Summary
نحن لشرح فائدة التدفق الخلوي متعدد الألوان مفصلة عن توصيف المظهري والوظيفية من الكل فضلا عن مجموعات فرعية من الذاكرة CD4 + CD8 + وخلايا T في المكاك وهو قرد اسيوي ، والنموذج المثالي لإجراء دراسات لقاح فيروس نقص المناعة البشرية / الإيدز.
Abstract
النموذج المكاك ريسوس حاليا أفضل نموذج المتاحة لمكافحة فيروس الإيدز فيما يتعلق بفهم المرضية فضلا عن تطوير لقاحات وعلاجات
Protocol
ويمكن تقسيم الإجراءات لتحليلات مفصلة المظهرية والوظيفية من الكل فضلا عن مجموعات فرعية من الخلايا التائية الذاكرة إلى أربعة أجزاء هي : 1) إعداد وتحفيز الخلية مستضدي ، 2) بالمتر تلطيخ علامة ، 3) بين الخلايا تلطيخ خلوى و 4) التدفق الخلوي التحليلات.
1. إعداد وتنشيط الخلايا مستضدي
- سواء طازجة معزولة فضلا عن الحفاظ على البرد استخدمت خلايا الدم المحيطية وحيدات النوى (PBMC) في هذا البروتوكول. وقد عزل من PBMC heparinized سيتراتي أو عينات الدم الوريدي من المكاك وهو قرد اسيوي بالترسيب التدرج الكثافة باستخدام Ficoll - Hypaque (Histopaquen - 1077 ، سيغما الدريخ ، وسانت لويس ، MO). كانت مخزنة Aliquots من PBMC المجمدة في السفح 90 ٪ و 10 ٪ في DMSO النيتروجين السائل.
- وعند استخدام البرد الحفاظ PBMC ، إزالة قنينة من PBMC المجمدة من النيتروجين السائل وتحسنت بسرعة في حمام الماء 37 C ، مختلطة بلطف ، وغسلها مع RPMI - 1640 (HyClone المختبرات ، لوغان ، UT) لإزالة التجمد والمتوسطة إعادة تعليق في وسائل الإعلام الكامل [CM ؛ RPMI - 1640 الملحق مع 10 ٪ للحرارة المعطل FCS (HyClone المختبرات) ، L - 2mm والجلوتامين (سيغما الدريخ) ، 100U/ml البنسلين / الستربتوميسين (Invitrogen) ، والمثقف في 6 -- كذلك لوحات زراعة الأنسجة ليلا 37 درجة مئوية في ترطيب الاجواء 5 ٪ CO 2. في صباح اليوم التالي ، تم تحديد عدد الخلايا قادرة على البقاء من خلال طريقة التريبان الأزرق الإقصاء وإعادة صبغ معلقة في CM.
- وكان يعامل بطريقة مختلفة عن الخلايا غير محددة مقابل التحفيز مستضد محدد تليها تحليلات خلوى : (أ) للحصول على التحفيز غير محددة مع phorbol 12 - 13 - myristate خلات (PMA) وIonomycin (I) (سيغما الدريخ ، وسانت وكانت مطلية لويس ، MO) ، aliquots من الخلايا في حجم 0.1ml (1.0 × 10 6 خلية / جيد) في الآبار الفردية لل96 - جيدا لوحات زراعة الأنسجة دينار بحريني (العلوم البيولوجية ، وفرانكلين البحيرة ، ونيو جيرسي). واستخدمت سلطة النقد الفلسطينية وIonomycin بتركيز نهائي 50ng/ml و500ng/ml ، على التوالي. الحجم النهائي لمجموع 96 - جيدا نسيج لوحة الثقافة 0.2ml/well : (ب) للحصول على تحفيز المستضد محددة ، كانت مطلية 1.0 × 10 6 خلايا في حجم 1.0 مل في الآبار الفردية من 24 لوحات جيدة زراعة الأنسجة دينار بحريني (العلوم البيولوجية وفرانكلين البحيرة ، نيوجيرسي) ، حيث كانت الآبار قبل المعالجة كما هو موضح سابقا مع التعديل 9. باختصار ، كانت مغلفة في زراعة الأنسجة 24 لوحات جيدة مع 2.5 ميكروغرام / مل / مفتش جيدا الماعز المضادة للماوس (H + L) (كيركيغارد وبيري مختبر ، غايثرسبيرغ ، MD) في حل تريس 50mM (PH 8.6) درجة مئوية لمدة 4 بين عشية وضحاها. أضيفت في 10 ميكروغرام / مل / يتبع بشكل جيد من قبل احتضان لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية ، وصباح اليوم التالي تم غسلها لوحات مرتين مع برنامج تلفزيوني العقيمة وشارك في تنشيطية CD49d خريطة موقع ، استنساخ 9F10 (سان خوسيه ، كاليفورنيا العلوم البيولوجية دينار بحريني) بعد الحضانة ، وغسلها لوحات مرتين مع برنامج تلفزيوني العقيمة في درجة حرارة الغرفة. تم إضافة مستضدات المصالح (بما في ذلك الكوكتيل ستة الببتيدات المغلف فيروس نقص المناعة البشرية 8 في التركيز النهائي لل10μg/ml كل الببتيد. أعدت بئرا إضافية مع الخلايا في CM بمفرده السيطرة السلبية ، والحجم النهائي لمجموع كل بئر من 24 ورفاه زراعة الأنسجة لوحة 1.0 مل.
- وكانت الخلايا المستنبتة لمدة 6 ساعات إلى 37 درجة مئوية في ترطيب الاجواء 5 ٪ CO 2. وأضاف Brefeldin A (سيغما الدريخ ، وسانت لويس ، MO) للثقافة في 10μg/ml للساعات 4.5 النهائي من التحفيز. في وقت لاحق ، تم نقل الخلايا إلى 5 أنابيب البولي بروبلين مل وغسلها بالماء البارد (4 درجات مئوية) العازلة غسل تدفق (PBS Dulbecco ل(DPBS ، كا 2 / 2 ملغ خالية ؛ التقنيات الحياتية ، روكفيل ، دكتوراه في الطب) مع 2 ٪ للحرارة المعطل FCS) ، ومعالجتها بعد ذلك لتلطيخ مع مختلف الأجسام المضادة المسماة مضان.
2. علامات سطح المناعي تلطيخ
- وكانت ملطخة first الخلايا الحية مع حفز / قتلى يمكن حلها 1ul صبغة الفلورسنت ماء رد الفعل عند 4 درجات مئوية في الظلام لمدة 30 دقيقة ، وغسلها مرة واحدة مع تدفق العازلة غسل الباردة.
- ثم ، ما يلي معاير مناسب مضان المسمى أضيفت الاجسام المضادة لخلايا : مكافحة CD3 PE - Cy7 (SP34 - 2) ، ومكافحة CD8 Alexa700 (RPA - T8) ، ومكافحة CD28 - PerCP cy5.5 (L293) ومعاداة CD95 APC (DX2) ومكافحة CD4 المحيط الهادئ (زرقاء OKT4) ، كل من العلوم البيولوجية دينار بحريني (فرانكلين البحيرة ، ونيو جيرسي) ، باستثناء CD4 الأزرق المحيط الهادئ (OKT4) من eBioscience (سان دييغو ، كاليفورنيا). وحضنت الخلايا لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية في الظلام.
- لكل تجربة كل من تعويض الضوابط ومضان ناقص واحد (FMO) الضوابط استخدمت 10،11. وقد استخدمت ضوابط لتحديد التعويض coeffecients امتداد كل فرد وصمة عار في الكشف عن الأخرى. لعناصر التعويض ، وكانت ملطخة مجموعة كاملة من الأنابيب التي تحتوي على تعليق من واحد من الخلية قرد مع الفلورسنت خريطة موقع مترافق بشكل فردي والبقع لون واحد. FMO هو مزيج متعدد الألوان تلطيخ الكواشف التي تحتوي على كافة ولكن واحدة من الفائدة ويستخدم لتحديد الحدود بين موجبالثانية بمضاعفة عدد السكان السلبية لصناعة السيارات في مضان مستوى والبيانات الموجودة في نموذج ملون بالكامل.
- تم غسلها ثم الخلايا ملطخة الباردة تدفق العازلة يغسل ، والثابتة في تثبيت / permeabilization حل دينار بحريني (العلوم البيولوجية وسان خوسيه ، كاليفورنيا) عن 10 دقائق على الأقل (في هذه المرحلة ويمكن تخزين الخلايا بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في الظلام) قبل أداء الخلايا تلطيخ خلوى.
3. جواني خلوى تلطيخ
- وجرفت المياه خلايا ثابتة مع تدفق العازلة يغسل ، وبيرم ثم / اغسل العازلة دينار بحريني (العلوم البيولوجية وسان خوسيه ، كاليفورنيا) وكان المضافة وفقا لتعليمات الصانع. لفترة وجيزة ، وحضنت الخلايا في 0.1ml من بيرم 1X / اغسل العازلة لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية في الظلام.
- لاحقا ، وحضنت الخلايا مع معاير مناسب FITC المسمى مكافحة الإنترفيرون γ (B27) والمؤسسة العامة ذات العلامات المضادة للIL - 2 (MQ1 - 17H12) لمدة 60 دقيقة على 4 درجات مئوية في الظلام.
- ثم تم غسل الخلايا اثنين من أكثر الأوقات مع حل permeabilization
- بعد غسل النهائي ، كانت الخلايا إعادة معلقة في بارافورمالدهيد 1 ٪ في DPBS وتخضع للتحليل التدفق الخلوي في غضون 24 ساعة.
4. تحليل التدفق الخلوي
- تم الحصول على الخلايا الملون تدفق عداد الكريات الثاني LSR دينار بحريني (العلوم البيولوجية وسان خوسيه ، كاليفورنيا) أو سماوي ADP (داكو ، Carpinteria ، CA). وقد تم تحليل البيانات باستخدام FACS FlowJo البرمجيات (شجرة ستار ، آشلاند ، OR).
- الرقم. 1 يبين مخطط تبوب تستخدم للتحليلات لمجموعات فرعية مختلفة من الخلايا T من حيوان ممثل. كانت الأولى عبر بوابات اللمفاويات مبعثر قدما (FSC) مقابل الجانب مبعثر (SSC) ، ومن ثم تم تحديد الخلايا الليمفاوية يعيش على أساس التعاون بين بلدان الجنوب والسكان ماء سلبية. ثم تم التعرف على الخلايا التائية التي تليها CD3 التعبير الكشف عن CD4 + CD8 - (خلايا CD4 + T) وCD4 - CD8 + (CD8 + الخلايا التائية) السكان داخل CD3 + T السكان الخلية. تميزوا كذلك CD4 + و CD8 + الخلايا التائية إلى مجموعات فرعية مختلفة على أساس CD28 والتعبير CD95 بأنه ساذج (تينيسي ، CD28 + CD95) ، والذاكرة المركزية (الطب الصينى التقليدى ، CD28 + CD95 +) والذاكرة المستجيب (تيم ، CD28 ، CD95 +) الخلايا كما ووصف في الأدبيات 5 ، 10.
- الرقم. 2 يوضح كيف تم تقييم مجموعات فرعية مختلفة من خلايا CD4 + و CD8 + الخلايا التائية للقدرة وظيفية من حيث الإنتاج خلوى (INF - γ و / أو IL - 2) ردا على التحفيز مع سلطة النقد الفلسطينية وionomycin (PMA + I).
5. ممثل FACS البيانات
وقد تقرر تشكيل PBMC المكاك وهو قرد اسيوي في استخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية التحليل. الشكل 1 يبين مخطط تبوب تستخدم للتحليلات لمجموعات فرعية مختلفة من الخلايا T من حيوان ممثل. كانت الأولى عبر بوابات اللمفاويات مبعثر قدما (FSC) مقابل الجانب مبعثر (SSC) ، ومن ثم تم تحديد الخلايا الليمفاوية يعيش على أساس التعاون بين بلدان الجنوب والسكان ماء سلبية. ثم تم تحديد الخلايا T التي CD3 التعبير. CD4 + CD8 - (خلايا CD4 + T) وCD4 - CD8 + (CD8 + الخلايا التائية) السكان داخل CD3 + T وجرى أيضا تحديد عدد الخلايا. وكما هو مبين في الشكل 2 ، وتتميز كذلك CD4 + و CD8 + الخلايا التائية إلى مجموعات فرعية مختلفة على أساس CD28 والتعبير CD95 باسم (CD28 تينيسي ، + CD95) السذاجة ، والذاكرة المركزية (الطب الصينى التقليدى ، CD28 + CD95 +) والذاكرة المستجيب (تيم ، CD28 - CD95 +) الخلايا. الشكل 2A يظهر INF - γ وIL - 2 الإنتاج في CD4 unstimulated وحفزت PMA / ionomycin + الخلايا التائية ، وفرعية ، و 2B ويبين الشكل INF - γ وIL - 2 الإنتاج في الخلايا التائية unstimulated وسلطة النقد الفلسطينية / ionomycin حفز CD8 + ، ومجموعات فرعية لاحظ ملامح متميزة خلوى التحفيز التي تسببها في كل مجموعة فرعية.
الشكل 1. المحاصرة الاستراتيجية المستخدمة لتحليل تدفق cytometric تكوين PBMC في macqaues الريسوسي. الرجاء انقر هنا لرؤية نسخة أكبر من الرقم 1.
الشكل 2. (A) سايتوكاين التعريف إنتاج CD4 + مجموع الخلايا التائية وفرعية (B) لمحة من إجمالي إنتاج السيتوكينات الخلايا التائية CD8 + ومجموعات فرعية. الرجاء انقر هنا لرؤية نسخة أكبر من 2A ، أو هنا لنسخة أكبر من الرقم 2B.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
الدكتور برامود Nehete والسيدة Nehete بهارتي للدماء وعينات المكاك PBMC ؛ وأيد هذا العمل جزئيا من أموال منحة من المعاهد القومية للصحة رقم 46969 ، وأنتجت كل خلية ثقافة وسائل الإعلام من قبل وسائل الإعلام مختبر المركزي ، الذي تموله المعاهد الوطنية للصحة منح CA 16672.
Materials
Solution and Buffers |
|||
|
|||
Activation agents |
|||
|
|||
Cytokine secretion inhibitors |
|||
|
|||
Antibodies |
|||
|
References
- Ogg, G. S. Quantitation of HIV-1-specific cytotoxic T lymphocytes and plasma load of viral RNA. Science. 279, 2103-2106 (1998).
- Borrow, P., Lewicki, H., Hahn, B. H., Shaw, G. M., Oldstone, M. B. Virus-specific CD8+ cytotoxic T-lymphocyte activity associated with control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 infection. J Virol. 68, 6103-6110 (1994).
- Koup, R. A. Temporal association of cellular immune responses with the initial control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 syndrome. J Virol. 68, 4650-4655 (1994).
- Walker, J. M., Maecker, H. T., Maino, V. C., Picker, L. J. Multicolor flow cytometric analysis in SIV-infected rhesus macaque. Methods Cell Biol. 75, 535-557 (2004).
- Pitcher, C. J. Development and homeostasis of T cell memory in rhesus macaque. J Immunol. 168, 29-43 (2002).
- Jung, T., Schauer, U., Heusser, C., Neumann, C., Rieger, C. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. J Immunol Methods. 159, 197-207 (1993).
- Keeney, T. S., Nomura, L. E., Maecker, H. T., Sastry, K. J. Flow cytometric analysis of macaque whole blood for antigen-specific intracellular cytokine production by T lymphocytes. J Med Primatol. 32, 23-30 (2003).
- Gauduin, M. C. Optimization of intracellular cytokine staining for the quantitation of antigen-specific CD4+ T cell responses in rhesus macaques. J Immunol Methods. 288, 61-79 (2004).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J Immunol Methods. 243, 77-97 (2000).
- De Rosa, S. C., Herzenberg, L. A., Roederer, M. 11-color 13-parameter flow cytometry: identification of human naive T cells by phenotype, function, and T-cell receptor diversity. Nat Med. 7, 245-248 (2001).
- Tung, J. W., Parks, D. R., Moore, W. A., Herzenberg, L. A. New approaches to fluorescence compensation and visualization of FACS data. Clin Immunol. 110, 277-283 (2004).
