Summary
Demostrar la utilidad de la citometría de flujo multicolor para la caracterización detallada fenotípica y funcional de la total, así como la memoria subconjuntos de células CD4 + y CD8 + T en macacos rhesus, el modelo ideal para estudios de vacunas contra el VIH / SIDA.
Abstract
El modelo de macaco rhesus es actualmente el mejor modelo disponible para el VIH-SIDA con respecto a la comprensión de la patogénesis, así como para el desarrollo de vacunas y terapias
Protocol
Los procedimientos para el análisis detallado fenotípica y funcional de la total, así como subconjuntos de células T de memoria se puede dividir en cuatro partes: 1) la preparación celular y la estimulación antigénica, 2) tinción de la superficie marcador, 3) tinción intracelular de citoquinas y 4) La citometría de flujo análisis.
1. Preparación de células y la estimulación antigénica
- Ambos recién aisladas, así como la crio-preservado las células mononucleares de sangre periférica (CMSP) se utilizaron en este protocolo. El PBMC fueron aisladas de muestras de sangre venosa heparinizada o con citrato de macacos rhesus por sedimentación en gradiente de densidad con Ficoll-Hypaque (Histopaquen-1077, Sigma-Aldrich, ST. Louis, MO). Alícuotas de CMSP se almacenan congelados en el 90% de FCS y DMSO al 10% en nitrógeno líquido.
- Cuando se utiliza la crio-preservado PBMC, las copas de helado PBMC fueron retirados de nitrógeno líquido y se descongelan rápidamente en un baño de agua a 37 C, se mezclan suavemente, se lavaron con RPMI-1640 (Hyclone Laboratories, Logan, UT) para eliminar el medio de congelación y resuspendidas en medio completo [CM; RPMI-1640 con suplemento del 10% FCS inactivado por calor (Hyclone Laboratories), 2 mM L-glutamina (Sigma-Aldrich), 100U/ml penicilina / estreptomicina (Invitrogen), y se cultivan en 6 - y placas de cultivo de tejido durante la noche a 37 ° C en un humidificado 5% de CO2 la atmósfera. A la mañana siguiente, los recuentos de células viables se determinó por el método de exclusión tripano-colorante azul y re-suspendido en el CM.
- Las células fueron tratadas de forma diferente para no específica contra antígenos específicos de estimulación seguido por análisis de citoquinas: (a) Por no específicos de la estimulación con forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) e ionomicina (I) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), alícuotas de las células en un volumen de 0,1 ml (1,0 x 10 6 células / pocillo) se colocaron en los distintos pozos de 96 placas de cultivo tisular (BD Biosciences, Franklin Lake, Nueva Jersey). El PMA e ionomicina se utilizaron a una concentración final de 50ng/ml y 500ng/ml, respectivamente. El volumen total final de 96 y placa de cultivo de tejidos es 0.2ml/well: (b) Para la estimulación antígeno específico, 1,0 x 10 6 células en un volumen de 1,0 ml se colocaron en los distintos pozos de 24 y placas de cultivo de tejidos (BD Biosciences , Franklin Lake, Nueva Jersey), donde los pozos fueron pre-tratados como se ha descrito anteriormente con la modificación de 9. En resumen, las placas de tejido de 24 pocillos se recubrieron con 2,5 mg / ml / pocillo IgG de cabra anti-ratón (H + L) (Kierkegaard y Perry laboratorio, Gaithersburg, MD) en 50 mM Tris solución (pH 8,6) para los 4 ° C durante la noche. A la mañana siguiente las placas fueron lavadas dos veces con PBS estéril y se co-estimuladoras CD49d MAB, clon 9F10 (BD Biosciences, San Jose, CA) se añadieron a 10 mg / ml / seguido bien mediante la incubación durante una hora a 37 ° C. Después de la incubación, las placas fueron lavadas dos veces con PBS estéril a temperatura ambiente. Los antígenos de interés (incluye cóctel de seis péptidos sobre el VIH 8 se añadieron a una concentración final de 10μg/ml de cada péptido. Pozos adicionales con células en CM sólo se prepararon como control negativo. El volumen total final de cada pozo de los 24 y placa de cultivo de tejidos fue de 1,0 ml.
- Las células fueron cultivadas durante 6 horas a 37 ° C en un humidificado 5% de CO2 la atmósfera. Brefeldin A (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) se añadió a la cultura en 10μg/ml para la final de 4,5 horas de estimulación. Posteriormente, las células fueron transferidas a tubos de 5 ml de polipropileno y se lavan con agua fría (4 ° C) el flujo de tampón de lavado (PBS de Dulbecco (DPBS, Ca 2 / Mg 2 libres, Life Technologies, Rockville, MD) con 2% inactivado por calor FCS), y luego se procesa para la tinción con los distintos anticuerpos de fluorescencia etiquetados.
2. Marcadores de inmunofluorescencia tinción de la superficie
- Las células estimuladas se tiñeron primero con 1 ul en vivo / muerto corregible tinte aqua reactivos fluorescentes a 4 ° C en la oscuridad durante 30 minutos, se lava una vez con tampón de lavado en frío de flujo.
- A continuación, las siguientes apropiadamente titulada fluorescencia anticuerpos monoclonales marcados se han añadido a las células: anti-CD3 PE-Cy7 (SP34-2), anti-CD8 Alexa700 (RPA-T8), anti-CD28-PerCP Cy5.5 (L293) , anti-CD95 APC (DX2) y anti-CD4 Pacific Blue (OKT4), todos de BD Biosciences (Franklin Lake, Nueva Jersey), con excepción de CD4 Pacific Blue (OKT4) de eBioscience (San Diego, CA). Las células fueron incubadas durante 30 minutos a 4 ° C en la oscuridad.
- Para cada experimento tanto la compensación de los controles y de fluorescencia de menos uno (FMO) 10,11 controles se utilizaron. Controles de compensación se utilizaron para determinar la coeffecients desbordamiento de cada individuo mancha en otros detectores. Para los controles de compensación, un conjunto completo de tubos que contienen células en suspensión de uno de los monos fueron teñidas con fluorescente MAb conjugado de forma individual como manchas de color. FMO es una combinación de manchas multicolores que contiene todos los reactivos, pero la que le interese y se utiliza para determinar el límite entre un resultado positivo unpoblación ª negativos mediante la duplicación de autofluorescencia nivel y los datos presentes en la muestra completa de colores.
- Células teñidas fueron lavadas con buffer de lavado en frío de flujo, y se fijaron en solución de fijación / permeabilización (BD Biosciences, San Jose, CA) durante al menos 10 minutos (en esta etapa las células se pueden almacenar durante la noche a 4 ° C en la oscuridad) antes de realizar la tinción intracelular de citoquinas.
3. Tinción intracelular de citoquinas
- Las células fijadas fueron lavadas con buffer de flujo de lava, y luego de Perm / Wash buffer (BD Biosciences, San Jose, CA) se añadió de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Brevemente, las células fueron incubadas en 0,1 ml de la ondulación permanente 1X / Solución de lavado durante 10 minutos a 4 ° C en la oscuridad.
- Posteriormente, las células fueron incubadas con la adecuada valora marcado con FITC anti-IFN-γ (B27) y PE-anticuerpo anti-IL-2 (MQ1-17H12) durante 60 minutos a 4 ° C en la oscuridad.
- Luego se lavaron las células dos veces con la solución de permeabilización
- Después del último lavado, las células volvieron a ser suspendidas en el 1% de paraformaldehído en DPBS y sometidos a análisis de citometría de flujo dentro de las 24 horas.
4. Análisis por citometría de flujo
- Las células teñidas fueron adquiridas en un citómetro de flujo LSR II (BD Biosciences, San Jose, CA) o cian ADP (Dako, Carpinteria, CA). FACS datos fueron analizados mediante el uso de software FlowJo (Árbol Star, Ashland, Oregón).
- Figura. 1 muestra el esquema utilizado para la activación periódica análisis de los subconjuntos de células T diferentes de un animal representativo. Los linfocitos fueron los primeros cerrada a través de dispersión frontal (FSC) versus dispersión lateral (SSC), y luego linfocitos vivos fueron identificadas en base a cooperación Sur-Sur y la población de aqua-negativo. Las células T eran entonces identificado positivamente por CD3 expresión seguida de la detección de las células CD4 + CD8 (células T CD4 +) y CD4-CD8 + (células T CD8 +) dentro de la población CD3 + población de células T. Las células CD4 + y CD8 + T se distinguen más en diferentes subconjuntos de la base de CD28 y la expresión de CD95 como ingenuo (Tn, CD28 + CD95-), la memoria central (MTC, CD28 + CD95 +) y efectoras de memoria (Tem, CD95-CD28 +) las células, descritos en la literatura 5, 10.
- Figura. 2 muestra cómo los diferentes subgrupos de linfocitos CD4 + y CD8 + T se evaluó la capacidad funcional en términos de producción de citoquinas (INF-γ y / o IL-2) en respuesta a la estimulación con PMA e ionomicina (PMA + I).
5. Representante FACS datos
Composición PBMC en macacos rhesus se determinó mediante análisis de FACS. La figura 1 muestra el esquema utilizado para la activación periódica análisis de los subconjuntos de células T diferentes de un animal representativo. Los linfocitos fueron los primeros cerrada a través de dispersión frontal (FSC) versus dispersión lateral (SSC), y luego linfocitos vivos fueron identificadas en base a cooperación Sur-Sur y la población de aqua-negativo. Las células T fueron identificados por CD3 expresión. CD4 + CD8 (linfocitos T CD4 +) y CD4-CD8 + (células T CD8 +) dentro de la población CD3 + población de células T se determinó también. Como se muestra en la Figura 2, las células CD4 + y CD8 + T se distinguen más en diferentes subgrupos sobre la base de CD28 y la expresión de CD95 como ingenuo (Tn, CD28 + CD95-), la memoria central (MTC, CD28 + CD95 +) y efectoras de memoria (Tem, CD28-CD95 +) las células. Figura 2A muestra INF-γ y de IL-2 en las células CD4 no estimulada y estimulada PMA / ionomicina + células T y subconjuntos, y la Figura 2B muestra INF-γ y de IL-2 en estimulada y PMA / ionomicina estimula las células CD8 + T y subconjuntos Tenga en cuenta los perfiles de citoquinas distintas provocados por la estimulación en cada subgrupo.
Figura 1. Estrategia de apertura de puerta para el análisis de citometría de flujo de la composición de PBMC de rhesus macqaues. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de la figura 1.
Figura 2. (A) el perfil de producción de citocinas de los linfocitos CD4 + total de las células T y subconjuntos. (B) el perfil de producción de citocinas del total de las células T CD8 + y subconjuntos. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de la 2a, o aquí para una versión ampliada de la figura 2b.
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Acknowledgments
Dr. Pramod Nehete y la señora Bharti Nehete de sangre y muestras de PBMC macacos; Este trabajo fue financiado parcialmente con fondos del NIH AI 46969, y todos los medios de cultivo celular fueron producidos por el Laboratorio Central de los medios de comunicación, que es financiado por el NIH subvención CA 16672.
Materials
Solution and Buffers |
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Activation agents |
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Cytokine secretion inhibitors |
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Antibodies |
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References
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