Summary
Este artigo descreve um método simples e de baixo custo para registrar o comportamento de evitar gramado de Caenorhabditis elegans, usando itens prontamente disponíveis, como um smartphone e uma caixa de luz de diodo emissor de luz (LED). Também fornecemos um script Python para processar o arquivo de vídeo em um formato mais propício para contagem.
Abstract
Quando exposto a bactérias tóxicas ou patogênicas, o nematódeo Caenorhabditis elegans exibe um comportamento aprendido de evitar o gramado, no qual os vermes gradualmente deixam sua fonte de alimento e preferem permanecer fora do gramado bacteriano. O ensaio é uma maneira fácil de testar a capacidade dos vermes de detectar pistas externas ou internas para responder adequadamente a condições prejudiciais. Embora seja um ensaio simples, a contagem é demorada, particularmente com várias amostras, e durações de ensaio que se estendem durante a noite são inconvenientes para os pesquisadores. Um sistema de imagem que pode obter imagens de muitas placas durante um longo período é útil, mas caro. Aqui, descrevemos um método de imagem baseado em smartphone para registrar a evitação de gramado em C. elegans. O método requer apenas um smartphone e uma caixa de luz de diodo emissor de luz (LED), para servir como fonte de luz transmitida. Usando aplicativos de câmera de lapso de tempo gratuitos, cada telefone pode obter imagens de até seis placas, com nitidez e contraste suficientes para contar manualmente vermes fora do gramado. Os filmes resultantes são processados em arquivos AVI (audio video interleave) de 10 s para cada ponto de tempo de hora em hora, depois cortados para mostrar cada placa única para torná-los mais passíveis de contagem. Este método é uma maneira custo-efetiva para aqueles que procuram examinar defeitos de evitação e pode ser potencialmente estendido a outros ensaios de C. elegans.
Introduction
Entre as muitas vantagens de estudar C. elegans, seu sistema nervoso simples oferece a oportunidade de estudar como as mudanças em nível genético e celular afetam a função da rede e a produção comportamental. Apesar de ter um número limitado de neurônios, C. elegans exibe uma ampla gama de comportamentos complexos. Um deles é evitar gramado, em que o nematódeo bacterívoro responde a uma fonte de alimento prejudicial deixando o gramado bacteriano. C. elegans evita gramados de bactérias patogênicas 1,2,3, gramados de bactérias produtoras de toxinas ou que são fortificadas com toxinas1,4 e até mesmo bactérias que expressam RNAi cujo knockdown do gene alvo é prejudicial à saúde dos vermes 4,5. Estudos têm demonstrado que os vermes respondem a pistas externas, como metabólitos produzidos pelas bactérias patogênicas1,6, ou pistas internas que indicam que o alimento está adoecendo 4,7. Essas pistas são processadas por vias de sinalização conservadas, como a via da proteína quinase ativada por mitógeno (MAPK) e a via do fator transformador de crescimento beta (TGFβ), e requerem comunicação entre o intestino e o sistema nervoso 4,6,7,8.
Embora o ensaio seja simples, o comportamento aprendido se desenvolve ao longo de muitas horas, muitas vezes da noite para o dia. Embora existam mutantes que são incapazes de sair, caso em que pontuar evitação em apenas um ponto de tempo é suficiente para demonstrar o defeito, muitos mutantes saem eventualmente, mas são mais lentos para sair. Para estes, o movimento dos vermes precisa ser rastreado a cada poucas horas, o que pode ser difícil de fazer durante a noite. A contagem em si também leva tempo, criando um tempo de atraso entre as placas e, assim, limita o número de placas que podem ser testadas ao mesmo tempo. Usar uma configuração de imagem para registrar muitas placas simultaneamente durante toda a duração do ensaio seria muito útil, mas o custo de instalação pode ser proibitivo, dependendo da situação de financiamento do laboratório de pesquisa.
Para resolver isso, desenvolvemos um método muito simples que usa smartphones para registrar ensaios de evitação. Cada telefone pode gravar vídeos de lapso de tempo de até seis placas de ensaio. Para fornecer luz transmitida, usamos uma caixa de luz de diodo emissor de luz (LED) que pode ser facilmente comprada on-line. As placas de ensaio são colocadas em uma plataforma elevada, apoiada por túneis retangulares ocos, que focalizam a luz recebida, criando contraste. Também fornecemos um script Python que converte os vídeos em arquivos de intercalação de áudio e vídeo (AVI) mostrando clipes de 10 s de cada ponto de tempo de hora. Os vídeos são então cortados em placas individuais e salvos em arquivos separados para usar na contagem manual.
O método proporciona um procedimento de baixo custo e extremamente fácil de usar, utilizando itens que estão prontamente disponíveis para a maioria das pessoas. Aqui, descrevemos o método usando o bem estabelecido ensaio de evitação de gramado contra o patógeno humano Pseudomonas aeruginosa (PA14), cujo protocolo foi previamente descrito 2,9. Finalmente, também revisamos as considerações e limitações do método de imagem para aqueles que desejam aplicá-lo a outros experimentos comportamentais de C. elegans.
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Protocol
1. Montagem do aparelho de imagem (Figura 1A-E)
- Certifique-se de que uma câmara de smartphone com os seguintes requisitos mínimos está disponível:
Câmera de 12 megapixels (MP)
Vídeo com resolução de 1080p
5 GB de espaço de armazenamento (20 min de vídeo é de 3-4 Gb)
Aplicativo de vídeo Time-lapse da loja de aplicativos (aplicativos gratuitos disponíveis) - Coloque a caixa de luz LED no rack inferior da incubadora de 25 °C onde o ensaio será realizado.
- Para ocultar o padrão pontilhado na superfície da luz LED, espalhe duas folhas de tecidos para cobrir toda a superfície da caixa LED.
- Fazer um estágio elevado para o espécime (Figura 1A,D). O estágio elevado é uma chapa plástica transparente suportada por túneis retangulares ocos. Os túneis funcionam como um condensador para focalizar a luz, proporcionando melhor contraste ao espécime (Figura 1C). Certifique-se de que as paredes do túnel estejam um pouco escuras para minimizar a dispersão da luz. Este estudo utilizou caixas de papel pardo. A dimensão do túnel é de 5,5 cm x 17 cm x 4,5 cm (L x L x H). A caixa de luz LED pode caber até cinco túneis.
- Coloque outro rack acima do palco para colocar os telefones para gravação (Figura 1B,E). Cada telefone gravará de três a seis placas (uma a duas fileiras de três placas), então ajuste a altura do rack de acordo. Este estará aproximadamente 15 cm acima do espécime (Figura 1B).
- Coloque uma barra de energia dentro da incubadora para conectar os telefones durante a gravação durante a noite.
2. Preparação de buffers e meios
- Preparar o tampão M9 adicionando 3 g de KH 2 PO 4, 6 g de Na 2 HPO4 e 5 g de NaCl a 1 L de H2O destilado. Esterilizar em autoclave a 121 °C durante 20 min. Arrefecer o tampão e, em seguida, adicionar 1 ml de MgSO4 1 M.
- Prepare 1 M KPO 4 buffer adicionando 108,3 g de KH 2 PO 4 e 35,6 g de K 2 HPO4 a 1 L de H 2O. Ajuste o pH para 6,0 adicionando KOH. Esterilizar por autoclavagem.
- Preparar solução de branqueamento de vermes misturando 1 mL de água sanitária, 0,4 mL de NaOH 1 M e 2,6 mL de H2O.
- Preparar placas de ágar de meios de crescimento de nematoides (NGM).
- Adicionar 3 g de NaCl, 2,5 g de bacto peptona e 17 g de ágar bacto num balão de 3 L. Adicionar 975 ml de água destilada e introduzir uma barra de agitação.
- Esterilizar em autoclavagem, arrefecer a 55 °C e adicionar 1 ml de colesterol (5 mg/ml em etanol), 1 ml de CaCl2 1 M, 1 ml de MgSO 4 1 M e 25 ml de tampão KPO4 M (pH 6,0). Mexa para misturar bem. Despeje em placas de 6 cm. Deixe as placas secarem por pelo menos 2 dias.
- Placas de ágar NGM de sementes com OP50 E. coli por pipetagem de aproximadamente 1 mL de uma cultura noturna de OP50 para formar um gramado de bactérias. Deixar à temperatura ambiente (TR) até estar pronto a utilizar.
3. Preparação de placas NGM com alto teor de peptona (para PA14)
OBS: Estas placas devem ser confeccionadas pelo menos 5 dias antes do ensaio.
- Fazer NGM contendo 0,35% de peptona. Misturar 0,3 g de NaCl, 0,35 g de bacto peptona e 1,7 g de ágar bacto num balão de Erlenmeyer de 250 ml. Adicionar 97,5 ml de água destilada e introduzir uma barra de agitação.
- Cobrir a boca do balão com papel alumínio e autoclave a 121 °C durante 20 min.
- Arrefecer até 55 °C e adicionar 0,1 ml de colesterol (5 mg/ml em etanol), 0,1 ml de CaCl2 1 M, 0,1 ml de MgSO 4 1 M e 2,5 ml de tampão KPO4 M (pH 6,0). Mexa para misturar bem.
- Despeje NGM de alto teor de peptona em placas de Petri de 35 mm.
- Secar as placas por pelo menos 2 dias.
4. Sincronizando vermes por branqueamento
NOTA: Inicie esta etapa 3 dias antes do ensaio.
- Pegue placas com vermes adultos gravídicos e colete-as em um microtubo de 1,7 mL lavando as placas com tampão M9.
- Retire o máximo de líquido possível e, em seguida, adicione 400 μL de solução clareadora. Espere cerca de 4-5 min com vórtice intermitente, até que os corpos de vermes adultos se quebrem, liberando os ovos.
- Adicione o tampão M9 para encher o restante do microtubo para diluir a solução clareadora. Gire na velocidade máxima (12.000 a 13.000 x g) por 1-2 s. Retire o sobrenadante e lave mais três vezes com tampão M9.
- Transferir os ovos para uma placa de Petri vazia de 35 mm contendo tampão M9. Deixe os ovos eclodirem durante a noite a 20 °C. Na ausência de alimento, os vermes eclodidos irão parar no estágio larval L1, sincronizando o estágio de desenvolvimento de todos os vermes.
NOTA: Cobrir a placa de Petri de 35 mm com solução de gelatina (gelatina a 0,05% em água autoclavada) pode evitar que os ovos grudem no fundo e minimizar a perda de ovos. - No dia seguinte, transfira os vermes do estágio L1 para placas NGM semeadas com sementes OP50.
- Incubar os vermes a 20 °C por 53-54 h até que os vermes atinjam o estágio larval L4.
5. Preparação de bactérias ( Pseudomonas aeruginosa, PA14)
NOTA: Inicie esta etapa 4 dias antes do ensaio.
- Streak descongelou bactérias de -80 °C em uma placa de ágar Luria Bertani (LB) sem qualquer antibiótico e incubar durante a noite a 37 °C.
NOTA: Use sempre bactérias frescas. As placas estriadas devem ser armazenadas a 4 °C por no máximo 1 semana. - Inocular uma única colônia em 3 mL de caldo de rei e crescer durante a noite em uma incubadora de agitação a 37 °C.
- No dia seguinte, semeie 7 μL da cultura noturna nas placas NGM de alto teor de peptona e incube a 37 °C por 24 h.
- Mover as placas semeadas para RT e incubar por mais 24 h antes do uso. Depois de pronto, use a placa nas próximas 24 h.
6. Preparando-se para gravar
NOTA: Faça isso imediatamente antes do ensaio.
- Ligue o smartphone à barra de alimentação ligada a uma tomada eléctrica. Certifique-se de desativar a configuração de bloqueio automático para impedir que o telefone retorne à tela de bloqueio durante a gravação.
- Abra o aplicativo de câmera de lapso de tempo e defina o intervalo de lapso de tempo como 2 s. Defina a qualidade do vídeo para 1080p a 30 fps.
- Coloque o smartphone com a tela virada para cima para gravar com a câmera traseira. Verifique a tela para certificar-se de que os túneis da caixa de papel se encaixam no campo de visão.
7. Ensaio de evitação de gramado
- Usando um palito de fio de platina, transfira 30 vermes sincronizados de estágio L4 (53-54 h de L1) para a placa PA14. Coloque os vermes no meio do gramado das bactérias. Para cada condição deste estudo, duas placas foram testadas (ou seja, 60 vermes por condição).
- Coloque as duas placas no palco elevado do aparelho de gravação com a tampa virada para baixo. O lado com o ágar estará voltado para cima em direção à câmera.
- Na tela do smartphone, toque onde está a placa, para que a câmera possa focar nas placas de ensaio. Ajuda ter uma etiqueta ou escrita no prato, pois a câmera pode usar isso para focar corretamente.
NOTA: A escrita na parte inferior das placas não interfere na imagem de vermes, desde que seja em direção à borda. Felizmente, as minhocas permanecem perto do gramado mesmo depois de sair, então uma visão desobstruída só é necessária da área imediata ao redor do gramado. - Inicie a gravação.
- Assim que a gravação começar, adicione mais placas ao palco. Pode haver um tempo de atraso significativo entre as placas devido ao tempo que leva para transferir worms por picking. Observe o tempo de atraso depois para que cada condição possa ser contada no momento em que começou.
- Recorde para 20 h do último conjunto de placas colocadas no palco. No vídeo final de lapso de tempo, 20 h de gravação resultarão em um vídeo de 20 minutos de duração.
NOTA: Pode valer a pena contar as minhocas diretamente das placas após o ensaio, pelo menos no início para as primeiras ocasiões. Isso pode ser comparado com valores obtidos por meio de imagens de vídeo para garantir que eles produzam números semelhantes.
8. Processamento de vídeo usando script Python
- Transfira o arquivo de filme para um computador para processamento. A extensão será um arquivo MOV (iPhone) ou MP4 (Android).
- Use um código Python para processar os vídeos. O código pode ser encontrado em github.com/khyoon201/wormavoid.
- Para executar os scripts Python, certifique-se de que os seguintes itens estejam pré-instalados no computador: ffmpeg, uma ferramenta para converter arquivos de vídeo (instruções para instalação podem ser encontradas em seu site, ffmpeg.org/download), e os pacotes Python os, pandas, tkinter e ffmpeg-python.
- Encontre as dimensões e coordenadas de cada placa usando o script extract_frame.py .
- Execute o script extract_frame.py . Uma janela aparecerá para selecionar o arquivo de vídeo armazenado no computador. Após a conclusão da execução, um arquivo jpeg com o mesmo nome aparecerá no mesmo diretório.
- Abra o arquivo jpeg no ImageJ (imagej.org).
- No menu, escolha Analisar > Definir medidas. Verifique se a caixa Exibir Rótulo está marcada (Figura 2A). Feche a janela.
- Usando a ferramenta Linha reta , meça o diâmetro de uma placa desenhando uma linha sobre ela e escolhendo Analisar > Medir no menu. Se o vídeo estiver em 1080p, cada placa terá cerca de 480 pixels de largura. Anote essas informações e feche a janela Resultados .
- Usando a ferramenta Multiponto , marque pontos no lado superior esquerdo de cada placa. Esses pontos se tornarão o canto superior esquerdo dos vídeos recortados (Figura 2B). A ordem importa; marca por ordem de quando as placas foram iniciadas. Depois de criar um ponto para todas as placas, escolha Analisar > Medir no menu. As medições, incluindo as coordenadas X e Y dos pontos, aparecerão na janela Resultados.
- Para processar vários vídeos, repita o processo no ImageJ com outros arquivos jpeg. Todas as coordenadas X e Y serão listadas na mesma janela Resultados .
- Salve a janela Resultados em um arquivo csv. O arquivo deve ser salvo no mesmo diretório que os arquivos de filme.
- Encontre a hora de início de cada placa.
- Reproduza o filme, seja no computador ou no celular, e anote os horários de início de cada conjunto de placas colocadas sob a câmera.
- Abra o arquivo Results.csv com as coordenadas e adicione uma coluna "start". Para cada linha correspondente a chapas individuais, insira a hora de início apropriada, em segundos, na coluna "início" (por exemplo, se a hora de início for 0:00:08, insira 8). Salvar.
Observação : o nome da coluna deve ser "start" (em minúsculas, sem aspas) para ser reconhecido pelo próximo script para recorte e corte.
- Recorte e apague os vídeos.
- Execute o script crop_n_trim.py .
- Quando solicitado, escolha o arquivo Results.csv .
Observação : verifique se o arquivo Results.csv e todos os arquivos de filme estão no mesmo diretório. - Insira as dimensões da placa. Insira o valor de pixel observado anteriormente.
Observação : o script agora lerá cada linha do arquivo Results.csv para localizar o arquivo de filme correto lendo o nome do arquivo na coluna "label" e cortar de acordo com as coordenadas indicadas nas colunas "X" e "Y". A hora de início de cada placa será determinada pela hora indicada na coluna "início". Depois que o script terminar de ser executado, aparecerá uma pasta com o mesmo nome do filme, seguida pela hora de início (por exemplo, "Movie1_8"), na qual 10 s de vídeos correspondentes a cada ponto de tempo de hora do ensaio serão salvos.
9. Contagem manual usando ImageJ
- Abra cada arquivo AVI no ImageJ.
- Conte os vermes que são visíveis fora do gramado. Os worms que estão sobrepostos em um quadro geralmente se afastam em outro quadro para que possam ser contados corretamente.
- Calcule a taxa de ocupação para cada ponto de tempo:
Taxa de ocupação = (total de vermes - número de vermes fora do gramado)/total de vermes
NOTA: Os vermes entrarão e sairão do gramado durante o vídeo, mas isso não alterará significativamente os resultados. Tente ir com o número que parece ser a média, ou o número de worms no ponto de hora exato (5 s no vídeo).
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Representative Results
O primeiro vídeo produzido pelo roteiro é de 1 h do início do ensaio. O vídeo para 0 h não é salvo, pois os vermes iniciam o ensaio dentro do gramado, então a taxa de ocupação é sempre de 100%.
Vermes selvagens N2 são comparados com mutantes npr-1, cujo defeito de evitação de gramado está bem estabelecido na literatura 6,10 (Figura 3A-E). Como pode ser visto no tipo selvagem, os vermes progressivamente deixam o gramado bacteriano e permanecem do lado de fora (Figura 3A,B). Os resultados são plotados em um gráfico para mostrar a mudança na taxa de ocupação ao longo do tempo (Figura 3B). Vermes do lado de fora são claramente vistos no vídeo, mas vermes dentro do gramado bacteriano espesso são mais difíceis de distinguir (Figura 3D,E). No entanto, como existem exatamente 30 vermes em cada placa, o número de vermes ainda dentro do gramado pode ser calculado subtraindo os vermes contados do total de 30.
Embora essa suposição pudesse potencialmente introduzir erros de contagem, especialmente se alguns vermes acabarem perto das paredes da placa, onde pode ser difícil de ver, essa não foi uma preocupação significativa. Quando as contagens feitas diretamente das placas foram comparadas com as contagens de vermes fotografados, as contagens de vermes fotografados se mostraram altamente precisas. Quando três ensaios para cada cepa foram calculados em conjunto, as linhagens N2 e npr-1 obtiveram 99,5% e 96,2% de precisão, respectivamente (Figura 3B,C). De notar, houve uma tendência ligeiramente maior de perder alguns vermes npr-1 devido à sua alta motilidade11, enquanto os vermes selvagens tenderam a ficar perto do gramado.
Figura 1: Aparelho de imagem. (A) Uma visão esquemática da configuração da imagem. (B) Aparelho de imagem instalado dentro de uma incubadora regulada a 25 °C para ensaios de prevenção do gramado PA14. (C) Comparação de vermes fotografados com ou sem o túnel. (D) Uma visão de perto de como as placas são montadas no topo dos túneis. (E) A altura do telefone é ajustada para que até seis placas de 35 mm possam caber na tela. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Determinação das coordenadas da placa usando o ImageJ. (A) Em Analisar > definir medidas, a caixa Exibir rótulo deve ser marcada (caixa pontilhada vermelha). (B) Um único quadro extraído do vídeo é usado para plotar coordenadas que são usadas para corte. Os pontos feitos usando a ferramenta Multiponto estão em amarelo. Estes servem como os cantos superiores esquerdos dos vídeos finais recortados (marcados como uma caixa branca pontilhada). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Imagem representativa e resultados do ensaio. (A) Após várias horas de exposição ao PA14, a maioria das minhocas deixa o gramado e permanece do lado de fora. (B) Resultados representativos do ensaio de prevenção de gramado. O movimento das minhocas é acompanhado a cada hora para determinar a taxa de ocupação. Os quadrados abertos no ponto de tempo de 20 h indicam o valor médio determinado a partir da contagem direta das placas de C. (C) Para avaliar a acurácia das contagens feitas através do vídeo, os vermes também foram contados diretamente ao final do ensaio e comparados com os valores obtidos por videoimagem. Os valores indicam os números de vermes dentro e fora do gramado. (D,E) Vermes L4 são claramente vistos fora do gramado bacteriano (cabeça de seta preta), enquanto vermes dentro são mais difíceis de ver (cabeça de seta branca). Os vermes que estão sobrepostos em um quadro geralmente podem ser distinguidos separadamente em outro quadro do mesmo filme (seta de contorno preto). O número no canto inferior direito indica o número de quadros do total de quadros do clipe de vídeo de 10 s (30 quadros/s). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Imaginar o comportamento dos animais, em vez de depender da observação direta, não é apenas conveniente, mas também tem a vantagem de deixar documentação visual. Isso permite a análise cega por uma terceira pessoa objetiva, ou pode até mesmo ser usado para análise automatizada usando técnicas de reconhecimento de imagem. Apesar das vantagens, o equipamento padrão geralmente oferecido é de alto custo, por isso se compromete com a configuração uma vez comprado.
Usar smartphones para coletar gravações de vídeo do comportamento simples de C. elegans oferece várias vantagens. Requer familiaridade mínima com conhecimento técnico e é extremamente fácil de configurar, usando itens que podem ser adquiridos de forma fácil e barata. Outra vantagem é a portabilidade de um smartphone – ele pode caber em espaços pequenos e, como tem armazenamento próprio, não precisa ser conectado de volta a um computador. Isso permite que a configuração seja colocada em qualquer lugar, mesmo quando o espaço é extremamente limitado. Mover os arquivos de vídeo gravados para o computador é conveniente - os arquivos não são tão grandes, uma vez que eles são codificados em um formato MPEG-4 compactado. Mover arquivos é especialmente conveniente quando opções sem fio de transferência de arquivos estão disponíveis.
Como os worms são fotografados sem qualquer ampliação, os worms capturados nos vídeos consistem em apenas alguns pixels. Os worms L4 são grandes o suficiente para serem capturados sem ampliação, mas o tamanho pequeno do pixel limita seu uso para reconhecimento de imagem de alta qualidade e rastreamento de movimento. Usar a lente de zoom oferecida por modelos mais recentes ou anexar um adaptador de lente de zoom pode ajudar a obter imagens mais detalhadas, embora nós mesmos não tenhamos tentado isso. No entanto, isso também reduziria o campo de visão e o número de placas que podem ser fotografadas simultaneamente.
Para facilitar a contagem, os vídeos são cortados para mostrar placas individuais e cortados para vídeos de 10 s correspondentes a cada hora do ensaio. Isso também é importante, pois converter os vídeos em formato AVI aumenta significativamente o tamanho do arquivo, e cortar e cortar os vídeos garantem que os tamanhos dos arquivos sejam mais gerenciáveis. Os arquivos AVI cortados também poderiam ser usados para contar os worms automaticamente com um algoritmo de reconhecimento de imagem. Para a cepa selvagem, descobrimos que uma forma bruta de contagem automatizada é possível no ImageJ, usando limiares simples. No entanto, quando mutantes com um tamanho corporal menor são usados, contagens automatizadas produzem mais erros.
Houve muitos esforços para criar imagens de worms e automatizar análises. Tradicionalmente, os vermes eram registrados através de uma câmera acoplada a um microscópio dissecante, que geralmente só permite a obtenção de imagens de alguns vermes de uma só vez devido ao seu campo de visão limitado. A necessidade de obter imagens simultâneas de mais worms para análises de maior rendimento levou os pesquisadores a desenvolver abordagens criativas de imagem. Uma maneira foi usar scanners de mesa modificados para ensaios de vida útil de imagem, como o WormScan ou o Lifespan Machine12,13. Um scanner de alta resolução pode criar imagens de worms para que os worms vivos em movimento possam ser distinguidos dos vermes mortos imóveis.
Para rastrear os movimentos dos vermes a uma taxa de fps mais alta, uma câmera é acoplada a uma lente, e os vermes são fotografados sem um microscópio14,15. Churgin et al., que desenvolveram o WorMotel14, um método para obtenção de imagens de longo prazo de vermes individuais cultivados em uma placa multipoço de polidimetilsiloxano (PDMS), fornecem explicações detalhadas sobre os fatores a serem considerados na escolha da câmera e lente certas16. Este método também tem a vantagem adicional de ser relativamente modesto em custo.
A captura de vermes sem microscópio resulta inevitavelmente em imagens que não têm resolução para análise detalhada sobre a locomoção ou marcha dos vermes. Para remediar isso, Barlow e col. empregaram a estratégia de usar seis câmeras dispostas em uma matriz três por dois para capturar uma única placa de 96poços 17. Cada câmera é configurada para fotografar apenas quatro x quatro poços da placa de 96 poços, resultando em um tamanho e resolução muito maiores dos vermes fotografados.
Como C. elegans tem um corpo claro, a iluminação também precisa ser ajustada para fornecer contraste do fundo. Nosso método usava iluminação de uma caixa de luz LED plana, passada através de um túnel estreito para focalizar a luz. As dimensões foram determinadas pelo tamanho da placa fotografada; A largura de 5,5 cm se ajustou à placa de 35 mm usada para o ensaio de evitação. Para obter uma área maior, o túnel terá que ser mais largo, mas descobrimos que a altura também precisa ser aumentada para obter o mesmo efeito de foco. A desvantagem é que, com túneis mais altos, mais das paredes podem ser vistas através da placa, obstruindo a visão na borda da placa. Outra estratégia que poderia ser empregada é a utilização de pisca-piscas de LED dispostas em um anel circular (anel de LED). A luz, vinda de várias direções, espalha-se na superfície do corpo do verme, criando vermes claros contra um fundo escuro14,16,18. Isso pode funcionar não apenas para placas maiores, mas para imagens em espaços menores que não cabem em uma caixa de luz LED.
Com muitas estratégias de imagem disponíveis desenvolvidas pela comunidade de vermes, os pesquisadores podem querer experimentar algumas opções para encontrar a certa que atenda às suas necessidades. O método de imagem descrito aqui é barato e acessível o suficiente para que possa ser facilmente usado em salas de aula de graduação, ou como uma solução temporária antes de investir em uma configuração de longo prazo.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Agradecemos a Deok Joong Lee pela leitura crítica do manuscrito e teste do código Python. Esta pesquisa foi patrocinada pela Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia 2017R1A5A2015369 (K.-h.Y.) e 2019R1C1C1008708 (K.-h.Y.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm Petri dish | SPL | #10035 | |
| Bacto agar | BD | #214010 | |
| Bacto Peptone | BD | #211677 | |
| CaCl2 | DAEJUNG | 2507-1400 | |
| Cholesterol | BioBasic | CD0122 | |
| Dipotassium hydrogen phosphate (K2HPO4) | JUNSEI | 84120-0350 | |
| Glycerol | BioBasic | GB0232 | |
| King B Broth | MB cell | MB-K0827 | |
| LED light box multi-pad | Artmate | N/A | This is a USB powered, LED light pad for tracing and drawing purposes. Artmate is a Korean brand, but searching for "LED light box for tracing" in any search engine should yield numerous options from other brands. Overall dimension is around 9" x 12" (A4 size). For example, from amazon US: https://www.amazon.com/LITENERGY-Ultra-Thin-Adjustable-Streaming-Stenciling/dp/B07H7FLJX1/ref=sr_1_5?crid=YMYU0VYY226R&keywords= LED%2Blight%2Bbox&qid=1674183224&sprefix =led%2Blight%2Bbo%2Caps%2C270&sr=8-5&th=1 |
| MgSO4 | DAEJUNG | 5514-4400 | |
| Plastic paper sleeve (clear) | Smead | #85753 | Any clear plastic sheet with a bit of stiffness can be used as stage. For example, from Amazon US: https://www.amazon.com/Smead-Organized-Translucent-Project-85753/dp/B07HJTRCT7/ref=psdc_1069554_t3_B09J48GXQ 8 |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | JUNSEI | 84185-0350 | |
| Power strip | To accommodate 3 phones and one LED box, you need at least 4 outlets. | ||
| Smartphone | N/A | N/A | Minimum requirement: 12MP wide camera, 1080p HD video recording at 30fps |
| Sodium chloride(NaCl) | DAEJUNG | #7548-4100 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | YAKURI | #31727 |
References
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