Summary
我们展示了总额以及记忆CD4 +和CD8 + T细胞在猕猴，艾滋病毒/艾滋病疫苗研究的理想模型的子集的详细的表型和功能特性的多色流式细胞仪的实用。
Abstract
猕猴模型是目前最好的艾滋病毒和艾滋病的模型，了解其发病机制，以及疫苗和疗法的发展
Protocol
总额以及记忆T细胞子集的表型和功能的详细分析的程序可分为四个部分：1）细胞的制备及抗原刺激，2）表面标志物染色，3）细胞内细胞因子染色和4）流式细胞仪分析。
1。细胞的制备及抗原刺激
- 既新鲜分离以及冷冻保存外周血单个核细胞（PBMC）的，在此协议使用。肝素或枸橼酸恒河猴静脉血液样本中分离的外周血单核细胞密度梯度沉淀，使用聚蔗糖- Hypaque（Histopaquen - 1077，Sigma - Aldrich公司，圣路易斯，密苏里州）。存储在90％FCS的PBMC等分10％，在液氮冷冻和二甲基亚砜。
- 使用冷冻保存外周血单个核细胞时，从液氮冷冻PBMC瓶在37℃水浴中迅速解冻，轻轻混合，用RPMI - 1640（Hyclone公司实验室，洛根，UT）洗去冻结中期和完整的媒体重新悬浮厘米; RPMI - 1640具有10％的补充热灭活FCS（Hyclone公司实验室），2mm的L -谷氨酰胺（Sigma - Aldrich公司），100U/ml青霉素/链霉素（Invitrogen公司），并于6培养 - 以及组织培养板在37℃过夜彗星在饱和湿度5％的CO 2气氛。第二天早晨，活细胞计数测定台盼蓝染料排斥法和重新悬浮在CM。
- 细胞治疗非特异性与抗原特异性刺激因子分析其次是不同的：（一）非特异性刺激与佛波醇-12 - 肉豆蔻酯（PMA）和离子霉素（一）（Sigma - Aldrich公司，圣路易斯，MO），分装在体积的0.1毫升细胞（1.0 × 10 6细胞/孔）接种在96孔组织培养板（BD公司），新泽西州富兰克林湖，个别井。 PMA和离子霉素，分别用于在终浓度为50ng/ml和500ng/ml。 96孔组织培养板的最终总量0.2ml/well：（B）抗原特异性刺激，1.0 × 10 6卷1.0毫升的细胞在24孔组织培养板中的个别井（BD公司镀，新泽西州富兰克林湖），井前视为与修改9。简言之，在24孔组织培养板涂有2.5微克/毫升/以及羊抗鼠IgG（H + L）（克尔凯郭尔和佩里实验室，马里兰州盖瑟斯堡）在50毫米的Tris溶液（PH值8.6），4 ° C过夜。第二天早上板块洗净，用无菌PBS和协同刺激单克隆抗体的表达CD49d，克隆9F10（BD Biosciences公司;加利福尼亚州圣何塞）两次，分别加入10微克/毫升/以及随后一小时的孵化，在37 ° C。孵化后，用无菌PBS洗涤板在室温下的两倍。利益抗原（包括6个HIV包膜肽 8鸡尾酒添加的每个肽的终浓度为10μg/ml。附加井仅在CM细胞作为阴性对照准备最后的总体积为每孔24孔组织培养板为1.0 ml。
- 细胞培养6小时，在37 ° C的饱和湿度5％的CO 2气氛。 Brefeldin一（Sigma - Aldrich公司，圣路易斯，密苏里州）在10μg/ml的文化，为最后的4.5小时的刺激。随后，细胞被转移到5毫升聚丙烯管洗净，用冷（4 °彗星）流洗缓冲液（贝科的PBS（，钙2 /镁2 -免费DPBS Life技术“，罗克维尔，医师）用2％热灭活FCS），然后与不同的荧光标记抗体染色处理。
2。免疫表面标志物的染色
- 1ul活/死可以解决旱厕荧光活性染料染色刺激细胞在4 ° C的黑暗30分钟，洗后用冷水流缓冲液洗一次。
- 然后，下面的适当滴定，荧光标记的单克隆抗体细胞：抗CD3 PE - Cy7（SP34 - 2），抗- CD8 Alexa700（RPA - T8），抗CD28 PerCP cy5.5（L293）抗CD95的APC（DX2）和抗CD4太平洋蓝（OKT4），所有自BD Biosciences公司（新泽西州富兰克林湖，），除CD4 +，太平洋蓝（OKT4）从eBioscience公司（加利福尼亚州圣迭戈）。细胞孵育30分钟，在4 ° C，在黑暗中。
- 对于每个实验10,11利用补偿控制和荧光减一（FMO）的控制。利用补偿控制，以确定每一个人的染色到其他探测器的外溢coeffecients。补偿控制，一套完整的含有猴细胞悬浮液管与荧光标记的单克隆抗体染色，单独作为单一颜色的污渍。鱼类统营处是一个多色染色的组合，包含所有的试剂，而是一个利益，是用来确定之间的边界通过复制自体荧光的水平和数据的正面和负面的人口目前在完全染色的样本。
- 染色的细胞，然后用冷水流缓冲液洗的洗，和固定在固定/通透的解决方案（BD Biosciences公司;加利福尼亚州圣何塞）（在这个阶段的细胞，可存储在一夜之间在4 ° C黑暗环境中至少10分钟）然后进行细胞内细胞因子染色。
3。细胞内细胞因子染色
- 固定与流动缓冲液洗洗涤细胞，然后烫/洗涤液（BD Biosciences公司;加利福尼亚州圣何塞）是根据制造商的说明补充。简单地说，细胞培养1X烫/缓冲液洗为10分钟，在4 ° C黑暗环境中0.1毫升。
- 随后，细胞培养与适当滴定的FITC标记的抗干扰素γ（B27）和PE标记的抗IL - 2为60分钟（MQ1 - 17H12）4 ° C黑暗环境中。
- 那么细胞洗两次与通透的解决方案
- 最后一次洗涤后，将细胞重新悬浮在1％多聚甲醛在DPBS和24小时内遭受流式细胞仪分析。
4。流式细胞仪分析
- 染色的细胞获得一个LSR II流式细胞仪（BD公司，加利福尼亚州圣何塞）或青色ADP（DAKO，Carpinteria的CA）。通过使用FlowJo软件（树星，亚什兰，或），流式细胞仪数据分析。
- 图。 1显示了具有代表性的动物，从不同的T细胞亚群的分析利用浇注计划。首先通过前向散射（FSC）与侧散射（SSC），门控的淋巴细胞，再活的淋巴细胞被确定基于SSC和水产人口负。 T细胞，然后验明正身由检测的CD4 + CD8 -（CD4 + T细胞），CD3 +表达和CD4 - CD8 +（CD8 + T细胞）的种群内的CD3 + T细胞的人口。的CD4 +和CD8 + T细胞被进一步区分到不同的子天真（TN，CD28 + CD95 -），中央内存（TCM，CD28 + CD95 +）和效应记忆体（TEM，CD28 - CD95 +）细胞为CD28和CD95表达的基础上在文学5日，10所述。
- 图。 2如何CD4 +和CD8 + T细胞不同亚群细胞因子的产生，在刺激与PMA和离子霉素（PMA + I）（IFN -γ和/或IL - 2）功能的能力进行评估。
5。代表流式细胞仪数据
恒河猴外周血单个核细胞组成，使用流式细胞仪分析来确定。图1显示了门控计划为代表的动物从一个不同的T细胞亚群的分析利用。首先通过前向散射（FSC）与侧散射（SSC），门控的淋巴细胞，再活的淋巴细胞被确定基于SSC和水产人口负。 CD3 +表达的T细胞，然后确定。 CD4 + CD8 -（CD4 + T细胞）和CD4 - CD8 +（CD8 + T细胞）的种群内的CD3 + T细胞的人口也决心。图2所示的CD4 +和CD8 + T细胞进一步区分到不同的子集的CD28和CD95表达的幼稚（TN，CD28 + CD95 -），中央内存（TCM，CD28 + CD95 +）和效应记忆体（TEM的基础上， CD28 - CD95 +）细胞。图2A显示IFN -γ和IL - 2在未刺激和PMA /离子霉素刺激CD4 + T细胞及亚群，和图2B生产显示的INF -γ和IL - 2在未刺激和PMA /离子霉素刺激CD8 + T细胞的生产，和亚群注意：在每个子集，不同的细胞因子刺激引起的。
图1。浇注流流式细胞仪分析外周血单个核细胞组成的战略在恒河猴macqaues
图2。 （一）总的CD4 + T细胞亚群。细胞因子生产概况（二）总CD8 + T细胞及亚群细胞因子的生产概况。
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Acknowledgments
普拉莫德Nehete博士和夫人Bharti公司Nehete猕猴血液和PBMC样品;部分支持这项工作是由美国国立卫生研究院授予的AI 46969资金，所有的细胞培养基，由中央媒体实验室，这是由美国国立卫生研究院授予CA资助16672。
Materials
Solution and Buffers |
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Activation agents |
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Cytokine secretion inhibitors |
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Antibodies |
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References
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