Summary
Tonen we het nut van multicolor flowcytometrie voor gedetailleerde fenotypische en functionele karakterisering van het totaal en als het geheugen subsets van CD4 + en CD8 + T-cellen in rhesus makaken, het ideale model voor HIV / AIDS-vaccin studies.
Abstract
Het rhesus makaak model is momenteel de best beschikbare model voor HIV-AIDS met betrekking tot het begrijpen van de pathogenese, alsmede voor de ontwikkeling van vaccins en therapeutica
Protocol
De procedures voor de gedetailleerde fenotypische en functionele analyse van het totaal en als het geheugen subsets van T-cellen kan worden onderverdeeld in vier delen: 1) Cel voorbereiding en antigene stimulatie, 2) Oppervlakte marker kleuring, 3) Intracellulaire cytokine kleuring en 4) Flowcytometrie analyses.
1. Celpreparaat en antigene stimulatie
- Zowel vers geïsoleerde als cryo bewaard gebleven perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC) werden gebruikt in dit protocol. De PBMC werden geïsoleerd uit gehepariniseerd of gecitreerd veneuze bloedmonsters van rhesus makaken door dichtheidsgradiënt bezinking met behulp van Ficoll-Hypaque (Histopaquen-1077, Sigma-Aldrich, ST. Louis, MO). Hoeveelheden van PBMC werden bevroren bewaard in 90% FCS en 10% DMSO in vloeibare stikstof.
- Bij gebruik van de cryo-bewaarde PBMC werden de flesjes van bevroren PBMC verwijderd van vloeibare stikstof en snel ontdooid in een 37 ° C waterbad, voorzichtig gemengd, gewassen met RPMI-1640 (Hyclone laboratoria, logan, UT) op de bevriezing medium en te verwijderen geresuspendeerd in complete media [CM, RPMI-1640 aan te vullen met 10% hitte-geïnactiveerd FCS (Hyclone laboratoria), 2 mM L-glutamine (Sigma-Aldrich), 100U/ml penicilline / streptomycine (Invitrogen), en gekweekt in 6 - goed weefselkweek plaatjes gedurende een nacht bij 37 ° C in een bevochtigde 5% CO 2 atmosfeer. De volgende ochtend werden de levensvatbare cellen wordt bepaald door de trypan-blauwe kleurstof uitsluiting methode en opnieuw gesuspendeerd in CM.
- De cellen werden anders behandeld voor niet-specifieke versus antigeen-specifieke stimulatie, gevolgd door cytokine analyse: (a) Voor niet-specifieke stimulatie met forbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA) en ionomycine (I) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), porties van cellen in een volume van 0,1 ml (1,0 x 10 6 cellen / putje) werden uitgeplaat in individuele putjes van 96-well kultuur platen (BD Biosciences, Franklin meer, NJ). De PMA-en ionomycine werden gebruikt bij een uiteindelijke concentratie van 50ng/ml en 500ng/ml, respectievelijk. De uiteindelijke totale volume voor 96-well weefselkweek plaat is 0.2ml/well: (b) voor antigeen specifieke stimulatie, 1,0 x 10 6 cellen in een volume van 1,0 ml werden uitgeplaat in afzonderlijke putjes van 24-well kultuur platen (BD Biosciences , Franklin meer, NJ), waar de putjes werden voorbehandeld zoals eerder beschreven met modificatie 9. In het kort werden de 24-well kultuur platen bekleed met 2,5 ng / ml / putje geit anti-muis IgG (H + L) (Kierkegaard en Perry Laboratorium, Gaithersburg, MD) in 50 mM Tris-oplossing (pH 8,6) voor de 4 ° C 's nachts. De volgende ochtend de platen twee keer werden gewassen met steriele PBS en co-stimulerende mAb CD49d, kloon 9F10 (BD Biosciences, San Jose, CA) werd toegevoegd bij 10 ug / ml / putje, gevolgd door incubatie gedurende een uur bij 37 ° C. Na de incubatie werden de platen twee keer gewassen met steriele PBS bij kamertemperatuur. De antigenen van belang (inclusief cocktail van zes HIV enveloppe peptiden 8 toegevoegd bij een uiteindelijke concentratie van 10μg/ml van elk peptide. Aanvullende putten met cellen in CM alleen waren bereid als negatieve controle. De uiteindelijke totale volume voor elke well van de 24 -well weefselkweek plaat werd 1,0 ml.
- De cellen werden gekweekt gedurende 6 uur bij 37 ° C in een bevochtigde 5% CO 2 atmosfeer. Brefeldine A (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) werd toegevoegd aan de cultuur aan 10μg/ml voor de laatste 4,5 uur van de stimulatie. Vervolgens werden de cellen overgebracht naar 5 ml polypropyleen buizen en gewassen met koud (4 ° C) stroom wasbuffer (Dulbecco's PBS (DPBS, Ca 2 / Mg 2-vrij; Life Technologies, Rockville, MD) met 2% hitte-geïnactiveerd FCS), en vervolgens verwerkt voor kleuring met de verschillende fluorescentie gelabelde antilichamen.
2. Immunofluorescentie oppervlakte markers vlekken
- Gestimuleerde cellen werden voor het eerst gekleurd met 1ul live / dead Muur aqua fluorescente kleurstof reactief bij 4 ° C in het donker gedurende 30 minuten, eenmaal gewassen met koude stroming was buffer.
- Vervolgens wordt de volgende juiste getitreerd fluorescentie-gelabelde monoklonale antilichamen werden toegevoegd aan de cellen: anti-CD3 PE-Cy7 (SP34-2), anti-CD8 Alexa700 (RPA-T8), anti-CD28 PerCP-cy5.5 (L293) , anti-CD95 APC (DX2) en anti CD4 Pacific Blue (OKT4), alle van BD Biosciences (Franklin meer, NJ), met uitzondering van CD4 Pacific Blue (OKT4) van eBioscience (San Diego, CA). De cellen werden gedurende 30 minuten bij 4 ° C in het donker.
- Voor elk experiment zowel de vergoeding regelt en fluorescentie minus een (FMO) controles 10,11 werden gebruikt. Compensatie controles werden gebruikt om de spillover coeffecients van elke individuele vlek in andere detectors te bepalen. Voor de vergoeding regelt, werd een complete set van buizen met celsuspensies van een van de aap gekleurd met tl-geconjugeerde mAb als een enkel kleur vlekken. FMO is een veelkleurige vlekken combinatie die alle reagentia, maar die van belang bevat en wordt gebruikt om de grens tussen een positief een te bepalennd negatieve bevolking door te dupliceren auto-fluorescentie en de gegevens aanwezig zijn in volledig gekleurd monster.
- Gekleurde cellen werden vervolgens gewassen met koude stroom wasbuffer, en vast in de fixatie / permeabilisatie oplossing (BD Biosciences, San Jose, CA) gedurende ten minste 10 minuten (in dit stadium kunnen de cellen 's nachts worden opgeslagen bij 4 ° C in het donker) voordat u intracellulaire cytokine kleuring.
3. Intracellulaire cytokine kleuring
- Vaste cellen werden gewassen met stroom wasbuffer, en vervolgens Perm / Wash buffer (BD Biosciences, San Jose, CA) werd toegevoegd volgens de instructies van de fabrikant. In het kort werden de cellen geïncubeerd in 0,1 ml van de 1X Perm / Wash buffer gedurende 10 minuten bij 4 ° C in het donker.
- Vervolgens werden de cellen geïncubeerd met de juiste getitreerd FITC-gelabeld anti-IFN-γ (B27) en PE-gelabelde anti-IL-2 (MQ1-17H12) gedurende 60 minuten bij 4 ° C in het donker.
- Dan is de cellen werden gewassen nog twee keer met de permeabilisatie oplossing
- Na de laatste wasbeurt, de cellen werden opnieuw gesuspendeerd in 1% paraformaldehyde in DPBS en onderworpen aan flowcytometrie-analyse binnen 24 uur.
4. Flowcytometrie-analyse
- De gekleurde cellen werden verkregen op een LSR II flowcytometer (BD Biosciences, San Jose, CA) of cyaan ADP (Dako, Carpinteria, CA). FACS data werden geanalyseerd door gebruik te maken FlowJo software (Tree Star, Ashland, OR).
- Figuur. 1 toont de gating regeling gebruikt voor de analyses van de verschillende T-cel subsets van een vertegenwoordiger dier. De lymfocyten werden voor het eerst een gesloten via voorwaartse verstrooiing (FSC) versus kant verstrooiing (SSC), en dan live-lymfocyten werden geïdentificeerd op basis van SSC en aqua-negatieve populatie. De T-cellen werden vervolgens positief geïdentificeerd door CD3 uitdrukking gevolgd door de detectie van de CD4 + CD8-(CD4 + T cellen) en CD4-CD8 + (CD8 + T-cellen) populaties in het CD3 + T-cel populatie. De CD4 + en CD8 + T-cellen werden verder onderscheiden in verschillende subgroepen, op basis van CD28 en CD95 expressie als naïef (Tn, CD28 + CD95-), centrale geheugen (TCM, CD28 + CD95 +) en de effector geheugen (Tem, CD28-CD95 +) cellen als in de literatuur beschreven 5, 10.
- Figuur. 2 laat zien hoe de verschillende subsets van CD4 + en CD8 + T-cellen werden beoordeeld op functionele capaciteit in termen van cytokine productie (INF-γ en / of IL-2) in reactie op stimulatie met PMA en ionomycine (PMA + I).
5. Vertegenwoordiger van FACS data
PBMC compositie in rhesus makaken werd bepaald met behulp van FACS-analyse. Figuur 1 toont de gating regeling gebruikt voor de analyses van de verschillende T-cel subsets van een vertegenwoordiger dier. De lymfocyten werden voor het eerst een gesloten via voorwaartse verstrooiing (FSC) versus kant verstrooiing (SSC), en dan live-lymfocyten werden geïdentificeerd op basis van SSC en aqua-negatieve populatie. De T-cellen werden vervolgens geïdentificeerd door CD3 expressie. CD4 + CD8-(CD4 + T cellen) en CD4-CD8 + (CD8 + T-cellen) populaties in het CD3 + T-cel populatie werden ook bepaald. Zoals weergegeven in figuur 2, werden de CD4 + en CD8 + T-cellen verder onderscheiden in verschillende subgroepen, op basis van CD28 en CD95 expressie als naïef (Tn, CD28 + CD95-), centrale geheugen (TCM, CD28 + CD95 +) en de effector geheugen (Tem, CD28-CD95 +) cellen. Figuur 2A toont INF-γ en IL-2 productie in ongestimuleerde en PMA / ionomycine gestimuleerd CD4 + T-cellen, en subsets, en figuur 2B toont INF-γ en IL-2 productie in ongestimuleerde en PMA / ionomycine gestimuleerd CD8 + T-cellen, en subsets Let op de verschillende cytokine profielen opgewekt door stimulatie in elke subset.
Figuur 1. Poortsignalen strategie gebruikt voor flowcytometrische analyse van PBMC compositie in rhesus macqaues. Gelieve Klik hier voor een grotere versie van figuur 1 te zien.
Figuur 2. (A) cytokine productie profiel van het totaal CD4 + T-cellen en subsets. (B) cytokine productie profiel van het totaal CD8 + T-cellen en subsets. Gelieve Klik hier om een grotere versie van 2a, zie of hier voor een grotere versie van figuur 2b.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dr Pramod Nehete en mevrouw Bharti Nehete voor makaken bloed-en PBMC monsters; Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de middelen van NIH subsidie AI 46969, en al de celkweek media werden geproduceerd door het Centraal Media Laboratory, dat wordt gefinancierd door NIH subsidie CA 16672.
Materials
Solution and Buffers |
|||
|
|||
Activation agents |
|||
|
|||
Cytokine secretion inhibitors |
|||
|
|||
Antibodies |
|||
|
References
- Ogg, G. S. Quantitation of HIV-1-specific cytotoxic T lymphocytes and plasma load of viral RNA. Science. 279, 2103-2106 (1998).
- Borrow, P., Lewicki, H., Hahn, B. H., Shaw, G. M., Oldstone, M. B. Virus-specific CD8+ cytotoxic T-lymphocyte activity associated with control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 infection. J Virol. 68, 6103-6110 (1994).
- Koup, R. A. Temporal association of cellular immune responses with the initial control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 syndrome. J Virol. 68, 4650-4655 (1994).
- Walker, J. M., Maecker, H. T., Maino, V. C., Picker, L. J. Multicolor flow cytometric analysis in SIV-infected rhesus macaque. Methods Cell Biol. 75, 535-557 (2004).
- Pitcher, C. J. Development and homeostasis of T cell memory in rhesus macaque. J Immunol. 168, 29-43 (2002).
- Jung, T., Schauer, U., Heusser, C., Neumann, C., Rieger, C. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. J Immunol Methods. 159, 197-207 (1993).
- Keeney, T. S., Nomura, L. E., Maecker, H. T., Sastry, K. J. Flow cytometric analysis of macaque whole blood for antigen-specific intracellular cytokine production by T lymphocytes. J Med Primatol. 32, 23-30 (2003).
- Gauduin, M. C. Optimization of intracellular cytokine staining for the quantitation of antigen-specific CD4+ T cell responses in rhesus macaques. J Immunol Methods. 288, 61-79 (2004).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J Immunol Methods. 243, 77-97 (2000).
- De Rosa, S. C., Herzenberg, L. A., Roederer, M. 11-color 13-parameter flow cytometry: identification of human naive T cells by phenotype, function, and T-cell receptor diversity. Nat Med. 7, 245-248 (2001).
- Tung, J. W., Parks, D. R., Moore, W. A., Herzenberg, L. A. New approaches to fluorescence compensation and visualization of FACS data. Clin Immunol. 110, 277-283 (2004).
