Eine Smartphone-basierte Bildgebungsmethode für den Rasenvermeidungstest von C. elegans

Summary

Dieser Artikel beschreibt eine einfache und kostengünstige Methode zur Aufzeichnung des Rasenvermeidungsverhaltens von Caenorhabditis elegans mit leicht verfügbaren Gegenständen wie einem Smartphone und einem Leuchtkasten mit Leuchtdioden (LED). Wir stellen auch ein Python-Skript zur Verfügung, um die Videodatei in ein Format zu verarbeiten, das besser zum Zählen geeignet ist.

Abstract

Bei Kontakt mit toxischen oder pathogenen Bakterien zeigt der Fadenwurm Caenorhabditis elegans ein erlerntes Rasenvermeidungsverhalten, bei dem die Würmer nach und nach ihre Nahrungsquelle verlassen und sich bevorzugt außerhalb des Bakterienrasens aufhalten. Der Assay ist eine einfache Möglichkeit, die Fähigkeit der Würmer zu testen, äußere oder innere Signale wahrzunehmen, um richtig auf schädliche Bedingungen zu reagieren. Obwohl es sich um einen einfachen Assay handelt, ist das Zählen zeitaufwändig, insbesondere bei mehreren Proben, und Testdauern, die sich über Nacht erstrecken, sind für Forscher unpraktisch. Ein Bildgebungssystem, das viele Platten über einen langen Zeitraum abbilden kann, ist nützlich, aber kostspielig. Hier beschreiben wir ein Smartphone-basiertes Bildgebungsverfahren zur Erfassung der Rasenvermeidung bei C. elegans. Die Methode erfordert nur ein Smartphone und einen Leuchtkasten mit Leuchtdiode (LED), der als Durchlichtquelle dient. Mit kostenlosen Zeitraffer-Kameraanwendungen kann jedes Telefon bis zu sechs Platten mit ausreichender Schärfe und Kontrast abbilden, um Würmer außerhalb des Rasens manuell zu zählen. Die resultierenden Filme werden für jeden stündlichen Zeitpunkt in 10-Sekunden-Audio-Video-Interleave-Dateien (AVI) verarbeitet und dann zugeschnitten, um jede einzelne Platte anzuzeigen und sie für die Zählung zugänglicher zu machen. Diese Methode ist eine kostengünstige Methode für diejenigen, die Vermeidungsfehler untersuchen möchten, und kann möglicherweise auf andere C. elegans-Assays ausgeweitet werden.

Introduction

Zu den vielen Vorteilen der Untersuchung von C. elegans gehört das einfache Nervensystem, das die Möglichkeit bietet, zu untersuchen, wie sich Veränderungen auf genetischer und zellulärer Ebene auf die Netzwerkfunktion und den Verhaltensoutput auswirken. Trotz einer begrenzten Anzahl von Neuronen zeigen C. elegans ein breites Spektrum an komplexen Verhaltensweisen. Eine davon ist die Rasenvermeidung, bei der der bakterivore Fadenwurm auf eine schädliche Nahrungsquelle reagiert, indem er den Bakterienrasen verlässt. C. elegans meiden Rasenflächen mit pathogenen Bakterien ^1,2,3, Rasenflächen mit Bakterien, die Toxine produzieren oder mit Toxinen versetzt sind^1,4, und sogar RNAi-exprimierende Bakterien, deren Zielgen-Knockdown die Gesundheit der Würmer beeinträchtigt ^4,5. Studien haben gezeigt, dass Würmer auf äußere Signale reagieren, wie z. B. Metaboliten, die von den pathogenen Bakterien produziert werden ^1,6, oder auf interne Signale, die darauf hindeuten, dass das Futter sie krank macht ^4,7. Diese Signale werden über konservierte Signalwege wie den Mitogen-aktivierten Proteinkinase-Signalweg (MAPK) und den TGFβ-Signalweg (Transforming Growth Factor beta) verarbeitet und erfordern eine Kommunikation zwischen Darm und Nervensystem 4,6,7,8.

Obwohl der Test einfach ist, entwickelt sich das erlernte Verhalten über viele Stunden, oft über Nacht. Während es Mutanten gibt, die nicht in der Lage sind, das Defekt zu verlassen, in diesem Fall reicht es aus, das Scoring zu einem bestimmten Zeitpunkt zu vermeiden, um den Defekt zu demonstrieren, aber viele Mutanten gehen schließlich, kommen aber langsamer heraus. Für diese muss die Bewegung der Würmer alle paar Stunden verfolgt werden, was über Nacht schwierig sein kann. Auch das Zählen selbst nimmt Zeit in Anspruch, wodurch eine Verzögerungszeit zwischen den Platten entsteht und somit die Anzahl der Platten begrenzt wird, die gleichzeitig getestet werden können. Die Verwendung eines Bildgebungsaufbaus zur gleichzeitigen Aufzeichnung vieler Platten über die gesamte Dauer des Assays wäre sehr nützlich, aber die Kosten für die Einrichtung können je nach Finanzierungssituation des Forschungslabors unerschwinglich sein.

Um dieses Problem zu lösen, haben wir eine sehr einfache Methode entwickelt, bei der Smartphones verwendet werden, um Vermeidungstests aufzuzeichnen. Jedes Telefon kann Zeitraffervideos von bis zu sechs Assay-Platten aufnehmen. Für die Bereitstellung von Durchlicht verwenden wir einen Leuchtkasten mit Leuchtdioden (LED), der einfach online erworben werden kann. Die Untersuchungsplatten befinden sich auf einer erhöhten Plattform, die von hohlen rechteckigen Tunneln getragen wird, die das einfallende Licht bündeln und so einen Kontrast erzeugen. Wir stellen auch ein Python-Skript zur Verfügung, das die Videos in AVI-Dateien (Audio Video Interleave) konvertiert, die 10-Sekunden-Clips jedes stündlichen Zeitpunkts zeigen. Die Videos werden dann auf einzelne Platten zugeschnitten und in separaten Dateien gespeichert, um sie für die manuelle Zählung zu verwenden.

Die Methode bietet ein kostengünstiges Verfahren, das auch extrem einfach anzuwenden ist, wobei Gegenstände verwendet werden, die für die meisten Menschen leicht verfügbar sind. In dieser Arbeit beschreiben wir die Methode anhand des etablierten Rasenvermeidungstests gegen den humanpathogenen Erreger Pseudomonas aeruginosa (PA14), dessen Protokoll bereits beschrieben wurde ^2,9. Schließlich gehen wir auch auf die Überlegungen und Einschränkungen der Bildgebungsmethode für diejenigen ein, die sie auf andere Verhaltensexperimente von C. elegans anwenden möchten.

Protocol

1. Einrichten des Bildgebungsgeräts (Abbildung 1A-E)

1. Stellen Sie sicher, dass eine Smartphone-Kamera mit den folgenden Mindestanforderungen verfügbar ist:
   12 Megapixel (MP) Kamera
   Video mit 1080p-Auflösung
   5 GB Speicherplatz (20 min Video sind 3-4 GB)
   Zeitraffer-Video-App aus dem App-Store (kostenlose Anwendungen verfügbar)
2. Platzieren Sie den LED-Leuchtkasten auf dem unteren Gestell des 25 °C-Inkubators, in dem der Assay stattfinden soll.
3. Um das gepunktete Muster auf der LED-Lichtfläche zu verbergen, breiten Sie zwei Tücher aus, um die gesamte Oberfläche der LED-Box zu bedecken.
4. Stellen Sie eine erhöhte Stufe für die Probe her (Abbildung 1A, D). Die aufgeständerte Bühne ist eine durchsichtige Kunststoffplatte, die von hohlen rechteckigen Tunneln getragen wird. Tunnel funktionieren wie ein Kondensor, um das Licht zu fokussieren und so einen besseren Kontrast zur Probe zu erzielen (Abbildung 1C). Stellen Sie sicher, dass die Wände des Tunnels etwas dunkel sind, um die Lichtstreuung zu minimieren. In dieser Studie wurden braune Papierschachteln verwendet. Die Abmessungen des Tunnels betragen 5,5 cm x 17 cm x 4,5 cm (B x L x H). Der LED-Leuchtkasten bietet Platz für bis zu fünf Tunnel.
5. Platzieren Sie ein weiteres Rack über der Bühne, um die Telefone für die Aufnahme zu platzieren (Abbildung 1B, E). Jedes Telefon zeichnet drei bis sechs Platten auf (ein bis zwei Reihen mit je drei Platten), passen Sie also die Rackhöhe entsprechend an. Dieser befindet sich ca. 15 cm über der Probe (Abbildung 1B).
6. Legen Sie eine Steckdosenleiste in den Inkubator, um die Telefone während der nächtlichen Aufnahme anzuschließen.

2. Vorbereitung von Puffern und Medien

1. Bereiten Sie M9-Puffer vor, indem Sie 3 g KH2PO4, 6 g_Na2HPO4 und 5 g NaCl zu 1 L destilliertem_H2Ohinzufügen. Sterilisieren Sie durch Autoklavieren bei ₁₂₁°C für 20 min. Kühlen Sie den Puffer ab und fügen Sie dann 1 ml 1 M_MgSO4 hinzu.
2. Bereiten Sie 1 M KPO 4 Puffer vor, indem Sie 108,3 g KH 2 PO 4 und 35,6 g K 2 HPO₄ auf 1 L H ₂O zugeben. Stellen Sie den pH-Wert durchZugabe von KOH auf 6,0 ein. Sterilisieren durch Autoklavieren.
3. Bereiten Sie die Wurmbleichlösung vor, indem Sie 1 ml Bleichmittel, 0,4 ml 1 M NaOH und 2,6 ml_H2Omischen.
4. Bereiten Sie Nematoden-Nährmedien (NGM)-Agarplatten vor.
   1. 3 g NaCl, 2,5 g Bacto-Pepton und 17 g Bacto-Agar in einen 3-Liter-Kolben geben. Fügen Sie 975 ml destilliertes Wasser hinzu und setzen Sie einen Rührstab ein.
   2. Durch Autoklavieren sterilisieren, dann auf 55 °C abkühlen lassen und 1 ml Cholesterin (5 mg/ml in Ethanol), 1 ml 1 M CaCl₂, 1 ml 1 M MgSO4 und 25 ml 1 M_KPO4-Puffer (pH 6,0) hinzufügen. Rühren Sie um, um alles gut zu vermischen. In 6 cm große Teller füllen. Lassen Sie die Teller mindestens 2 Tage trocknen.
5. Säen Sie NGM-Agarplatten mit OP50 E. coli , indem Sie etwa 1 ml einer OP50-Kultur über Nacht pipettieren, um einen Rasen aus Bakterien zu bilden. Bis zur Verwendung bei Raumtemperatur (RT) stehen lassen.

3. Herstellung von NGM-Platten mit hohem Peptongehalt (für PA14)

HINWEIS: Diese Platten sollten mindestens 5 Tage vor dem Test angefertigt werden.

1. Stellen Sie NGM her, das 0,35 % Pepton enthält. Mischen Sie 0,3 g NaCl, 0,35 g Bactopepton und 1,7 g Bacto-Agar in einem 250-ml-Erlenmeyerkolben. Fügen Sie 97,5 ml destilliertes Wasser hinzu und setzen Sie einen Rührstab ein.
2. Decken Sie die Kolbenöffnung mit Alufolie ab und autoklavieren Sie sie 20 Minuten lang bei 121 °C.
3. Auf 55 °C abkühlen lassen und 0,1 ml Cholesterin (5 mg/ml in Ethanol), 0,1 ml 1 M CaCl 2, 0,1 ml 1 M MgSO4 und_2,5 ml 1 M_KPO4-Puffer (pH 6,0) zugeben. Rühren Sie um, um alles gut zu vermischen.
4. Gießen Sie NGM mit hohem Peptongehalt in 35-mm-Petrischale.
5. Trocknen Sie die Teller mindestens 2 Tage lang.

4. Synchronisieren von Würmern durch Bleichen

HINWEIS: Beginnen Sie mit diesem Schritt 3 Tage vor dem Test.

1. Nehmen Sie Platten mit trächtigen erwachsenen Würmern und sammeln Sie sie in einem 1,7-ml-Mikroröhrchen, indem Sie die Platten mit M9-Puffer waschen.
2. Entfernen Sie so viel Flüssigkeit wie möglich und fügen Sie dann 400 μl Bleichlösung hinzu. Warten Sie etwa 4-5 Minuten mit intermittierendem Wirbeln, bis die erwachsenen Wurmkörper brechen und die Eier freisetzen.
3. Fügen Sie M9-Puffer hinzu, um den Rest des Mikroröhrchens zu füllen und die Bleichlösung zu verdünnen. Mit maximaler Geschwindigkeit (12.000 bis 13.000 x g) für 1-2 s schleudern. Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie ihn noch dreimal mit M9-Puffer.
4. Übertragen Sie die Eier in eine leere 35-mm-Petrischale mit M9-Puffer. Lassen Sie die Eier über Nacht bei 20 °C schlüpfen. In Ermangelung von Nahrung werden geschlüpfte Würmer im L1-Larvenstadium arretiert und das Entwicklungsstadium aller Würmer synchronisieren.
   Anmerkungen: Das Beschichten der 35-mm-Petrischale mit Gelatinelösung (0,05% Gelatine in autoklaviertem Wasser) kann verhindern, dass die Eier am Boden kleben bleiben, und den Eiverlust minimieren.
5. Am nächsten Tag werden die Würmer des L1-Stadiums auf OP50-gesäte NGM-Platten übertragen.
6. Inkubieren Sie die Würmer bei 20 °C für 53-54 h, bis die Würmer das L4-Larvenstadium erreichen.

5. Präparation von Bakterien (Pseudomonas aeruginosa, PA14)

HINWEIS: Beginnen Sie mit diesem Schritt 4 Tage vor dem Test.

1. Aufgetaute Bakterien ab -80 °C auf einer Luria Bertani (LB) Agarplatte ohne Antibiotikum streifen und über Nacht bei 37 °C inkubieren.
   Anmerkungen: Verwenden Sie immer frische Bakterien. Gestreifte Platten sollten nicht länger als 1 Woche bei 4 °C gelagert werden.
2. Beimpfen Sie eine einzelne Kolonie mit 3 ml Königsbrühe und züchten Sie sie über Nacht in einem 37 °C heißen Schüttel-Inkubator.
3. Am nächsten Tag werden 7 μl der Übernachtkultur auf die NGM-Platten mit hohem Peptongehalt gesät und bei 37 °C für 24 h inkubiert.
4. Stellen Sie die gesäten Platten auf RT und inkubieren Sie sie vor der Verwendung weitere 24 Stunden. Sobald Sie fertig sind, verwenden Sie die Platte innerhalb der nächsten 24 Stunden.

6. Vorbereitung der Aufnahme

HINWEIS: Tun Sie dies direkt vor dem Assay.

1. Schließen Sie das Smartphone an die Steckdosenleiste an, die an eine Steckdose angeschlossen ist. Stellen Sie sicher, dass Sie die automatische Sperreinstellung deaktivieren, um zu verhindern, dass das Telefon während der Aufnahme zum Sperrbildschirm zurückkehrt.
2. Öffnen Sie die Zeitraffer-Kamera-App und stellen Sie das Zeitrafferintervall auf 2 s ein. Stellen Sie die Videoqualität auf 1080p bei 30 fps ein.
3. Platzieren Sie das Smartphone mit dem Bildschirm nach oben, um mit der nach hinten gerichteten Kamera aufzunehmen. Überprüfen Sie den Bildschirm, um sicherzustellen, dass die Papierkartontunnel in das Sichtfeld passen.

7. Rasenvermeidungstest

1. Übertragen Sie mit einem Platin-Drahtpickel 30 synchronisierte L4-Stufenschnecken (53-54 h von L1) auf die PA14-Platte. Legen Sie die Würmer in die Mitte des Bakterienrasens. Für jede Bedingung in dieser Studie wurden zwei Platten getestet (d. h. 60 Würmer pro Bedingung).
2. Legen Sie die beiden Platten mit dem Deckel nach unten auf die erhöhte Bühne des Aufnahmegeräts. Die Seite mit dem Agar zeigt nach oben zur Kamera.
3. Tippen Sie auf dem Smartphone-Bildschirm auf die Stelle, an der sich die Platte befindet, damit die Kamera auf die Assay-Platten fokussieren kann. Es ist hilfreich, ein Etikett oder eine Beschriftung auf der Platte zu haben, da die Kamera damit richtig fokussieren kann.
   Anmerkungen: Die Beschriftung der Unterseite der Platten beeinträchtigt die Abbildung von Würmern nicht, solange sie sich zum Rand hin befindet. Glücklicherweise bleiben Würmer auch nach dem Verlassen des Rasens in der Nähe des Rasens, sodass ein ungehinderter Blick nur auf die unmittelbare Umgebung des Rasens erforderlich ist.
4. Starten Sie die Aufnahme.
5. Sobald die Aufnahme begonnen hat, fügen Sie der Bühne weitere Platten hinzu. Es kann zu einer erheblichen Verzögerung zwischen den Platten kommen, da die Würmer durch Picken übertragen werden. Notieren Sie sich die Verzögerungszeit danach, damit jede Bedingung zum Zeitpunkt ihres Beginns gezählt werden kann.
6. Rekord für 20 Stunden von den letzten Platten, die auf der Bühne platziert wurden. Im endgültigen Zeitraffervideo ergeben 20 Stunden Aufnahme ein 20 Minuten langes Video.
   HINWEIS: Es kann sich lohnen, die Würmer nach dem Assay direkt von den Platten zu zählen, zumindest zu Beginn für die ersten Male. Dies kann mit Werten verglichen werden, die durch Videoaufnahmen ermittelt wurden, um sicherzustellen, dass sie ähnliche Zahlen ergeben.

8. Verarbeitung von Videos mit Python-Skript

1. Übertragen Sie die Filmdatei zur Verarbeitung auf einen Computer. Die Erweiterung ist eine MOV- (iPhone) oder MP4-Datei (Android).
2. Verwenden Sie einen Python-Code, um die Videos zu verarbeiten. Den Code finden Sie unter github.com/khyoon201/wormavoid.
3. Um die Python-Skripte auszuführen, stellen Sie sicher, dass Folgendes auf dem Computer vorinstalliert ist: ffmpeg, ein Tool zum Konvertieren von Videodateien (Installationsanweisungen finden Sie auf der Website ffmpeg.org/download), und die Python-Pakete os, pandas, tkinter und ffmpeg-python.
4. Ermitteln Sie die Abmessungen und Koordinaten der einzelnen Platten mithilfe des extract_frame.py Skripts.
   1. Führen Sie das extract_frame.py Skript aus. Es erscheint ein Fenster, in dem Sie die auf dem Computer gespeicherte Videodatei auswählen können. Nach Abschluss der Ausführung wird eine JPEG-Datei mit demselben Namen im selben Verzeichnis angezeigt.
   2. Öffnen Sie die JPEG-Datei in ImageJ (imagej.org).
   3. Wählen Sie im Menü " Analysieren" > "Messwerte festlegen" aus. Stellen Sie sicher, dass das Kontrollkästchen Anzeigebeschriftung aktiviert ist (Abbildung 2A). Schließen Sie das Fenster.
   4. Messen Sie mit dem Werkzeug "Gerade Linie" den Durchmesser einer Platte, indem Sie eine Linie darüber ziehen, und wählen Sie dann " Analysieren > Messen" aus dem Menü aus. Wenn das Video in 1080p vorliegt, ist jede Platte etwa 480 Pixel breit. Notieren Sie sich diese Informationen und schließen Sie das Ergebnisfenster.
   5. Markieren Sie mit dem Multipoint-Werkzeug Punkte auf der oberen linken Seite jeder Platte. Diese Punkte werden zur oberen linken Ecke der zugeschnittenen Videos (Abbildung 2B). Auf die Reihenfolge kommt es an; Markieren Sie in der Reihenfolge, in der die Platten begonnen wurden. Nachdem Sie einen Punkt für alle Platten erstellt haben, wählen Sie Analysieren > Messen aus dem Menü. Messungen, einschließlich der X- und Y-Koordinaten der Punkte, werden im Ergebnisfenster angezeigt.
   6. Um mehrere Videos zu verarbeiten, wiederholen Sie den Vorgang in ImageJ mit anderen JPEG-Dateien. Alle X- und Y-Koordinaten werden im selben Ergebnisfenster aufgelistet.
   7. Speichern Sie das Ergebnisfenster in einer CSV-Datei. Die Datei sollte im selben Verzeichnis wie die Filmdateien gespeichert werden.
5. Finden Sie die Startzeit für jeden Teller.
   1. Spielen Sie den Film entweder auf dem Computer oder dem Telefon ab und notieren Sie sich die Startzeiten jedes Plattensatzes, der unter der Kamera platziert ist.
   2. Öffnen Sie die Datei Ergebnisse.csv mit den Koordinaten und fügen Sie eine Spalte "Start" hinzu. Geben Sie für jede Zeile, die den einzelnen Platten entspricht, die entsprechende Startzeit in Sekunden in der Spalte "Start" ein (z. B. wenn die Startzeit 0:00:08 ist, geben Sie 8 ein). Retten.
      HINWEIS: Der Spaltenname muss "start" (in Kleinbuchstaben, ohne Anführungszeichen) sein, damit er vom nächsten Skript zum Zuschneiden und Trimmen erkannt wird.
6. Schneiden Sie die Videos zu und schneiden Sie sie zu.
   1. Führen Sie das Skript crop_n_trim.py aus.
   2. Wenn Sie dazu aufgefordert werden, wählen Sie die Datei Ergebnisse.csv aus.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass sich die Ergebnisdatei .csv und alle Filmdateien im selben Verzeichnis befinden.
   3. Geben Sie die Plattenabmessungen ein. Geben Sie den zuvor notierten Pixelwert ein.
      HINWEIS: Das Skript liest nun jede Zeile der Ergebnis .csv Datei, um die richtige Filmdatei zu finden, indem es den Dateinamen in der Spalte "Beschriftung" liest und entsprechend den in den Spalten "X" und "Y" angegebenen Koordinaten zuschneidet. Die Startzeit jeder Platte wird durch die in der Spalte "Start" angegebene Zeit bestimmt. Nachdem das Skript ausgeführt wurde, erscheint ein Ordner mit dem gleichen Namen wie der Film, gefolgt von der Startzeit (z. B. "Movie1_8"), in dem 10-Sekunden-Videos gespeichert werden, die jedem stündlichen Zeitpunkt des Assays entsprechen.

9. Manuelles Zählen mit ImageJ

1. Öffnen Sie jede AVI-Datei in ImageJ.
2. Zählen Sie die Würmer, die außerhalb des Rasens sichtbar sind. Würmer, die sich in einem Frame überlappen, bewegen sich in der Regel in einem anderen Frame auseinander, damit sie korrekt gezählt werden können.
3. Berechnen Sie die Belegungsrate für jeden Zeitpunkt:
   Belegungsgrad = (Würmer gesamt - Anzahl der Würmer außerhalb des Rasens)/Würmer gesamt
   HINWEIS: Die Würmer bewegen sich während des Videos in den Rasen hinein und wieder heraus, aber dies ändert die Ergebnisse nicht wesentlich. Versuchen Sie, die Zahl zu wählen, die der Durchschnitt zu sein scheint, oder die Anzahl der Würmer zum genauen stündlichen Zeitpunkt (5 s im Video).

Representative Results

Das erste Video, das durch das Skript produziert wird, ist 1 Stunde nach Beginn des Assays. Das Video für 0 h wird nicht gespeichert, da Würmer den Assay im Rasen starten, so dass die Auslastung immer 100% beträgt.

Wildtyp-N2-Würmer werden mit npr-1-Mutanten verglichen, deren Rasenvermeidungsdefekt in der Literatur gut belegt ist ^6,10 (Abbildung 3A-E). Wie beim Wildtyp zu sehen ist, verlassen die Würmer nach und nach den Bakterienrasen und bleiben draußen (Abbildung 3A,B). Die Ergebnisse werden in einem Diagramm dargestellt, um die Veränderung der Belegungsrate im Laufe der Zeit darzustellen (Abbildung 3B). Würmer draußen sind im Video deutlich zu sehen, aber Würmer im Inneren des dichten Bakterienrasens sind schwieriger zu unterscheiden (Abbildung 3D, E). Da sich jedoch genau 30 Würmer in jeder Platte befinden, kann die Anzahl der Würmer, die sich noch im Rasen befinden, berechnet werden, indem die gezählten Würmer von der Gesamtzahl von 30 abgezogen werden.

Obwohl diese Annahme möglicherweise zu Zählfehlern führen könnte, insbesondere wenn einige Würmer in der Nähe der Wände der Platte landen, wo sie möglicherweise schwer zu sehen sind, war dies kein wesentliches Problem. Als die Zählungen, die direkt von den Platten durchgeführt wurden, mit den Zählungen der abgebildeten Würmer verglichen wurden, erwiesen sich die Zählungen der abgebildeten Würmer als sehr genau. Wenn drei Versuche für jeden Stamm zusammen gemittelt wurden, ergaben die N2- und npr-1-Stämme eine Genauigkeit von 99,5 % bzw. 96,2 % (Abbildung 3B, C). Bemerkenswert ist, dass es aufgrund seiner hohen Motilität¹¹ eine etwas höhere Tendenz gab, einige npr-1-Würmer zu übersehen, während Wildtyp-Würmer dazu neigten, sich in der Nähe des Rasens aufzuhalten.

Abbildung 1: Bildgebende Apparatur . (A) Eine schematische Darstellung des Bildgebungsaufbaus. (B) Bildgebendes Gerät, das in einem auf 25 °C eingestellten Inkubator für PA14-Rasenvermeidungstests aufgestellt ist. (C) Vergleich von Würmern, die mit oder ohne Tunnel abgebildet wurden. (D) Eine Nahaufnahme, wie die Platten auf den Tunneln montiert sind. (E) Die Höhe des Telefons wird so eingestellt, dass bis zu sechs 35-mm-Platten in den Bildschirm passen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Bestimmen von Plattenkoordinaten mit ImageJ. (A) In " Analysieren > Messen festlegen" muss das Kontrollkästchen " Beschriftung anzeigen" aktiviert sein (rot gepunktetes Kästchen). (B) Ein einzelnes Bild, das aus dem Video extrahiert wird, wird verwendet, um Koordinaten zu zeichnen, die zum Zuschneiden verwendet werden. Punkte, die mit dem Multipoint-Werkzeug erstellt wurden, sind gelb dargestellt. Diese dienen als obere linke Ecken der endgültigen zugeschnittenen Videos (markiert als gepunktetes weißes Kästchen). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Repräsentative Bild- und Untersuchungsergebnisse. (A) Nach mehrstündiger PA14-Exposition verlassen die meisten Würmer den Rasen und bleiben draußen. (B) Repräsentative Ergebnisse des Rasenvermeidungstests. Die Bewegung der Würmer wird stündlich verfolgt, um die Belegungsrate zu bestimmen. Die offenen Quadrate zum 20-Stunden-Zeitpunkt zeigen den Mittelwert an, der sich aus der direkten Zählung von Platten aus C ergibt. (C) Um die Genauigkeit der durch das Video durchgeführten Zählungen zu beurteilen, wurden die Würmer auch direkt am Ende des Assays gezählt und mit den durch Videobildgebung erhaltenen Werten verglichen. Die Werte geben die Wurmzahlen innerhalb/außerhalb des Rasens an. (D,E) L4-Würmer sind außerhalb des Bakterienrasens deutlich zu sehen (schwarze Pfeilspitze), während Würmer im Inneren schwerer zu erkennen sind (weiße Pfeilspitze). Würmer, die sich in einem Bild überlappen, können in der Regel in einem anderen Bild desselben Films unterschieden werden (schwarze Umrisspfeilspitze). Die Zahl unten rechts gibt die Bildnummer aus den Gesamtbildern des 10-Sekunden-Videoclips an (30 Bilder/s). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Discussion

Die Abbildung des Verhaltens von Tieren, anstatt sich auf die direkte Beobachtung zu verlassen, ist nicht nur bequem, sondern hat auch den Vorteil, dass eine visuelle Dokumentation hinterlassen wird. Dies ermöglicht eine blinde Analyse durch eine objektive dritte Person oder könnte sogar für eine automatisierte Analyse mit Bilderkennungstechniken verwendet werden. Trotz der Vorteile ist die Standardausstattung, die in der Regel angeboten wird, teuer, so dass man sich nach dem Kauf an das Setup gebunden hat.

Die Verwendung von Smartphones zum Sammeln von Videoaufzeichnungen von einfachem Verhalten von C. elegans bietet mehrere Vorteile. Es erfordert nur minimale Vertrautheit mit technischen Kenntnissen und ist extrem einfach einzurichten, wobei Artikel verwendet werden, die einfach und kostengünstig beschafft werden können. Ein weiterer Vorteil ist die Portabilität eines Smartphones - es passt in kleine Räume, und da es über einen eigenen Speicher verfügt, muss es nicht wieder an einen Computer angeschlossen werden. Dadurch kann das Setup überall platziert werden, auch wenn der Platz extrem begrenzt ist. Das Verschieben der aufgenommenen Videodateien auf den Computer ist bequem - die Dateien sind nicht so groß, da sie in einem komprimierten MPEG-4-Format kodiert sind. Das Verschieben von Dateien ist besonders praktisch, wenn drahtlose Optionen für die Dateiübertragung verfügbar sind.

Da die Würmer ohne Vergrößerung abgebildet werden, bestehen die in den Videos eingefangenen Würmer nur aus wenigen Pixeln. L4-Würmer sind gerade groß genug, um ohne Vergrößerung erfasst zu werden, aber die geringe Pixelgröße schränkt ihre Verwendung für hochwertige Bilderkennung und Bewegungsverfolgung ein. Die Verwendung des Zoomobjektivs neuerer Modelle oder das Anbringen eines Zoomobjektivadapters kann dazu beitragen, detailliertere Bilder zu erhalten, obwohl wir dies selbst nicht ausprobiert haben. Dies würde jedoch auch das Sichtfeld und die Anzahl der Platten, die gleichzeitig abgebildet werden können, verringern.

Um das Zählen zu erleichtern, werden die Videos so zugeschnitten, dass sie einzelne Platten zeigen, und auf 10-Sekunden-Videos getrimmt, die jeder Stunde des Assays entsprechen. Dies ist auch wichtig, da die Konvertierung der Videos in das AVI-Format die Dateigröße erheblich erhöht und das Zuschneiden und Trimmen der Videos dafür sorgt, dass die Dateigrößen überschaubarer sind. Die zugeschnittenen AVI-Dateien könnten möglicherweise auch verwendet werden, um die Würmer automatisch mit einem Bilderkennungsalgorithmus zu zählen. Für den Wildtyp-Stamm fanden wir heraus, dass eine grobe Form der automatisierten Zählung in ImageJ möglich ist, wobei einfache Schwellenwerte verwendet werden. Wenn jedoch Mutanten mit einer kleineren Körpergröße verwendet werden, erzeugen automatisierte Zählungen mehr Fehler.

Es gab viele Bemühungen, Würmer abzubilden und Analysen zu automatisieren. Traditionell wurden die Würmer durch eine Kamera aufgenommen, die an einem Seziermikroskop befestigt war, das aufgrund seines begrenzten Sichtfeldes in der Regel nur die Abbildung von wenigen Würmern auf einmal ermöglicht. Die Notwendigkeit, mehr Würmer gleichzeitig für Analysen mit höherem Durchsatz abzubilden, veranlasste die Forscher, kreative Bildgebungsansätze zu entwickeln. Eine Möglichkeit bestand darin, modifizierte Flachbettscanner zu verwenden, um Lebensdauer-Assays abzubilden, wie z. B. WormScan oder die Lifespan Machine^12,13. Ein hochauflösender Scanner kann Würmer abbilden, so dass sich bewegende lebende Würmer von unbewegten toten Würmern unterschieden werden können.

Um Wurmbewegungen mit einer höheren FPS-Rate zu verfolgen, wird eine Kamera an einem Objektiv befestigt, und Würmer werden ohne Mikroskop abgebildet^14,15. Churgin et al., die WorMotel¹⁴ entwickelt haben, eine Methode zur Langzeitbildgebung einzelner Würmer, die in einer Polydimethylsiloxan (PDMS)-Multiwell-Platte gezüchtet wurden, geben detaillierte Erklärungen zu Faktoren, die bei der Auswahl der richtigen Kamera und des richtigen Objektivs^{zu berücksichtigen sind 16}. Diese Methode hat auch den zusätzlichen Vorteil, dass sie relativ kostengünstig ist.

Das Erfassen von Würmern ohne Mikroskop führt unweigerlich zu Bildern, die nicht über die Auflösung verfügen, um die Fortbewegung oder den Gang von Würmern detailliert zu analysieren. Um hier Abhilfe zu schaffen, wandten Barlow et al. eine Strategie an, bei der sechs Kameras verwendet wurden, die in einem drei mal zwei Array angeordnet waren, um eine einzelne 96-Well-Platte¹⁷ zu erfassen. Jede Kamera ist so eingestellt, dass sie nur vier x vier Vertiefungen der 96-Well-Platte abbildet, was zu einer viel höheren Größe und Auflösung der abgebildeten Würmer führt.

Da C. elegans einen klaren Körper hat, muss auch die Beleuchtung angepasst werden, um einen Kontrast zum Hintergrund zu schaffen. Unsere Methode verwendete die Beleuchtung eines flachen LED-Leuchtkastens, der durch einen engen Tunnel geleitet wurde, um das Licht zu fokussieren. Die Abmessungen wurden durch die Größe der abgebildeten Platte bestimmt; Die Breite von 5,5 cm passt auf die 35 mm Platte, die für den Vermeidungstest verwendet wird. Um einen größeren Bereich abzubilden, muss der Tunnel breiter sein, aber wir haben festgestellt, dass auch die Höhe erhöht werden muss, um den gleichen Fokussierungseffekt zu erzielen. Der Nachteil ist, dass bei höheren Tunneln mehr von den Wänden durch die Platte gesehen werden kann, was die Sicht am Rand der Platte behindert. Eine andere Strategie, die angewendet werden könnte, ist die Verwendung von LED-Lichterketten, die in einem kreisförmigen Ring (LED-Ring) angeordnet sind. Das Licht, das aus vielen Richtungen kommt, streut sich auf der Oberfläche des Wurmkörpers und erzeugt Lichtwürmer vor einem dunklen Hintergrund^14,16,18. Dies könnte nicht nur für größere Platten funktionieren, sondern auch für die Bildgebung in kleineren Räumen, in die kein LED-Leuchtkasten passt.

Angesichts der vielen verfügbaren Bildgebungsstrategien, die von der Wurmgemeinschaft entwickelt wurden, möchten Forscher möglicherweise einige Optionen ausprobieren, um die richtige zu finden, die ihren Anforderungen entspricht. Die hier beschriebene Bildgebungsmethode ist billig und zugänglich genug, dass sie problemlos in den Klassenzimmern des Grundstudiums oder als vorübergehende Lösung eingesetzt werden kann, bevor in ein langfristiges Setup investiert wird.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm Petri dish	SPL	#10035
Bacto agar	BD	#214010
Bacto Peptone	BD	#211677
CaCl2	DAEJUNG	2507-1400
Cholesterol	BioBasic	CD0122
Dipotassium hydrogen phosphate (K2HPO4)	JUNSEI	84120-0350
Glycerol	BioBasic	GB0232
King B Broth	MB cell	MB-K0827
LED light box multi-pad	Artmate	N/A	This is a USB powered, LED light pad for tracing and drawing purposes. Artmate is a Korean brand, but searching for "LED light box for tracing" in any search engine should yield numerous options from other brands. Overall dimension is around 9" x 12" (A4 size). For example, from amazon US: https://www.amazon.com/LITENERGY-Ultra-Thin-Adjustable-Streaming-Stenciling/dp/B07H7FLJX1/ref=sr_1_5?crid=YMYU0VYY226R&keywords= LED%2Blight%2Bbox&qid=1674183224&sprefix =led%2Blight%2Bbo%2Caps%2C270&sr=8-5&th=1
MgSO4	DAEJUNG	5514-4400
Plastic paper sleeve (clear)	Smead	#85753	Any clear plastic sheet with a bit of stiffness can be used as stage. For example, from Amazon US: https://www.amazon.com/Smead-Organized-Translucent-Project-85753/dp/B07HJTRCT7/ref=psdc_1069554_t3_B09J48GXQ 8
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)	JUNSEI	84185-0350
Power strip			To accommodate 3 phones and one LED box, you need at least 4 outlets.
Smartphone	N/A	N/A	Minimum requirement: 12MP wide camera, 1080p HD video recording at 30fps
Sodium chloride(NaCl)	DAEJUNG	#7548-4100
Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4)	YAKURI	#31727