Summary
우리는 총뿐만 아니라 붉은 털원숭이 짧은 꼬리 원숭이의 CD4 +와 CD8 + T 세포, HIV / AIDS 백신 연구를위한 이상적인 모델의 메모리 하위 집합에 대한 자세한 phenotypic와 기능 특성에 대한 여러 가지 빛깔의의 유동세포계측법의 유틸리티를 보여줍니다.
Abstract
붉은 털원숭이 짧은 꼬리 원숭이 모델은 현재 백신 및 치료제의 개발을위한 최상의 사용할 수있는 pathogenesis을 이해와 관련하여 HIV - AIDS에 대한 모델뿐 아니라
Protocol
1) 셀 준비와 antigenic의 자극, 2) 표면 마커 얼룩, 3) 세포 시토킨 얼룩과 4) 유동세포계측법 : 총뿐만 아니라 T 세포의 메모리 하위 집합의 세부 phenotypic 및 기능 분석에 대한 절차는 네 부분으로 나눌 수 분석합니다.
1. 세포 준비와 antigenic의 자극
- 두 신선하게 격리뿐만 아니라 cryo 보존된 말초혈 mononuclear 세포 (PBMC)가이 프로토콜에 사용되었습니다. PBMC는 Ficoll - Hypaque (Histopaquen - 1077, 시그마 - 알드리치, ST. 루이스, MO)를 사용하여 밀도 기울기 침강에 의해 붉은 털원숭이 짧은 꼬리 원숭이의 heparinized 또는 citrated 정맥의 혈액 샘플로부터 격리되었다. PBMC의 Aliquots는 90% FCS에 냉동 저장 및 액체 질소의 10 % DMSO되었습니다.
- cryo - 보존된 PBMC를 사용하는 경우, 냉동 PBMC의 유리병은 액체 질소에서 제거되었으며 신속하게 냉동 매체와를 제거하는 RPMI - 1640 (HyClone 실험실, 로건, UT)로 씻어, 부드럽게 혼합, 37 C의 물을 욕조에 해동 전체 미디어 다시 정지 [CM, 10 %로 RPMI - 1640 보충 열 inactivated FCS (HyClone 연구소), 2mM L - 글루타민 (시그마 - 알드리치), 100U/ml 페니실린 / 스트렙토 마이신 (Invitrogen), 그리고 6 교양 - 잘 조직 배양 플레이트 37 ° 하룻밤 humidified 5 % CO 2 분위기에서 C. 다음날 아침은 생균 카운트는 trypan - 청색 색소 배제 방식에 의해 결정 및 CM에서 다시 정지.
- 세포 시토킨 분석하여 다음 불특정 대 항원에 특정한 자극에 대해 다르게 대우했다 : (A) phorbol 12 - myristate와 비 특정 자극에 대한 13 아세테이트 (PMA)와 Ionomycin (I) (시그마 - 알드리치, 성 루이, MO), 0.1ml의 볼륨에있는 세포의 aliquots (1.0 X 10 6 세포 / 음)은 96 잘 조직 배양 플레이트 (BD Biosciences, 프랭클린 호수, 뉴저지)의 개별 우물에서 도금했다. PMA와 Ionomycin는 각각 50ng/ml과 500ng/ml의 최종 농도에서 사용되었습니다. 96 - 웰 조직 배양 플레이트에 대한 최종 합계 볼륨 0.2ml/well입니다 (b)는 항원 특정 자극 들어, 볼륨 1.0 ML 1.0 X 10 6 세포는 24 잘 조직 문화 판의 개별 웰스 (BD Biosciences에서 도금했다 이전 수정 9에서 설명하는 것처럼 우물은 사전 처리되었습니다 프랭클린 호수, NJ). 간단히, 24 잘 조직 문화 플레이트는 4 50mM 트리스 솔루션 2.5 μg / ML / 잘 염소 안티 - 마우스 IgG (H + L) (Kierkegaard 및 페리 연구소, 게이 더 스버그, MD) (PH 8.6)로 코팅했다 ° C 하룻밤. 접시가 멸균 PBS와 공동 stimulatory mAb CD49d, 클론 9F10 (BD Biosciences, 산호세, CA)를 두 번 씻은되었습니다 다음날 아침이 37에 한 시간 동안 잠복기 10 μg / ML에 추가 / 잘 따라했다 ° C.가 부화 후, 접시는 실온에서 멸균 PBS로 두 번 씻어했다. 여섯 HIV 봉투 펩티드 8 칵테일을 포함하여 관심이 항원은 (각 펩타이드의 10μg/ml의 최종 농도에 추가되었습니다. 혼자 CM의 세포로 추가 우물은 대조군으로 준비되었습니다. 24의 각 잘에 대한 최종 합계 볼륨 - 잘 조직 배양 플레이트 1.0 ML되었습니다.
- 세포는 37 6 시간 동안 교양되었습니다 ° C humidified 5 % CO 2 분위기 인치 Brefeldin이 (시그마 - 알드리치, 세인트 루이스, MO) 자극의 마지막 4.5 시간 10μg/ml의 문화에 추가되었습니다. 이후, 전지 5 ML의 폴리 프로필렌 튜브로 전송과 함께 세탁했다 추운 (4 ° C) 유동 세척 버퍼 (Dulbecco의 PBS (DPBS, CA 2 / MG 2 무료, 함께 생활 기술, 락빌, MD) 2퍼센트 열 inactivated FCS), 그리고 다양한 형광 라벨 항체와 얼룩을위한 처리.
2. 얼룩 Immunofluorescence 표면 마커
- 자극 세포 처음 4 1ul 죽은 / 라이브 고칠수 아쿠아 형광 반응 염료 물들일되었습니다 ° 30 분 동안 어둠 속에 C, 차가운 흐름 세척 버퍼와 한번 세탁.
- 그런 다음, 다음 적절하게 titrated 형광 - 표시 단클론 항체가 세포에 추가되었습니다 방지 인 경우에는 3 번 CD에 들어 PE - Cy7 (SP34 - 2), 안티 - CD8 Alexa700 (RPA - T8), 안티 CD28 PerCP - cy5.5 (L293) , 안티 CD95 APC (DX2) 및 안티 CD4 퍼시픽 블루 (OKT4), (샌디에고, CA) eBioscience에서 CD4 제외 BD Biosciences (프랭클린 호수, NJ)에서, 퍼시픽 블루 (OKT4). 세포는 어두운 4 30 분 ° C에 대한 incubated되었습니다.
- 각 실험에 대한 보상 컨트롤과 형광 빼기 1 (FMO) 모두 10,11가 활용되었다 제어합니다. 보정 컨트롤은 다른 메이커에 얼룩 각의 다른 일의 coeffecients을 결정하기 위해 이용되었다. 보상 컨트롤, 원숭이 중 하나에서 세포 suspensions를 포함하는 튜브의 전체 집합은 단일 색상의 얼룩으로 개별적으로 형광 복합 mAb 물들일되었습니다. FMO는 모든 시약하지만 관심 중 하나를 포함하는 여러 가지 빛깔의 얼룩의 조합이며 긍정 사이의 경계를 결정하는 데 사용됩니다자동 형광 레벨 및 데이터를 복제하여 ND 부정적인 인구는 완전히 스테인드 샘플에 존재.
- 스테인드 세포는 다음 차가운 흐름 세척 버퍼로 세탁하고, 고정 / permeabilization 솔루션 (BD Biosciences, 산호세, CA)에서 해결되었습니다 (이 단계에서 세포가 4 밤새 저장할 수 있습니다 ° C를 어둠 속에서) 적어도 10 분 동안 세포내 시토킨 얼룩을 수행하기 전에.
3. 세포내 시토킨 염색법
- 고정 전지는 유동 세척 버퍼로 씻어되었고, 다음 펌 / (BD Biosciences, 산호세, CA) 버퍼를 씻으는 제조 업체의 지시에 따라 추가되었습니다. 간단히, 세포는 1X 펌 / 4 10 분 버퍼를 씻으 ° 어둠 속에 C의 0.1ml에 incubated했다.
- 이에 따라 전지와 incubated 있던 적절 titrated FITC - 라벨 방지 IFN - γ (B27)와 PE - 라벨 4 60 분 반 IL - 2 (MQ1 - 17H12) · 어둠 속에 C.
- 그러면 세포는 permeabilization 솔루션과 두 번 더 씻어되었습니다
- 최종 세척 후, 세포가 DPBS의 1 % paraformaldehyde에 다시 정지하고 24 시간 이내에 유동세포계측법 분석의 대상이되었다.
4. 유동세포계측법 분석
- 또는 청록색 ADP (Dako, 카핀테리아, CA), 스테인드 세포는 LSR II 흐름 cytometer (산호세, CA BD Biosciences)에 인수했다. 외과 데이터는 FlowJo 소프트웨어 (트리 스타, 애쉬 랜드, OR)를 사용하여 분석되었다.
- 그림. 1 대표적인 동물에서 다른 T 세포의 하위 집합의 분석 활용 게이팅 구조를 보여줍니다. lymphocytes 앞으로 분산형 (FSC) 대 사이드 분산형 (SSC)를 통해 첫번째 문이 있었고, 다음 라이브 lymphocytes는 SSC와 아쿠아 부정적인 인구를 기반으로 식별되었습니다. 인 경우에는 3 번 CD 내의 T 세포는 다음 적극적으로 CD4의 감지 + CD8 - (CD4 + T 세포)에 의해 다음 인 경우에는 3 번 CD에 들어 표현으로 식별 및 CD4 - CD8 + (CD8 + T 세포)되었습니다 인구 + T 세포 인구. CD4 +와 CD8 + T 세포는 더 이상 순진 (TN, CD28 + CD95 -), 중앙 메모리 (TCM, CD28 + CD95 +) 및 효과기 메모리 (TEM, CD28 - CD95 +) 세포처럼 CD28과 CD95 표현에 근거하여 서로 다른 하위 집합으로 구분되었다 문학 5, 10에 설명되어.
- 그림. CD4 +와 CD8 + T 세포의 서로 다른 하위 집합은 PMA와 ionomycin (PMA + I)과 자극에 대한 응답으로 시토킨 생산의 관점에서 기능적 용량 (INF - γ 및 / 또는 IL - 2)에 대한 평가가 얼마나이 표시됩니다.
5. 대표 외과 데이터
붉은 털원숭이 짧은 꼬리 원숭이의 PBMC 구성은 외과 분석을 사용하여 결정되었다. 그림 1은 대표적인 동물에서 다른 T 세포의 하위 집합의 분석 활용 게이팅 구조를 보여줍니다. lymphocytes 앞으로 분산형 (FSC) 대 사이드 분산형 (SSC)를 통해 첫번째 문이 있었고, 다음 라이브 lymphocytes는 SSC와 아쿠아 부정적인 인구를 기반으로 식별되었습니다. T 세포는 다음 인 경우에는 3 번 CD에 들어 표현식에 의해 확인되었습니다. 인 경우에는 3 번 CD에 들어 내에서 CD4 + CD8 - (CD4 + T 세포)와 CD4 - CD8 + (CD8 + T 세포) 인구는 + T 세포 인구도 결정됩니다. 그림 2에 표시된 CD4 +와 CD8 + T 세포는 더 이상 순진 (TN, CD28 + CD95 -), 중앙 메모리 (TCM, CD28 + CD95 +) 및 효과기 메모리 (TEM로 CD28과 CD95 표현에 근거하여 서로 다른 하위 집합으로 구분되었다 CD28 - CD95 +) 세포. 그림 2A는 INF - γ를 보여줍 unstimulated 및 PMA / ionomycin 자극 CD4 + T 세포, 그리고 하위 집합, 그리고 그림 2B에서 IL - 2 생산 INF - γ와 unstimulated 및 PMA / ionomycin가 CD8을 자극 + T 세포에서 IL - 2 생산을 보여줍니다, 그리고 집합 뚜렷한 시토킨 프로파일 각 하위 집합에 자극에 의해 elicited합니다.
그림 1. 게이팅 전략은 붉은 털원숭이 macqaues의 PBMC 구성의 흐름 cytometric 분석에 사용. 하시기 바랍니다 여기를 클릭 그림 1의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.
그림 2. (A) 총 CD4 + T 세포와 하위 집합.의 시토킨 생산 프로파일 총 CD8 + T 세포와 하위 집합의 (B) 시토킨 생산 프로파일. 하시기 바랍니다 여기를 클릭하십시오 큰 2A의 버전을보고 여기 또는 그림 2B의 큰 버전에 대한.
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Acknowledgments
짧은 꼬리 원숭이 혈액과 PBMC 샘플 박사 프라 모드 Nehete 부부 바티 Nehete,이 작품은 부분적으로 NIH 부여 AI 46,969의 자금에 의해 지원되었고, 모든 세포 배양 매체는 중앙 미디어 연구소에 의해 생산되었다, NIH 부여 CA에 의해 자금 지원됩니다 16672.
Materials
Solution and Buffers |
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Activation agents |
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Cytokine secretion inhibitors |
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Antibodies |
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References
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