise de citometria de fluxo em 24 horas.
4. Citometria de fluxo
- As células coradas foram adquiridos em um fluxo de LSR citómetro II (BD Biosciences, San Jose, CA) ou ADP Ciano (Dako, Carpinteria, CA). FACS dados foram analisados usando programa FlowJo (Árvore Star, Ashland, OR).
- Figura. 1 mostra o esquema de propagação utilizados para as análises dos subconjuntos diferentes de células T de um animal representativo. Os linfócitos foram os primeiros gated via dispersão para a frente (FSC) versus dispersão lateral (SSC), e, em seguida, linfócitos vivos foram identificados com base em SSC e aqua-negativos população. As células T foram positivamente identificados pela expressão CD3 seguido pela detecção do CD4 + CD8-(CD4 + T cells) e CD4-CD8 + (células T CD8 +) populações, dentro do CD3 + T população celular. O CD4 + e CD8 + T foram ainda distinguidos em subconjuntos diferentes com base em CD28 e CD95 expressão como ingênuo (Tn, CD28 + CD95-), a memória central (Tcm, CD28 + CD95 +) e memória efetora (Tem, CD28-CD95 +) células como descrito na literatura 5, 10.
- Figura. 2 mostra como os diferentes subgrupos de células T CD4 + e CD8 + T foram avaliados para a capacidade funcional em termos da produção de citocinas (INF-γ e / ou IL-2) em resposta à estimulação com PMA e ionomicina (PMA + I).
5. Representante FACS dados
PBMC composição em macacos rhesus foi determinada usando análise FACS. A Figura 1 mostra o esquema de propagação utilizados para as análises dos subconjuntos diferentes de células T de um animal representativo. Os linfócitos foram os primeiros gated via dispersão para a frente (FSC) versus dispersão lateral (SSC), e, em seguida, linfócitos vivos foram identificados com base em SSC e aqua-negativos população. As células T foram identificadas por CD3 expressão. CD4 + CD8-(as células CD4 + T) e CD4-CD8 + (células T CD8 +) populações, dentro do CD3 + T população celular também foram determinados. Conforme mostrado na Figura 2, o CD4 + e CD8 + T foram ainda distinguidos em subconjuntos diferentes com base em CD28 e CD95 expressão como ingênuo (CD28 Tn, + CD95), a memória central (Tcm, CD28 + CD95 +) e memória efetora (Tem, CD28-CD95 +) células. Figura 2A mostra INF-γ e IL-2 de produção em CD4 unstimulated e PMA / ionomicina estimulado + células T e subconjuntos, e Figura 2B mostra INF-γ e IL-2 de produção em células não estimuladas e PMA / ionomicina estimulado CD8 + T e subconjuntos Nota dos perfis de citocinas distintas eliciada pela estimulação em cada subconjunto.
Figura 1. Gating estratégia utilizada para análise de citometria de fluxo de composição rhesus em PBMC macqaues. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada da figura 1.
Figura 2. (A) perfil de produção de citocinas CD4 + total de células T e subconjuntos. (B) perfil de produção de citocinas do total células CD8 + T e subconjuntos. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior da 2a, ou aqui para uma versão ampliada da figura 2b.
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Acknowledgments
Dr. Pramod Nehete e Sra. Bharti Nehete de sangue e amostras de PBMC macaco; Este trabalho foi parcialmente financiado com recursos do NIH AI 46969 conceder, e todos os meios de cultura de células foram produzidos pelo Laboratório Central de Mídia, que é financiado pelo NIH conceder CA 16672.
Materials
Solution and Buffers |
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Activation agents |
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Cytokine secretion inhibitors |
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Antibodies |
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References
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