Summary
Het huidige protocol beschrijft hoe olierode O kan worden gebruikt om lipidedruppels (LD's) te verven, de grootte en het aantal LD's in een door vetzuren geïnduceerd vethepatocytenmodel te berekenen en BODIPY 493/503 te gebruiken om het proces van kleine LDs te observeren die fuseren tot grote LDs door middel van live cell imaging.
Abstract
Lipidedruppeltjes (LDs) zijn organellen die een belangrijke rol spelen in het lipidenmetabolisme en neutrale lipidenopslag in cellen. Ze worden geassocieerd met een verscheidenheid aan metabole ziekten, zoals obesitas, leververvetting en diabetes. In levercellen zijn de grootte en het aantal LD's tekenen van leververvetting. Bovendien gaan de oxidatieve stressreactie, celautofagie en apoptose vaak gepaard met veranderingen in de grootte en het aantal LDs. Als gevolg hiervan vormen de afmetingen en hoeveelheid LD's de basis van het huidige onderzoek naar het mechanisme van LD-biogenese. Hier, in door vetzuren geïnduceerde runderlevercellen, beschrijven we hoe we olierode O kunnen gebruiken om LDs te kleuren en om de grootte en aantallen LDs te onderzoeken. De grootteverdeling van LDs wordt statistisch geanalyseerd. Het proces van kleine LDs die fuseren tot grote LDs wordt ook waargenomen door een live cell imaging systeem. Het huidige werk biedt een manier om de trend van grootteverandering van LDs onder verschillende fysiologische omstandigheden direct te observeren.
Introduction
Accumulatie van lipidedruppels (LD) in hepatocyten is het typische kenmerk van niet-alcoholische leververvetting (NAFLD), die kan evolueren naar leverfibrose en hepatocellulair carcinoom. Het is gebleken dat de vroegste manifestatie van leververvetting steatose is, gekenmerkt door LD-accumulatie in het cytoplasma van de hepatocyt1. Leversteatose wordt steevast geassocieerd met een verhoogd aantal en/of uitgebreide grootte van LDs2. Van LDs wordt gedacht dat ze worden gegenereerd uit het endoplasmatisch reticulum (ER), bestaande uit triglyceride (TG) als kern, en zijn omgeven door eiwitten en fosfolipiden3. Als het subcellulaire organel dat verantwoordelijk is voor TG-opslag, vertonen LDs verschillende kenmerken met betrekking tot hun grootte, aantal, lipidensamenstelling, eiwitten en interactie met andere organellen, die allemaal van invloed zijn op celenergiehomeostase4. Het TG-niveau is positief gecorreleerd met de grootte van LDs en een hoger intracellulair TG-gehalte kan grotere LDs5 vormen. LDs nemen in omvang toe door de lokale synthese van TG, lipide-opname in het ER en de fusie van meerdere LDs6. Cellen (adipocyten, hepatocyten, enz.) die grote LD's bevatten, hebben een speciaal mechanisme om de lipidenopslag efficiënt te verhogen door LD-fusie. De dynamische veranderingen van LDs weerspiegelen de verschillende energiemetabolismetoestanden van de cel. Het is van cruciaal belang om methodologieën te ontwikkelen die de observatie en analyse van de verschillende lever-LDs in gezonde en abnormale cellen mogelijk maken.
De belangrijkste niet-fluorescerende kleurstoffen voor LDs zijn Sudan Black B en olierood O. Sudan Black B kleurt neutrale lipiden, fosfolipiden en steroïden7. Olierood O wordt voornamelijk gebruikt voor het kleuren van LDs van skeletspieren, cardiomyocyten, leverweefsel, vetcellen, enz.8., En wordt beschouwd als een standaardinstrument voor de kwantitatieve detectie van leversteatose bij muizen en mensen9. De dynamische verandering van LDs wordt voornamelijk uitgevoerd door fluorescentieverf. Nijlrood en BODIPY zijn beide veelgebruikte fluorescerende lipidekleurstoffen10,11. In vergelijking met Nijlrood heeft BODIPY een sterkere weefseldoorlaatbaarheid en bindt het beter met LDs12. BODIPY-gelabelde LDs kunnen worden gebruikt voor het kleuren van levende cellen en colokalisatie met andere organellen13.
De incidentie van leververvetting is significant hoger bij herkauwers dan bij monogastrische dieren14. Tijdens de overgangsperiode ervaren melkkoeien een toestand van negatieve energiebalans3. Grote hoeveelheden niet-veresterde vetzuren (palmitinezuur, oliezuur, linolzuur, enz.) worden gesynthetiseerd tot TG's in runderhepatocyten, wat leidt tot functionele afwijkingen in de lever en de kwaliteit van melkproducten en de productie-efficiëntie aanzienlijk vermindert15. De huidige studie heeft tot doel een protocol te bieden om de grootte en het aantal LD's te analyseren, evenals om de LD-fusiedynamiek te monitoren. We construeerden een model van LD-vorming door verschillende concentraties linolzuur (LA) toe te voegen in hepatocyten16 en observeerden de veranderingen in de grootte en het aantal LDs tijdens het proces door LDs te kleuren met olierode O. Bovendien werd het proces van de snelle fusie van LDs ook waargenomen door kleuring met BODIPY 493/503.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures werden goedgekeurd en uitgevoerd in overeenstemming met de ethische normen van de Animal Care Committee van de Henan Agricultural University (provincie Henan, China).
1. Rijpe hepatocytencelkweek bij runderen
- Ontdooi de primaire hepatocytencellen17 en centrifugeer 400 x g gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur.
OPMERKING: De primaire hepatocytencellen werden gekweekt en onderhouden na een eerder gepubliceerd rapport17. - Gooi de bevroren opslagoplossing weg met een pipet en suspensie met 1 ml medium dat 10% foetaal runderserum (FBS) en Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) bevat. Gebruik vervolgens een celtelkamer om het aantal cellen per milliliter te berekenen en bereken vervolgens de concentratie van de bovenstaande celsuspensie en pas de celconcentratie aan op 1 x 107 cellen / ml.
- Voeg de celsuspensie toe aan een celkweekschaal van 60 mm met 3 ml van het bovenstaande medium. Kweek de cellen en incubeer ze bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 24 uur.
- Wanneer de cellen groeien tot 80%, gooi het medium weg en spoel met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS), voeg vervolgens 750 μL van 0,25% trypsine toe om de cellen te verteren. Incubeer de cellen bij 37 °C gedurende 3 minuten en neutraliseer ze vervolgens met dezelfde hoeveelheid 10% FBS. Verzamel de celsuspensie om te centrifugeren bij 200 x g gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur.
2. Olie rode O kleuring
- Voeg 800 μL kweekmedium met 10% FBS en DMEM toe aan elk putje van de 24-well celkweekplaat met glazen coverslips. Neem 50 μL van de celsuspensie (verkregen in stap 1.3) en voeg deze toe aan 950 μL PBS om te mengen. Gebruik een celtelkamer om het aantal cellen per milliliter te berekenen en bereken vervolgens de concentratie van de bovenstaande celsuspensie. Stel ten slotte de celconcentratie in elke put in op 4 x 104/ml en incubeer gedurende 24 uur bij 37 °C en 5% CO2 .
- Gooi na 24 uur het kweekmedium weg en was het met PBS. Suspensie met 800 μL DMEM-inductiemedium dat 1 mg/ml runderserumalbumine (BSA) bevat.
- Los in totaal 100 μL LA (zie tabel met materialen) op in 900 μL watervrij ethanol en bereid een standaardoplossing (100 mmol/l). Voeg een gradiënt van 0 μmol/L, 100 μmol/L, 150 μmol/L en 200 μmol/L LA toe aan de 24-putplaat. Herhaal elke behandeling vier keer. Incubeer bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 24 uur.
- Verwijder het kweekmedium en was de cellen drie keer met PBS. Fixeren met 400 μL van 4% paraformaldehyde gedurende 20 min. Gooi de fixatieve oplossing weg en was deze drie keer met PBS.
- Incubeer de cellen met 60% isopropylalcohol gedurende 5 minuten en gooi het vervolgens weg. Voeg vers bereide olierode O-werkoplossing (zie materiaaltabel) (3:2-verhouding van olierood O:water) gedurende 20-30 minuten toe en gooi de kleuringsoplossing weg. Was de cellen twee tot vijf keer met PBS totdat er geen overtollige kleurstofoplossing is.
- Voeg 300 μL hematoxyline-kleuringsoplossing toe (hematoxyline:waterverhouding van 1:10) en verf de kern gedurende 1-2 minuten opnieuw. Gooi de kleurstofoplossing weg en was de cellen twee tot vijf keer met PBS. Verwijder de glazen afdekplaten van de 24-putplaat en plaats ze op microscopische dia's (de kant met cellen naar beneden gericht) nadat u 10 μL tabletkit (zie materiaaltabel) op de dia hebt laten vallen.
- Na het sealen observeren en in beeld brengen van de LDs van de cellen onder de olielens van de optische microscoop (zie Tabel met materialen). Meet de diameter van de LDs met cellSens software en analyseer het aantal en de grootte van de LDs.
3. Meting van de grootte en het aantal LDs
- Beelden vastleggen: Schakel achtereenvolgens de computer en de microscoopschakelaar in, plaats de dia op het laadplatform, open de beeldanalysesoftware (zie Materiaaltabel) en sluit de computer aan om het beeld te bekijken.
- Zoek de afbeeldingen op laag vermogen en druppel een geschikte hoeveelheid cederolie op de beelddia. Stel de waarnemingsfactor in op 100x, stel automatische belichting in en leg de beelden vast door het juiste gezichtsveld aan te passen. Selecteer drie gekleurde celdia's voor elke groep voor beeldvorming.
- Diametermeting: selecteer willekeurig 60 LD's voor elke afbeelding om de diameters te meten. Na de meting van elke afbeelding slaat u de afbeeldingen op en voert u de meetresultaten uit in een tabel voor de daaropvolgende analyse van de gemiddelde grootte en verdelingsverhouding van LDs.
- Hoeveelheidsmeting: selecteer drie afbeeldingen voor elke gekleurde en gefotografeerde dia en selecteer willekeurig drie cellen voor hoeveelheidsmeting in elke afbeelding. Tel en analyseer het aantal LD's rond de cel en bereken het gemiddelde aantal LD's in de cel.
4. Dynamische observatie van LD-fusie
- Volg de celkweekstappen zoals vermeld in stap 1.1-1.3. Wanneer de cellen groeien tot 80%, gooi het medium weg en spoel ze af met PBS en verteer ze vervolgens met 750 μL trypsine gedurende 3 minuten. Voeg vervolgens 750 μL van het medium toe, centrifugeer gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur op 200 x g en gooi het supernatant weg.
- Suspensie van de cellen in 1 ml kweekmedium, tel en pas de celconcentratie aan tot 5 x 105 cellen/ml in een schaal van 35 mm. Cultuur bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 24 uur.
- Wanneer de cellen zijn gegroeid tot 80%, verander het medium in DMEM + 150 μmol / L LA gedurende 24 uur en zet de cultuur voort in een incubator bij 37 °C en 5% CO2 om de LDs te accumuleren.
- Verwijder na 24 uur het kweekmedium. Was de aanhangende cellen met PBS en incubeer ze met 10 μg/ml BODIPY 493/503 neutrale fluorescerende sonde (zie materiaaltabel) in het donker gedurende 30 minuten. Was na incubatie de cellen in de kweekschaal drie keer met PBS en voeg DMEM + 150 μmol/L LA toe.
OPMERKING: Vermijd blootstelling aan licht tijdens en na de BODIPY-kleuring van 10 μg / ml; 1 mg/ml BODIPY werd verdund met PBS (1:100). - Plaats de kweekschaal in de groef van de microscoop van het levende celstation (zie materiaaltabel) om de dynamische veranderingen van LDs te observeren. Schakel de kracht van het werkstation van de levende cel in volgens de startvolgorde en vermijd licht.
- Schakel de stroom, transmissielichtbron, microscoopvoedingsbron, fluorescerende lichtbron van kwiklamp, ccd-cameravoedingsbron (charge-coupled device), computerhostvoedingsbron, CO 2-klep en CO2-incubator in.
- Voeg gedestilleerd water toe aan de groef op het laadplatform en zorg ervoor dat het niet over de ventilatieopening gaat.
- Schakel de computer in en voer "NIS-Elements" uit. Zoek eerst de juiste beeldhoek op de 4x objectieflens en pas deze vervolgens achtereenvolgens aan de 40x objectieflens aan. Selecteer E100 voor het observeren van het monster in de microscoop en L100 voor het bekijken en fotograferen van het monster op de computer.
OPMERKING: E100 en L100 zijn microscoopverstelknoppen op het werkstation van de levende cel (zie materiaaltabel), die respectievelijk het oculair en het computerscherm vertegenwoordigen. - Ontwerp de parameters zoals fluorescentiekanaal (bijv. Ph-40x, fluoresceïne-isothiocyanaat [FITC], sluiter) en verwachte opnametijd voor het experiment. Stel de opnametijd in de tijd in, inclusief de opname-intervaltijd van 5 minuten tussen elke twee beelden en een totale opnametijd van 6 uur.
OPMERKING: Langdurige opnamen moeten de focusstabilisatiefunctie van het Perfect Focus System (PFS) gebruiken. Pas hiervoor eerst het gezichtsveld en de scherpstellengte aan, klik vervolgens op PFS op het computerscherm en pas ten slotte de fijne scherpstelspiraal aan. - Selecteer verschillende kanaalmodi, één kanaal of alle, selecteer een ander gezichtsveld, klik op voorbeeld, pas het gezichtsveld aan, stel deze parameters in en klik op start running om te beginnen met fotograferen. Maak eerst een testopname van 5 minuten; Het kan lang duren nadat de operatie normaal is.
- Nadat de opname is uitgevoerd, kiest u Bestand > Opslaan als > Opslagtype > avi-indeling om de gegevens naar een video in 'avi'-indeling te exporteren. Gebruik het afbeeldingsformaat '.nd2' om het gegevensprogramma op te slaan en de foto's te exporteren.
- Om het apparaat uit te schakelen, schakelt u het in omgekeerde volgorde uit.
5. Statistieken en resultaatanalyse
- Analyseer de gegevens met behulp van eenrichtings-ANOVA. Rapporteer de resultaten als het gemiddelde ± standaardfout.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De kleuring van cel-LDs is weergegeven in figuur 1. De rode stippen weerspiegelen cel-LD's en de blauwe stippen weerspiegelen de kernen. Het is te zien dat de grootte en het aantal LDs in elke foto anders zijn onder de behandeling van LA.
Met de toename van de LA-dosering vertoonden de gemiddelde diameter en het aantal LD's een aanzienlijk stijgende trend, afhankelijk van de LA-concentratie (figuur 2). Zoals te zien is in figuur 2A, was het aantal LDs per cel negatief gecorreleerd met verschillende concentraties LA. Het mediane LD-getal per cel was 136 voor de met 100 μmol/L LA behandelde groep, afnemend tot 118 en 105 voor respectievelijk de met 150 μmol/L en 200 μmol/L LA behandelde groepen. De gemiddelde diameter van LDs in de controlegroep was 0,72 μm, 1,38 μm voor de met 100 μmol/L LA behandelde groep, 1,51 μm voor de met 150 μmol/L LA behandelde groep en 1,64 μm voor de met 200 μmol/L LA behandelde groep (figuur 2B).
In deze studie werden LDs met een diameter <1 μm gedefinieerd als klein en LDs met een diameter >4 μm werden gedefinieerd als groot. Het bleek dat de verdelingsverhoudingen van LDs ook veranderden met de LA-concentratie, zoals weergegeven in figuur 3; het aandeel kleine LDs nam af en het aandeel grote LDs nam toe. Het aandeel LDs met een kleine diameter was 43,33% bij 100 μmol/L LA, 36,43% bij 150 μmol/L LA en 29,8% bij 200 μmol/L LA. Voor LDs met een grote diameter was het hoogste percentage 6,11% in 200 μmol / L LA, vervolgens 3,15% en 1,48% in respectievelijk 150 en 100 μmol / L LA. In de 200 μmol/L LA-groep werden duidelijk supergrote LD's (diameter >5 μm) waargenomen, goed voor ongeveer 6,30%, hoger dan de 100 μmol/L LA (5,93%) en 150 μmol/L LA (4,82%) groepen. De resultaten gaven aan dat een hoge concentratie LA de grootte van LDs verhoogde en het aantal LDs verminderde. Ondertussen nam het aandeel grote LD's toe en het aandeel kleine LD's nam af.
Grote LD's werden over het algemeen gevormd door de fusie van kleine LD's. LD-fusie door middel van live cell imaging werd waargenomen om dit te bewijzen (figuur 4). Cellen werden behandeld met 150 μmol/L LA gedurende 24 uur en gekleurd met BODIPY. Onder de normale celgroeiconditie bij 37 °C en 5% CO2 werden de cellen gedurende 6 uur continu geobserveerd met een levend celwerkstation. De beelden werden elke 5 minuten vastgelegd. Zoals te zien is in figuur 4, waren er in de eerste 15 minuten nog steeds duidelijk kleinere LD's. Vervolgens begonnen de LD's langzaam te fuseren vanaf 20 minuten en werden ze na 35 minuten volledig versmolten tot grotere LD's.
Figuur 1: Lipidedruppeltjes. Hepatocytencellen gekweekt in verschillende concentraties LA en gekleurd met olierood O. De rode stippen weerspiegelden LDs gekleurd met olierood en de blauwpaarse stippen weerspiegelden de kern met hematoxyline. Drie glasplaten werden geselecteerd voor kleuring en beeldvorming in elke behandeling. Schaalbalk = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Aantal en grootte van LDs. Hepatocytencellen gekweekt in een concentratiegradiënt van 0 tot 200 μmol/L LA en gekleurd met olierood O. (A) Gemiddeld aantal LDs per cel. Het aantal LD's in 27 cellen werd in elke groep geteld. (B) De gemiddelde diameter van LDs in een cel. De grootte van 60 LDs werd geteld in elke groep. *p < 0,05; **p < 0,01; p < 0,001; p < 0,0001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: LD-verhouding. Hepatocytencellen gekweekt in verschillende concentraties LA en gekleurd met olierood O. De verhoudingsverhouding van LDs van verschillende groottes werd berekend. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: LD-fusie. Hepatocytencellen werden gekweekt met 150 μmol/L LA en geïncubeerd met de BODIPY 493/503-sonde. Na continue observatie gedurende 6 uur onder een 40x vergrotingsbeeld, werden de LDs onder de fluorescentie en heldere velden gefotografeerd. De beelden werden elke 5 minuten vastgelegd. Fusion was gemarkeerd met rode vakjes. Schaalbalk = 20 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Afhankelijk van de pathologische toestanden ondergaan hepatische LDs enorme veranderingen in hun grootte en aantal. LDs zijn op grote schaal aanwezig in hepatocytencellen en spelen een sleutelrol bij de gezondheid en ziekte van de lever18. De hoeveelheid en grootte van LDs vormen de basis van het huidige onderzoek naar de biogenese van LDs19. De grootte en het aantal LD's voor cellen en weefsels weerspiegelen hun vermogen om energie op te slaan en vrij te geven. De dynamische veranderingen van LDs handhaven de stabiliteit van lipide metabole activiteiten20,21. Een abnormale accumulatie van LDs komt voor in verschillende pathologische aandoeningen en kan een indicator zijn van metabole ziekte22,23. Dit protocol biedt een nauwkeurige methode om de grootte en hoeveelheid LDs in een door vetzuren geïnduceerd hepatocytencelmodel te meten en de fusie van LDs efficiënter en intuïtiever te observeren.
Het bestuderen van de grootte en dynamische veranderingen van LDs is van groot belang voor het begrijpen van het optreden van ziekten die verband houden met lipidemetabolismestoornissen en effectieve interventie. In dit experiment waren de belangrijkste stappen de meting en analyse van de grootte en hoeveelheid LDs. Ten eerste werden verschillende concentraties LA gebruikt om LD-accumulatie in hepatocyten te induceren. Andere vetzuren, zoals oleaat en palmitaat, kunnen ook worden gebruikt om LD-accumulatie in hepatocytencellen te veroorzaken24,25. Na de behandeling met verschillende concentraties LA bleek dat de grootte van LDs op een dosisafhankelijke manier was toegenomen. Deze resultaten gaven aan dat de olierode O-kleuring de diameter van LDs nauwkeurig mat. Er werd ook vastgesteld dat een hoge concentratie LA het aandeel van grote LDs kon verhogen, wat suggereert dat kleine LDs snel met elkaar versmolten. Snelle fusie is een van de dynamische veranderingen in LDs; LD snelle fusie kan binnen enkele minuten of zelfs tientallen seconden plaatsvinden, en het wordt voornamelijk gemedieerd door zijn oppervlakte fosfolipiden en eiwit22,26. In de huidige studie werd LD-fusie duidelijk waargenomen van 20 min tot 35 min met behulp van BODIPY 493/503-labeling door een levend celwerkstation. Het opname-interval tussen afbeeldingen kan worden ingesteld in een paar seconden tot minuten, en de totale opnametijd kan worden ingesteld van 1 uur tot meerdere dagen, wat gemak biedt voor het observeren van de dynamische veranderingen van LDs in verschillende cellen.
In termen van de kleuringsanalyse van de grootte van LDs, is olierode O-kleuring handiger en goedkoper dan fluorescerende kleuring en wordt deze op grotere schaal gebruikt om de schijnbare grootte van LDs9 te meten. Het hoeft niet tegen licht te worden behandeld. Bovendien zijn de apparatuurvereisten niet moeilijk te bereiken en kan de olielens van een gewone optische microscoop worden gebruikt voor fotoobservatie. Met behulp van deze methode kunnen de onderzoekers verschillende groepen afbeeldingen selecteren om willekeurig de grootte en hoeveelheid LDs te meten; Het is eenvoudig en gemakkelijk te bedienen en kan de steekproefgrootte vergroten en de fout verminderen. Bovendien kan volgens de gemeten en geanalyseerde LD-grootte de verdelingsverhouding van verschillende LD-groottes direct worden waargenomen. Statistische analyse kan worden uitgevoerd met de bovenstaande methode na olierode O-kleuring, en deze methode kan ook worden toegepast op andere cellen, waaronder een breed scala aan cellen die worden beïnvloed door lipideaccumulatie. In het vroege verfstadium bleek dat olierood O niet gemakkelijk te reinigen was na het verven en dat er aanzienlijke kleurstoftijdschriftresten waren. In de latere fase werd de kleurstof gefilterd en werd de juiste verftijd geselecteerd door middel van continue tests. Na het verven kan het verlengen van de reinigingstijden het bovenstaande probleem voorkomen.
BODIPY 493/503 fluorescerende kleurstof is een van de meest voorkomende sondes voor LD-visualisatie27. In deze studie werd LD-fusie uitgevoerd door het LD-groen te labelen met BODIPY en het proces te observeren met een levend celwerkstation. Nijlrood is ook een veelgebruikte fluorescerende kleurstof voor neutrale lipiden, maar de brede excitatieband (450-560 nm), niet-specifieke kleuring, slechte weefseldoorlaatbaarheid en andere tekortkomingen kunnen de resultaten van LD-kleuring tot op zekere hoogte beïnvloeden. In vergelijking met nijlrode fluorescentiekleuring was de excitatieband van BODIPY 493/503 smaller (460-490 nm) en kon deze worden gelabeld met verschillende fluorescerende kleurstoffen11. Ten tweede vermijdt BODIPY effectief de interferentie van plantenpigmenten28. Ten slotte heeft BODIPY een sterke weefseldoorlaatbaarheid, een lage gevoeligheid voor omgevingspolariteit en is het niet gemakkelijk te blussen12; daarom wordt het veel gebruikt bij fluorescentiekleuring van LDs. De analyse van LD-fusie heeft echter bepaalde beperkingen. Om een continu observatiebeeld van levende cellen te verkrijgen, kan de lens niet worden verplaatst, dus alleen een lokale LD-fusie kan in het zicht worden waargenomen en de LD-fusie-efficiëntie van de hele cel kan niet nauwkeuriger worden geanalyseerd.
Kortom, deze studie biedt een eenvoudige en reproduceerbare methode voor LD-morfologie en grootteanalyse, die op grote schaal kan worden toegepast op LD-analyse bij het bestuderen van cellulair lipidenmetabolisme. Dit werk bewees ook het proces van LD-fusie en legde de basis voor verdere studie van LDs in de toekomst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten hebben.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gezamenlijk ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (U1904116).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin | Gibco | 25200072 | reagent |
| 4% paraformaldehyde | Solarbio | P1110 | reagent |
| BODIPY 493/503 | invitrogen | 2295015 | reagent |
| Cedar oil | Solarbio | C7140 | reagent |
| cell counting chamber | equipment | ||
| cell culture dish | Corning | 353002 | material |
| cell sens software | Olympus IX73 | software | |
| Centrifuge | Eppendorf | equipment | |
| DMEM | HyClone | SH30022.01 | reagent |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 2492319 | reagent |
| hematoxylin | DingGuo | AR0712 | reagent |
| Image view | image analysis sodtware | ||
| linoleic acid | Solarbio | SL8520 | reagent |
| Live Cell Station | Nikon A1 HD25 | equipment | |
| NIS-Elements | Nikon | software | |
| oil red O | Solarbio | G1260 | reagent |
| optical microscope | Olympus IX73 | equipment | |
| Penicillin & Streptomycin 100× | NCM Biotech | CLOOC5 | reagent |
| Phosphate Buffered Saline | HyClone | SH30258.01 | reagent |
| Pipette | Eppendorf | equipment | |
| Sealing agent | Solarbio | S2150 | reagent |
References
- Fujimoto, T., Parton, R. G. Not just fat: the structure and function of the lipid droplet. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (3), 004838 (2011).
- Grasselli, E., et al. Models of non-alcoholic fatty liver disease and potential translational value: The effects of 3,5-L-diiodothyronine. Annals of Hepatology. 16 (5), 707-719 (2017).
- Herdt, T. H. Ruminant adaptation to negative energy balance: Influences on the etiology of ketosis and fatty liver. Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice. 16 (2), 215-230 (2000).
- Pino-de la Fuente, F., et al. Exercise regulation of hepatic lipid droplet metabolism. Life Sciences. 298, 120522 (2022).
- O'Connor, D., Byrne, A., Berselli, G. B., Long, C., Keyes, T. E. Mega-stokes pyrene ceramide conjugates for STED imaging of lipid droplets in live cells. Analyst. 144 (5), 1608-1621 (2019).
- Gao, G., et al. Control of lipid droplet fusion and growth by CIDE family proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA). Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (10), 1197-1204 (2017).
- Tütüncü Konyar, S. Dynamic changes in insoluble polysaccharides and neutral lipids in the developing anthers of an endangered plant species, Pancratium maritimum. Plant Systematics and Evolution. 304, 397-414 (2018).
- Spangenburg, E. E., Pratt, S. J. P., Wohlers, L. M., Lovering, R. M. Use of BODIPY (493/503) to visualize intramuscular lipid droplets in skeletal muscle. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 598358 (2011).
- Mehlem, A., Hagberg, C. E., Muhl, L., Eriksson, U., Falkevall, A. Imaging of neutral lipids by oil red O for analyzing the metabolic status in health and disease. Nature Protocols. 8 (6), 1149-1154 (2013).
- Diaz, G., Melis, M., Batetta, B., Angius, F., Falchi, A. M. Hydrophobic characterization of intracellular lipids in situ by Nile Red red/yellow emission ratio. Micron. 39 (7), 819-824 (2008).
- Duan, X., et al. The synthesis of polarity-sensitive fluorescent dyes based on the BODIPY chromophore. Dyes and Pigments. 89 (3), 217-222 (2011).
- Rumin, J., et al. The use of fluorescent Nile red and BODIPY for lipid measurement in microalgae. Biotechnology for Biofuels. 8, 42 (2015).
- Fam, T. K., Klymchenko, A. S., Collot, M. Recent advances in fluorescent probes for lipid droplets. Materials. 11 (9), 1768 (2018).
- Raboisson, D., Mounié, M., Maigné, É Diseases, reproductive performance, and changes in milk production associated with subclinical ketosis in dairy cows: A meta-analysis and review. Journal of Dairy Science. 97 (12), 7547-7563 (2014).
- Ospina, P. A., Nydam, D. V., Stokol, T., Overton, T. R. Associations of elevated nonesterified fatty acids and β-hydroxybutyrate concentrations with early lactation reproductive performance and milk production in transition dairy cattle in the northeastern United States. Journal of Dairy Science. 93 (4), 1596-1603 (2010).
- Campos-Espinosa, A., Guzmán, C. A model of experimental steatosis in vitro: hepatocyte cell culture in lipid overload-conditioned medium. Journal of Visualized Experiments. (171), e62543 (2021).
- Liu, L., et al. Effects of nonesterified fatty acids on the synthesis and assembly of very low density lipoprotein in bovine hepatocytes in vitro. Journal of Dairy Science. 97 (3), 1328-1335 (2014).
- Wang, L., Liu, J. Y., Miao, Z. J., Pan, Q. W., Cao, W. L. Lipid droplets and their interactions with other organelles in liver diseases. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 133, 105937 (2021).
- Sanjabi, B., et al. Lipid droplets hypertrophy: a crucial determining factor in insulin regulation by adipocytes. Scientific Reports. 5, 8816 (2015).
- Saponaro, C., Gaggini, M., Carli, F., Gastaldelli, A. The subtle balance between lipolysis and lipogenesis: a critical point in metabolic homeostasis. Nutrients. 7 (11), 9453-9474 (2015).
- Yang, A., Mottillo, E. P. Adipocyte lipolysis: from molecular mechanisms of regulation to disease and therapeutics. Biochemical Journal. 477 (5), 985-1008 (2020).
- Gluchowski, N. L., Becuwe, M., Walther, T. C., Farese, R. V. Lipid droplets and liver disease: from basic biology to clinical implications. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 14 (6), 343-355 (2017).
- Meex, R. C. R., Schrauwen, P., Hesselink, M. K. C. Modulation of myocellular fat stores: lipid droplet dynamics in health and disease. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 297 (4), 913-924 (2009).
- Sarnyai, F., et al. Effect of cis-and trans-monounsaturated fatty acids on palmitate toxicity and on palmitate-induced accumulation of ceramides and diglycerides. International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), 2626 (2020).
- Ricchi, M., et al. Differential effect of oleic and palmitic acid on lipid accumulation and apoptosis in cultured hepatocytes. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 24 (5), 830-840 (2009).
- Fei, W., et al. A role for phosphatidic acid in the formation of "supersized" lipid droplets. PLoS Genetics. 7 (7), e1002201 (2011).
- Kowada, T., Maeda, H., Kikuchi, K. BODIPY-based probes for the fluorescence imaging of biomolecules in living cells. Chemical Society Reviews. 44 (14), 4953-4972 (2015).
- Wang, J., et al. Application of the fluorescent dye BODIPY in the study of lipid dynamics of the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. Molecules. 23 (7), 1594 (2018).
