Summary
توضح هذه المقالة طريقة بسيطة ومنخفضة التكلفة لتسجيل سلوك تجنب العشب ل Caenorhabditis elegans ، باستخدام العناصر المتاحة بسهولة مثل الهاتف الذكي وصندوق ضوء الصمام الثنائي الباعث للضوء (LED). نوفر أيضا برنامج نصي Python لمعالجة ملف الفيديو بتنسيق أكثر قابلية للعد.
Abstract
عند التعرض للبكتيريا السامة أو المسببة للأمراض ، تظهر الديدان الخيطية Caenorhabditis elegans سلوكا مكتسبا لتجنب العشب ، حيث تترك الديدان تدريجيا مصدر غذائها وتفضل البقاء خارج العشب البكتيري. الفحص هو طريقة سهلة لاختبار قدرة الديدان على استشعار الإشارات الخارجية أو الداخلية للاستجابة بشكل صحيح للظروف الضارة. على الرغم من كونه مقايسة بسيطة ، إلا أن العد يستغرق وقتا طويلا ، لا سيما مع عينات متعددة ، وفترات الفحص التي تمتد بين عشية وضحاها غير مريحة للباحثين. يعد نظام التصوير الذي يمكنه تصوير العديد من اللوحات على مدى فترة طويلة مفيدا ولكنه مكلف. هنا ، نصف طريقة تصوير قائمة على الهاتف الذكي لتسجيل تجنب العشب في C. elegans. تتطلب الطريقة فقط هاتفا ذكيا وصندوق ضوء الصمام الثنائي الباعث للضوء (LED) ، ليكون بمثابة مصدر ضوء مرسل. باستخدام تطبيقات الكاميرا ذات الفاصل الزمني المجانية ، يمكن لكل هاتف تصوير ما يصل إلى ست لوحات ، مع وضوح وتباين كافيين لحساب الديدان يدويا خارج العشب. تتم معالجة الأفلام الناتجة في ملفات تداخل الصوت والفيديو (AVI) لمدة 10 ثوان لكل نقطة زمنية كل ساعة ، ثم يتم اقتصاصها لإظهار كل لوحة واحدة لجعلها أكثر قابلية للعد. هذه الطريقة هي طريقة فعالة من حيث التكلفة لأولئك الذين يتطلعون إلى فحص عيوب التجنب ويمكن أن تمتد إلى فحوصات C. elegans الأخرى.
Introduction
من بين المزايا العديدة لدراسة C. elegans ، يوفر نظامها العصبي البسيط الفرصة لدراسة كيفية تأثير التغييرات على المستوى الجيني والخلوي على وظيفة الشبكة والإنتاج السلوكي. على الرغم من وجود عدد محدود من الخلايا العصبية ، فإن C. elegans تعرض مجموعة واسعة من السلوكيات المعقدة. أحد هذه العوامل هو تجنب العشب ، حيث تستجيب الديدان الخيطية البكتيرية لمصدر غذائي ضار عن طريق ترك العشب البكتيري. تتجنب C. elegans مروج البكتيريا المسببة للأمراض 1،2،3 ، ومروج البكتيريا التي تنتج السموم أو ترتفع بالسموم1,4 ، وحتى البكتيريا المعبرة عن الحمض النووي الريبي التي تضر ضربة قاضية للجين المستهدف بصحة الديدان 4,5. أظهرت الدراسات أن الديدان تستجيب للإشارات الخارجية مثل المستقلبات التي تنتجها البكتيريا المسببة للأمراض 1,6 ، أو الإشارات الداخلية التي تشير إلى أن الطعام يجعلها مريضة 4,7. تتم معالجة هذه الإشارات من خلال مسارات الإشارات المحفوظة ، مثل مسار بروتين كيناز المنشط بالميتوجين (MAPK) ومسار عامل النمو المحول بيتا (TGFβ) ، وتتطلب التواصل بين الأمعاء والجهاز العصبي4،6،7،8.
على الرغم من أن الفحص بسيط ، إلا أن السلوك المكتسب يتطور على مدار ساعات عديدة ، غالبا بين عشية وضحاها. في حين أن هناك طفرات غير قادرة على المغادرة ، وفي هذه الحالة يكون تجنب التسجيل في نقطة زمنية واحدة فقط كافيا لإثبات العيب ، فإن العديد من المسوخ يغادرون في النهاية ولكنهم أبطأ في الخروج. بالنسبة لهذه ، يجب تتبع حركة الديدان كل بضع ساعات ، وهو ما قد يكون من الصعب القيام به بين عشية وضحاها. يستغرق العد نفسه أيضا وقتا ، مما يخلق وقتا متأخرا بين اللوحات ، وبالتالي يحد من عدد اللوحات التي يمكن اختبارها في نفس الوقت. سيكون استخدام إعداد التصوير لتسجيل العديد من اللوحات في وقت واحد طوال مدة الفحص مفيدا للغاية ، ولكن تكلفة الإعداد يمكن أن تكون باهظة ، اعتمادا على حالة تمويل مختبر الأبحاث.
لمعالجة هذا الأمر ، ابتكرنا طريقة بسيطة للغاية تستخدم الهواتف الذكية لتسجيل مقايسات التجنب. يمكن لكل هاتف تسجيل مقاطع فيديو بفاصل زمني تصل إلى ست لوحات فحص. لتوفير الضوء المرسل ، نستخدم صندوق ضوء الصمام الثنائي الباعث للضوء (LED) الذي يمكن شراؤه بسهولة عبر الإنترنت. يتم وضع لوحات الفحص على منصة مرتفعة ، مدعومة بأنفاق مستطيلة مجوفة ، تركز الضوء الوارد ، مما يخلق تباينا. نوفر أيضا برنامج نصي Python يحول مقاطع الفيديو إلى ملفات تداخل الصوت والفيديو (AVI) تعرض مقاطع 10 s لكل نقطة زمنية كل ساعة. ثم يتم اقتصاص مقاطع الفيديو إلى لوحات فردية وحفظها في ملفات منفصلة لاستخدامها في العد اليدوي.
توفر هذه الطريقة إجراء منخفض التكلفة سهل الاستخدام للغاية ، باستخدام عناصر متاحة بسهولة لمعظم الناس. هنا ، نصف الطريقة التي تستخدم مقايسة تجنب العشب الراسخة ضد الممرض البشري Pseudomonas aeruginosa (PA14) ، الذي تم وصف بروتوكوله سابقا 2,9. أخيرا ، نراجع أيضا اعتبارات وقيود طريقة التصوير لأولئك الذين يرغبون في تطبيقها على تجارب سلوك C. elegans الأخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد جهاز التصوير (الشكل 1A-E)
- تأكد من توفر كاميرا هاتف ذكي مع الحد الأدنى من المتطلبات التالية:
كاميرا بدقة 12 ميجابكسل
فيديو بدقة 1080 بكسل
5 غيغابايت من مساحة التخزين (20 دقيقة من الفيديو هي 3-4 غيغابايت)
تطبيق فيديو بفاصل زمني من متجر التطبيقات (تتوفر تطبيقات مجانية) - ضع صندوق إضاءة LED على الرف السفلي للحاضنة 25 درجة مئوية حيث سيتم إجراء الفحص.
- لإخفاء النمط المنقط على سطح ضوء LED ، انشر ورقتين من المناديل لتغطية كامل سطح صندوق LED.
- قم بعمل مرحلة مرتفعة للعينة (الشكل 1 أ ، د). المرحلة المرتفعة عبارة عن ورقة بلاستيكية شفافة مدعومة بأنفاق مستطيلة مجوفة. تعمل الأنفاق مثل المكثف لتركيز الضوء ، مما يوفر تباينا أفضل للعينة (الشكل 1C). تأكد من أن جدران النفق مظلمة إلى حد ما لتقليل تشتت الضوء. استخدمت هذه الدراسة صناديق ورقية بنية. أبعاد النفق 5.5 سم × 17 سم × 4.5 سم (العرض × الطول × الارتفاع). يمكن أن يتسع صندوق الإضاءة LED لما يصل إلى خمسة أنفاق.
- ضع رفا آخر فوق المسرح لوضع الهواتف للتسجيل (الشكل 1B ، E). سيسجل كل هاتف من ثلاث إلى ست لوحات (صف إلى صفين من ثلاث لوحات) ، لذا اضبط ارتفاع الحامل وفقا لذلك. سيكون هذا حوالي 15 سم فوق العينة (الشكل 1 ب).
- ضع شريط طاقة داخل الحاضنة لتوصيل الهواتف أثناء التسجيل طوال الليل.
2. إعداد المخازن المؤقتة والوسائط
- قم بإعداد المخزن المؤقت M9 بإضافة 3 جم من KH 2 PO 4 ، و 6 جم من Na 2 HPO4 ، و 5 جم من كلوريد الصوديوم إلى 1 لتر من H2O. تعقيم عن طريق التعقيم عند 121درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. قم بتبريد المخزن المؤقت ثم أضف 1 مل من 1 M MgSO4.
- قم بإعداد 1 M KPO4 buffer بإضافة 108.3 g من KH 2 PO 4 و 35.6 g من K 2 HPO4 إلى 1 L من H2O. اضبط الرقم الهيدروجيني على 6.0 بإضافةKOH. تعقيم عن طريق التعقيم.
- تحضير محلول تبييض الدودة عن طريق خلط 1 مل من المبيض ، و 0.4 مل من 1 M NaOH ، و 2.6 مل من H2O.
- تحضير لوحات أجار وسائط نمو الديدان الخيطية (NGM).
- أضف 3 جم من كلوريد الصوديوم ، و 2.5 جم من ببتون البكتو ، و 17 جم من أجار البكتو في دورق 3 لتر. أضف 975 مل من الماء المقطر وأدخل قضيب التقليب.
- تعقيم عن طريق التعقيم ، ثم تبرد إلى 55 درجة مئوية ، وإضافة 1 مل من الكوليسترول (5 ملغ / مل في الإيثانول) ، 1 مل من 1 M CaCl2 ، 1 مل من 1 M MgSO 4 ، و 25 مل من 1 M KPO4 عازلة (درجة الحموضة 6.0). يقلب ليختلط جيدا. تصب في لوحات 6 سم. دع الألواح تجف لمدة 2 أيام على الأقل.
- ألواح أجار NGM للبذور مع OP50 E. coli عن طريق سحب ما يقرب من 1 مل من ثقافة OP50 بين عشية وضحاها لتشكيل عشب من البكتيريا. اتركيه في درجة حرارة الغرفة (RT) حتى يصبح جاهزا للاستخدام.
3. تحضير ألواح NGM عالية الببتون (ل PA14)
ملاحظة: يجب عمل هذه اللوحات قبل 5 أيام على الأقل من الفحص.
- اصنع NGM يحتوي على 0.35٪ ببتون. امزج 0.3 جم من كلوريد الصوديوم ، و 0.35 جم من ببتون البكتو ، و 1.7 جم من أجار البكتو في دورق Erlenmeyer سعة 250 مل. أضف 97.5 مل من الماء المقطر وأدخل قضيب التقليب.
- غطي فم القارورة بورق الألمنيوم والأوتوكلاف على حرارة 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
- تبرد إلى 55 درجة مئوية وتضاف 0.1 مل من الكوليسترول (5 مجم / مل في الإيثانول) ، 0.1 مل من 1 M CaCl 2 ، 0.1 مل من 1 M MgSO 4 ، و2.5 مل من 1 M KPO4 buffer (درجة الحموضة 6.0). يقلب ليختلط جيدا.
- صب NGM عالي الببتون في أطباق بتري 35 مم.
- تجفيف لوحات لمدة 2 أيام على الأقل.
4. مزامنة الديدان عن طريق التبييض
ملاحظة: ابدأ هذه الخطوة قبل 3 أيام من الفحص.
- خذ الأطباق التي تحتوي على ديدان بالغة جاذبة واجمعها في أنبوب دقيق سعة 1.7 مل عن طريق غسل الألواح باستخدام المخزن المؤقت M9.
- قم بإزالة أكبر قدر ممكن من السائل ، ثم أضف 400 ميكرولتر من محلول التبييض. انتظر حوالي 4-5 دقائق مع دوامة متقطعة ، حتى تنكسر أجسام الدودة البالغة ، وتطلق البيض.
- أضف المخزن المؤقت M9 لملء بقية الأنبوب الدقيق لتخفيف محلول التبييض. تدور بأقصى سرعة (12000 إلى 13000 × جم) لمدة 1-2 ثانية. قم بإزالة المادة الطافية واغسلها ثلاث مرات أخرى باستخدام المخزن المؤقت M9.
- انقل البيض إلى طبق بتري فارغ 35 مم يحتوي على مخزن مؤقت M9. دع البيض يفقس طوال الليل عند 20 درجة مئوية. في حالة عدم وجود طعام ، ستتوقف الديدان المفرغة في مرحلة اليرقات L1 ، مما يؤدي إلى مزامنة المرحلة التنموية لجميع الديدان.
ملاحظة: طلاء طبق بتري 35 مم بمحلول الجيلاتين (0.05٪ جيلاتين في ماء معقم) يمكن أن يمنع البيض من الالتصاق بالقاع ويقلل من فقد البيض. - في اليوم التالي ، انقل ديدان المرحلة L1 إلى ألواح NGM المصنفة OP50.
- احتضان الديدان عند 20 درجة مئوية لمدة 53-54 ساعة حتى تصل الديدان إلى مرحلة اليرقات L4.
5. تحضير البكتيريا ( الزائفة الزنجارية ، PA14)
ملاحظة: ابدأ هذه الخطوة قبل 4 أيام من الفحص.
- يذوب خط البكتيريا من -80 درجة مئوية على صفيحة أجار لوريا بيرتاني (LB) بدون أي مضاد حيوي ويحتضن طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
ملاحظة: استخدم دائما البكتيريا الطازجة. يجب تخزين الألواح المخططة عند 4 °C لمدة لا تزيد عن 1 أسبوع. - قم بتلقيح مستعمرة واحدة في 3 مل من مرق الملك وتنمو طوال الليل في حاضنة اهتزاز 37 درجة مئوية.
- في اليوم التالي ، قم بزرع 7 ميكرولتر من الاستزراع الليلي على ألواح NGM عالية الببتون واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
- انقل الألواح المصنفة إلى RT واحتضانها لمدة 24 ساعة أخرى قبل الاستخدام. بمجرد أن تصبح جاهزا ، استخدم اللوحة خلال ال 24 ساعة القادمة.
6. التحضير للتسجيل
ملاحظة: افعل ذلك مباشرة قبل الفحص.
- قم بتوصيل الهاتف الذكي بمشترك الطاقة المتصل بمأخذ طاقة. تأكد من تعطيل إعداد القفل التلقائي لمنع الهاتف من العودة إلى شاشة القفل أثناء التسجيل.
- افتح تطبيق كاميرا الفاصل الزمني واضبط الفاصل الزمني على 2 ثانية. اضبط جودة الفيديو على 1080 بكسل بمعدل 30 إطارا في الثانية.
- ضع الهاتف الذكي مع توجيه الشاشة لأعلى للتسجيل باستخدام الكاميرا الخلفية. تحقق من الشاشة للتأكد من أن أنفاق الصندوق الورقي تتناسب مع مجال الرؤية.
7. مقايسة تجنب العشب
- باستخدام معول الأسلاك البلاتينية ، انقل 30 دودة مرحلة L4 متزامنة (53-54 ساعة من L1) إلى لوحة PA14. ضع الديدان في منتصف عشب البكتيريا. لكل حالة في هذه الدراسة ، تم اختبار لوحين (أي 60 دودة لكل حالة).
- ضع اللوحين على المسرح المرتفع لجهاز التسجيل بحيث يكون الغطاء متجها لأسفل. سيكون الجانب الذي يحتوي على الآجار متجها لأعلى نحو الكاميرا.
- على شاشة الهاتف الذكي ، انقر فوق مكان اللوحة ، حتى تتمكن الكاميرا من التركيز على لوحات الفحص. من المفيد أن يكون لديك ملصق أو كتابة على اللوحة حيث يمكن للكاميرا استخدام ذلك للتركيز بشكل صحيح.
ملاحظة: الكتابة على الجزء السفلي من اللوحات لا تتداخل مع تصوير الديدان طالما أنها باتجاه الحافة. لحسن الحظ ، تبقى الديدان بالقرب من العشب حتى بعد مغادرتها ، لذلك هناك حاجة فقط إلى رؤية خالية من العوائق للمنطقة المحيطة بالعشب. - ابدأ التسجيل.
- بمجرد بدء التسجيل ، أضف المزيد من اللوحات إلى المسرح. قد يكون هناك وقت تأخير كبير بين اللوحات بسبب الوقت المستغرق لنقل الديدان عن طريق الانتقاء. لاحظ وقت التأخير بعد ذلك بحيث يمكن حساب كل حالة في الوقت الذي بدأت فيه.
- سجل لمدة 20 ساعة من آخر مجموعة من اللوحات الموضوعة على المسرح. في فيديو الفاصل الزمني النهائي ، سينتج عن التسجيل 20 ساعة فيديو مدته 20 دقيقة.
ملاحظة: قد يكون من المفيد حساب الديدان مباشرة من اللوحات بعد الفحص ، على الأقل في البداية في المناسبات القليلة الأولى. يمكن مقارنة ذلك بالقيم التي تم الحصول عليها من خلال التصوير بالفيديو للتأكد من أنها تنتج أرقاما مماثلة.
8. معالجة الفيديو باستخدام برنامج Python النصي
- انقل ملف الفيلم إلى جهاز كمبيوتر للمعالجة. سيكون الامتداد عبارة عن ملف MOV (iPhone) أو MP4 (Android).
- استخدم رمز Python لمعالجة مقاطع الفيديو. يمكن العثور على الرمز في github.com/khyoon201/wormavoid.
- لتشغيل البرامج النصية ل Python ، تأكد من تثبيت ما يلي مسبقا على الكمبيوتر: ffmpeg ، وهي أداة لتحويل ملفات الفيديو (يمكن العثور على اتجاهات التثبيت على موقعها على الويب ، ffmpeg.org/download) ، وحزم Python OS و Pandas و tkinter و ffmpeg-python.
- أوجد أبعاد وإحداثيات كل لوحة باستخدام البرنامج النصي extract_frame.py .
- قم بتشغيل البرنامج النصي extract_frame.py . ستظهر نافذة لتحديد ملف الفيديو المخزن على الكمبيوتر. بعد اكتمال التشغيل ، سيظهر ملف jpeg بنفس الاسم في نفس الدليل.
- افتح ملف jpeg في ImageJ (imagej.org).
- من القائمة، اختر تحليل > تعيين القياسات. تأكد من تحديد مربع عرض التسمية (الشكل 2 أ). أغلق النافذة.
- باستخدام أداة الخط المستقيم ، قم بقياس قطر اللوحة برسم خط عبرها، ثم اختر تحليل > قياس من القائمة. إذا كان الفيديو بدقة 1080 بكسل ، فسيكون عرض كل لوحة حوالي 480 بكسل. اكتب هذه المعلومات وأغلق نافذة النتائج .
- باستخدام أداة النقاط المتعددة ، ضع علامة على النقاط في الجانب الأيسر العلوي من كل لوحة. ستصبح هذه النقاط الزاوية اليسرى العليا من مقاطع الفيديو التي تم اقتصاصها (الشكل 2 ب). الأمر مهم. ضع علامة بترتيب وقت بدء تشغيل اللوحات. بعد إنشاء نقطة لكل اللوحات، اختر تحليل > قياس من القائمة. ستظهر القياسات ، بما في ذلك إحداثيات X و Y للنقاط ، في نافذة النتائج.
- لمعالجة مقاطع فيديو متعددة ، كرر العملية في ImageJ مع ملفات jpeg الأخرى. سيتم سرد جميع إحداثيات X و Y في نفس نافذة النتائج .
- احفظ نافذة النتائج في ملف csv. يجب حفظ الملف في نفس الدليل مثل ملفات الأفلام.
- ابحث عن وقت البدء لكل لوحة.
- قم بتشغيل الفيلم ، إما على الكمبيوتر أو الهاتف ، وقم بتدوين أوقات بدء كل مجموعة من اللوحات الموضوعة أسفل الكاميرا.
- افتح ملف النتائج .csv بالإحداثيات وأضف عمود "ابدأ". لكل صف يتوافق مع اللوحات الفردية ، أدخل وقت البدء المناسب ، بالثواني ، أسفل عمود "البدء" (على سبيل المثال ، إذا كان وقت البدء 0:00:08 ، أدخل 8). أنقذ.
ملاحظة: يجب أن يكون اسم العمود "start" (بأحرف صغيرة، بدون علامتي اقتباس) ليتم التعرف عليه بواسطة البرنامج النصي التالي للاقتصاص والتشذيب.
- اقتصاص وتقليم مقاطع الفيديو.
- قم بتشغيل البرنامج النصي crop_n_trim.py .
- عند المطالبة، اختر ملف النتائج.csv .
ملاحظة: تأكد من أن ملف النتائج.csv وكافة ملفات الأفلام موجودة في نفس الدليل. - أدخل أبعاد اللوحة. أدخل قيمة البيكسل المشار إليها سابقا.
ملاحظة: سيقوم البرنامج النصي الآن بقراءة كل صف من ملف Results.csv للعثور على ملف الفيلم الصحيح عن طريق قراءة اسم الملف في عمود "التسمية" ، واقتصاصه وفقا للإحداثيات المشار إليها في العمودين "X" و "Y". سيتم تحديد وقت بدء كل لوحة حسب الوقت المشار إليه في عمود "البدء". بعد انتهاء تشغيل البرنامج النصي ، سيظهر مجلد بنفس اسم الفيلم ، متبوعا بوقت البدء (على سبيل المثال ، "Movie1_8") ، حيث سيتم حفظ مقاطع فيديو 10 s المقابلة لكل نقطة زمنية بالساعة من الفحص.
9. العد اليدوي باستخدام ImageJ
- افتح كل ملف AVI في ImageJ.
- عد الديدان المرئية خارج العشب. عادة ما تتحرك الديدان المتداخلة في إطار واحد في إطار آخر بحيث يمكن عدها بشكل صحيح.
- احسب معدل الإشغال لكل نقطة زمنية:
معدل الإشغال = (إجمالي الديدان - عدد الديدان خارج العشب) / إجمالي الديدان
ملاحظة: ستتحرك الديدان داخل وخارج العشب أثناء الفيديو ، لكن هذا لن يغير النتائج بشكل كبير. حاول استخدام الرقم الذي يبدو أنه المتوسط ، أو عدد الديدان في النقطة الزمنية المحددة بالساعة (5 ثوان في الفيديو).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
أول فيديو ينتجه البرنامج النصي هو 1 ساعة من بداية الفحص. لا يتم حفظ الفيديو لمدة 0 ساعة ، حيث تبدأ الديدان في الفحص داخل العشب ، وبالتالي فإن معدل الإشغال دائما ما يكون 100٪.
تتم مقارنة الديدان N2 من النوع البري مع طفرات npr-1 ، التي يكون عيبها في تجنب العشب راسخا في الأدبيات6،10 (الشكل 3A-E). كما يتضح من النوع البري ، تغادر الديدان تدريجيا العشب البكتيري وتبقى في الخارج (الشكل 3 أ ، ب). يتم رسم النتائج في رسم بياني لإظهار التغير في معدل الإشغال بمرور الوقت (الشكل 3 ب). تظهر الديدان الموجودة بالخارج بوضوح في الفيديو ، ولكن يصعب تمييز الديدان الموجودة داخل العشب البكتيري السميك (الشكل 3D ، E). ومع ذلك ، نظرا لوجود 30 دودة بالضبط في كل لوحة ، يمكن حساب عدد الديدان التي لا تزال داخل العشب عن طريق طرح الديدان المحسوبة من إجمالي 30.
على الرغم من أن هذا الافتراض يمكن أن يؤدي إلى أخطاء في العد ، خاصة إذا انتهى الأمر ببعض الديدان بالقرب من جدران اللوحة حيث قد يكون من الصعب رؤيتها ، إلا أن هذا لم يكن مصدر قلق كبير. عندما تمت مقارنة الأعداد التي تم إجراؤها مباشرة من الألواح مقابل الأعداد من الديدان المصورة ، تبين أن الأعداد من الديدان المصورة دقيقة للغاية. عندما تم حساب متوسط ثلاث تجارب لكل سلالة معا ، أسفرت سلالات N2 و npr-1 عن دقة 99.5٪ و 96.2٪ على التوالي (الشكل 3B ، C). وتجدر الإشارة إلى أنه كان هناك ميل أعلى قليلا لتفويت عدد قليل من ديدان npr-1 بسبب حركتها العالية11 ، في حين أن الديدان البرية تميل إلى البقاء بالقرب من العشب.
الشكل 1: جهاز التصوير. أ: عرض تخطيطي لإعداد التصوير. (ب) جهاز تصوير تم إعداده داخل حاضنة مضبوطة على 25 درجة مئوية لمقايسات تجنب العشب PA14. (ج) مقارنة الديدان المصورة مع النفق أو بدونه. (د) منظر عن قرب لكيفية تركيب الألواح أعلى الأنفاق. ( ه) يتم ضبط ارتفاع الهاتف بحيث يمكن احتواء ما يصل إلى ست لوحات مقاس 35 مم في الشاشة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تحديد إحداثيات اللوحة باستخدام ImageJ. (أ) في تحليل > تعيين القياسات، يجب تحديد مربع تسمية العرض (مربع منقط أحمر). (ب) يستخدم إطار واحد مستخرج من الفيديو لرسم الإحداثيات المستخدمة في الاقتصاص. النقاط التي تم إنشاؤها باستخدام أداة النقاط المتعددة باللون الأصفر. تعمل هذه الزوايا العلوية اليسرى لمقاطع الفيديو النهائية التي تم اقتصاصها (تم تمييزها كمربع أبيض منقط). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: الصورة التمثيلية ونتائج المقايسة . (أ) بعد عدة ساعات من التعرض ل PA14 ، تغادر معظم الديدان العشب وتبقى في الخارج. (ب) النتائج التمثيلية لمقايسة تجنب العشب. يتم متابعة حركة الديدان كل ساعة لتحديد معدل الإشغال. تشير المربعات المفتوحة عند النقطة الزمنية 20 h إلى متوسط القيمة المحددة من العد المباشر من اللوحات من C. (ج) لتقييم دقة العد الذي تم إجراؤه من خلال الفيديو ، تم أيضا عد الديدان مباشرة في نهاية الفحص ومقارنتها بالقيم التي تم الحصول عليها من خلال التصوير بالفيديو. تشير القيم إلى أرقام الديدان داخل / خارج العشب. (د، ه) يمكن رؤية ديدان L4 بوضوح خارج العشب البكتيري (رأس السهم الأسود) ، في حين يصعب رؤية الديدان الموجودة بالداخل (رأس السهم الأبيض). يمكن عادة تمييز الديدان المتداخلة في إطار واحد في إطار آخر عن نفس الفيلم (رأس سهم مخطط أسود). يشير الرقم الموجود أسفل اليمين إلى رقم الإطار من إجمالي إطارات مقطع الفيديو 10 s (30 إطارا / ثانية). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
إن تصوير سلوك الحيوان ، بدلا من الاعتماد على الملاحظة المباشرة ، ليس مريحا فحسب ، بل يتمتع أيضا بميزة ترك الوثائق المرئية. يسمح هذا بالتحليل الأعمى من قبل شخص ثالث موضوعي ، أو حتى يمكن استخدامه للتحليل الآلي باستخدام تقنيات التعرف على الصور. على الرغم من المزايا ، فإن المعدات القياسية المقدمة عادة ما تكون عالية التكلفة ، لذلك يلتزم المرء بالإعداد بمجرد شرائه.
يوفر استخدام الهواتف الذكية لجمع تسجيلات الفيديو لسلوك C. elegans البسيط العديد من المزايا. يتطلب الحد الأدنى من الإلمام بالمعرفة التقنية وسهل الإعداد للغاية ، باستخدام العناصر التي يمكن شراؤها بسهولة وبتكلفة زهيدة. ميزة أخرى هي قابلية الهاتف الذكي - يمكن أن يتناسب مع المساحات الصغيرة ، وبما أنه يحتوي على مساحة تخزين خاصة به ، فإنه لا يحتاج إلى الاتصال مرة أخرى بجهاز كمبيوتر. يسمح ذلك بوضع الإعداد في أي مكان ، حتى عندما تكون المساحة محدودة للغاية. يعد نقل ملفات الفيديو المسجلة إلى الكمبيوتر أمرا مناسبا - فالملفات ليست كبيرة الحجم نظرا لأنها مشفرة بتنسيق MPEG-4 مضغوط. يعد نقل الملفات مناسبا بشكل خاص عند توفر خيارات لاسلكية لنقل الملفات.
نظرا لأنه يتم تصوير الديدان دون أي تكبير ، فإن الديدان الملتقطة في مقاطع الفيديو تتكون من بضع وحدات بكسل فقط. الديدان L4 كبيرة بما يكفي ليتم التقاطها بدون تكبير ، لكن حجم البكسل الصغير يحد من استخدامها للتعرف على الصور عالية الجودة وتتبع الحركة. قد يساعد استخدام عدسة التكبير/التصغير التي توفرها الطرز الأحدث أو إرفاق محول عدسة التكبير/التصغير في الحصول على صور أكثر تفصيلا، على الرغم من أننا لم نجرب ذلك بأنفسنا. ومع ذلك ، فإن هذا من شأنه أيضا تقليل مجال الرؤية وعدد اللوحات التي يمكن تصويرها في وقت واحد.
لتسهيل العد ، يتم اقتصاص مقاطع الفيديو لإظهار اللوحات الفردية ، وتقليصها إلى مقاطع فيديو مدتها 10 ثوان تتوافق مع كل ساعة من الفحص. هذا مهم أيضا لأن تحويل مقاطع الفيديو إلى تنسيق AVI يزيد بشكل كبير من حجم الملف ، ويضمن اقتصاص مقاطع الفيديو وقصها أن تكون أحجام الملفات أكثر قابلية للإدارة. يمكن أيضا استخدام ملفات AVI التي تم اقتصاصها لحساب الديدان تلقائيا باستخدام خوارزمية التعرف على الصور. بالنسبة للسلالة من النوع البري ، وجدنا أن الشكل الخام للعد الآلي ممكن في ImageJ ، باستخدام عتبة بسيطة. ومع ذلك ، عند استخدام الطفرات ذات حجم الجسم الأصغر ، ينتج عن العد الآلي المزيد من الأخطاء.
كانت هناك العديد من الجهود لتصوير الديدان وأتمتة التحليلات. تقليديا ، تم تسجيل الديدان من خلال كاميرا متصلة بمجهر تشريح ، والذي عادة ما يسمح فقط بتصوير عدد قليل من الديدان في وقت واحد بسبب مجال رؤيته المحدود. دفعت الحاجة إلى تصوير المزيد من الديدان في وقت واحد لإجراء تحليلات إنتاجية أعلى الباحثين إلى تطوير مناهج تصوير إبداعية. كانت إحدى الطرق هي استخدام الماسحات الضوئية المسطحة المعدلة لتصوير مقايسات العمر ، مثل WormScan أو Lifespan Machine12,13. يمكن للماسح الضوئي عالي الدقة تصوير الديدان المتحركة بحيث يمكن تمييز الديدان الحية المتحركة عن الديدان الميتة غير المتحركة.
لتتبع حركات الديدان بمعدل إطارات أعلى في الثانية ، يتم توصيل الكاميرا بعدسة ، ويتم تصوير الديدان بدون مجهر14,15. يقدم Churgin et al. ، الذي طور WorMotel14 ، وهي طريقة للتصوير طويل المدى للديدان الفردية المزروعة في لوحة متعددة الآبار polydimethylsiloxane (PDMS) ، تفسيرات مفصلة حول العوامل التي يجب مراعاتها عند اختيار الكاميرا والعدسة المناسبتين16. تتمتع هذه الطريقة أيضا بميزة إضافية تتمثل في كونها متواضعة نسبيا في التكلفة.
يؤدي التقاط الديدان بدون مجهر حتما إلى صور تفتقر إلى الدقة لإجراء تحليل مفصل لحركة الديدان أو مشيتها. لعلاج هذا ، استخدم Barlow et al. استراتيجية لاستخدام ست كاميرات مرتبة في مصفوفة ثلاثة في اثنين لالتقاط لوحة واحدة من 96 بئرا17. تم إعداد كل كاميرا لتصوير أربعة × أربعة آبار فقط من لوحة 96 بئرا ، مما ينتج عنه حجم ودقة أكبر بكثير من الديدان المصورة.
نظرا لأن C. elegans لها جسم واضح ، يجب أيضا ضبط الإضاءة لتوفير التباين من الخلفية. استخدمت طريقتنا الإضاءة من صندوق إضاءة LED مسطح ، يمر عبر نفق ضيق لتركيز الضوء. تم تحديد الأبعاد حسب حجم اللوحة المصورة. يتناسب عرض 5.5 سم مع لوحة 35 مم المستخدمة في فحص التجنب. لتصوير مساحة أكبر ، يجب أن يكون النفق أوسع ، لكننا وجدنا أن الارتفاع يحتاج أيضا إلى زيادة للحصول على نفس تأثير التركيز. الجانب السلبي هو أنه مع وجود أنفاق أعلى ، يمكن رؤية المزيد من الجدران من خلال اللوحة ، مما يعيق الرؤية على حافة اللوحة. هناك استراتيجية أخرى يمكن استخدامها وهي استخدام مصابيح سلسلة LED مرتبة في حلقة دائرية (حلقة LED). ينتشر الضوء ، القادم من عدة اتجاهات ، على سطح جسم الدودة ، مما يخلق ديدانا خفيفة على خلفية داكنة14،16،18. يمكن أن يعمل هذا ليس فقط مع اللوحات الأكبر ، ولكن للتصوير في المساحات الأصغر التي لا يمكن أن تناسب صندوق إضاءة LED.
مع وجود العديد من استراتيجيات التصوير المتاحة التي طورها مجتمع الديدان ، قد يرغب الباحثون في تجربة بعض الخيارات للعثور على الخيار المناسب الذي يناسب احتياجاتهم. طريقة التصوير الموصوفة هنا رخيصة ويمكن الوصول إليها بدرجة كافية بحيث يمكن استخدامها بسهولة في الفصول الدراسية الجامعية ، أو كحل مؤقت قبل الاستثمار في إعداد طويل الأجل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر Deok Joong Lee على القراءة النقدية للمخطوطة واختبار كود Python. تم رعاية هذا البحث من قبل المؤسسة الوطنية للبحوث في كوريا 2017R1A5A2015369 (K.-h.Y.) و 2019R1C1C1008708 (K.-h.Y.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm Petri dish | SPL | #10035 | |
| Bacto agar | BD | #214010 | |
| Bacto Peptone | BD | #211677 | |
| CaCl2 | DAEJUNG | 2507-1400 | |
| Cholesterol | BioBasic | CD0122 | |
| Dipotassium hydrogen phosphate (K2HPO4) | JUNSEI | 84120-0350 | |
| Glycerol | BioBasic | GB0232 | |
| King B Broth | MB cell | MB-K0827 | |
| LED light box multi-pad | Artmate | N/A | This is a USB powered, LED light pad for tracing and drawing purposes. Artmate is a Korean brand, but searching for "LED light box for tracing" in any search engine should yield numerous options from other brands. Overall dimension is around 9" x 12" (A4 size). For example, from amazon US: https://www.amazon.com/LITENERGY-Ultra-Thin-Adjustable-Streaming-Stenciling/dp/B07H7FLJX1/ref=sr_1_5?crid=YMYU0VYY226R&keywords= LED%2Blight%2Bbox&qid=1674183224&sprefix =led%2Blight%2Bbo%2Caps%2C270&sr=8-5&th=1 |
| MgSO4 | DAEJUNG | 5514-4400 | |
| Plastic paper sleeve (clear) | Smead | #85753 | Any clear plastic sheet with a bit of stiffness can be used as stage. For example, from Amazon US: https://www.amazon.com/Smead-Organized-Translucent-Project-85753/dp/B07HJTRCT7/ref=psdc_1069554_t3_B09J48GXQ 8 |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | JUNSEI | 84185-0350 | |
| Power strip | To accommodate 3 phones and one LED box, you need at least 4 outlets. | ||
| Smartphone | N/A | N/A | Minimum requirement: 12MP wide camera, 1080p HD video recording at 30fps |
| Sodium chloride(NaCl) | DAEJUNG | #7548-4100 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | YAKURI | #31727 |
References
- Pradel, E., et al. Detection and avoidance of a natural product from the pathogenic bacterium Serratia marcescens by Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (7), 2295-2300 (2007).
- Reddy, K. C., Hunter, R. C., Bhatla, N., Newman, D. K., Kim, D. H. Caenorhabditis elegans NPR-1-mediated behaviors are suppressed in the presence of mucoid bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (31), 12887-12892 (2011).
- Hao, Y., et al. Thioredoxin shapes the C. elegans sensory response to Pseudomonas produced nitric oxide. eLife. 7, 36833 (2018).
- Liu, Y., Samuel, B. S., Breen, P. C., Ruvkun, G. Caenorhabditis elegans pathways that surveil and defend mitochondria. Nature. 508 (7496), 406-410 (2014).
- Melo, J. A., Ruvkun, G. Inactivation of conserved C. elegans genes engages pathogen- and xenobiotic-associated defenses. Cell. 149 (2), 452-466 (2012).
- Meisel, J. D., Panda, O., Mahanti, P., Schroeder, F. C., Kim, D. H. Chemosensation of bacterial secondary metabolites modulates neuroendocrine signaling and behavior of C. elegans. Cell. 159 (2), 267-280 (2014).
- Singh, J., Aballay, A. Intestinal infection regulates behavior and learning via neuroendocrine signaling. eLife. 8, 50033 (2019).
- Lee, K., Mylonakis, E. An intestine-derived neuropeptide controls avoidance behavior in Caenorhabditis elegans. Cell Reports. 20 (10), 2501-2512 (2017).
- Singh, J., Aballay, A. Bacterial lawn avoidance and bacterial two choice preference assays in Caenorhabditis elegans. Bio-Protocol. 10 (10), 3623 (2020).
- Reddy, K. C., Andersen, E. C., Kruglyak, L., Kim, D. H. A polymorphism in npr-1 is a behavioral determinant of pathogen susceptibility in C. elegans. Science. 323 (5912), 382-384 (2009).
- de Bono, M., Bargmann, C. I. Natural variation in a neuropeptide Y receptor homolog modifies social behavior and food response in C. elegans. Cell. 94 (5), 679-689 (1998).
- Mathew, M. D., Mathew, N. D., Ebert, P. R. WormScan: a technique for high-throughput phenotypic analysis of Caenorhabditis elegans. PLoS One. 7 (3), 33483 (2012).
- Stroustrup, N., et al. The Caenorhabditis elegans lifespan machine. Nature Methods. 10 (7), 665-670 (2013).
- Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
- Marquina-Solis, J., et al. Peptidergic signaling controls the dynamics of sickness behavior in Caenorhabditis elegans. bioRxiv. , (2022).
- Churgin, M. A., Fang-Yen, C. An imaging system for monitoring C. elegans behavior and aging. Methods in Molecular Biology. 2468, 329-338 (2022).
- Barlow, I. L., et al. Megapixel camera arrays enable high-resolution animal tracking in multiwell plates. Communications Biology. 5 (1), 253 (2022).
- Kawazoe, Y., Yawo, H., Kimura, K. D. A simple optogenetic system for behavioral analysis of freely moving small animals. Neuroscience Research. 75 (1), 65-68 (2013).
