Summary
Den nåværende protokollen beskriver hvordan man bruker oljerød O til å fargelegge lipiddråper (LD), beregne størrelsen og antallet LD i en fettsyreindusert fetthepatocyttmodell, og bruke BODIPY 493/503 for å observere prosessen med små LD-er som smelter sammen til store LD-er ved levende celleavbildning.
Abstract
Lipiddråper (LD) er organeller som spiller en viktig rolle i lipidmetabolisme og nøytral lipidlagring i celler. De er forbundet med en rekke metabolske sykdommer, som fedme, fettleversykdom og diabetes. I leverceller er størrelsene og antallet LD tegn på fettleversykdom. Videre er oksidativ stressreaksjon, celleautofagi og apoptose ofte ledsaget av endringer i størrelse og antall LD. Som et resultat er dimensjonene og mengden av LD-er grunnlaget for den nåværende forskningen angående mekanismen for LD-biogenese. Her, i fettsyreinduserte bovine leverceller, beskriver vi hvordan man bruker oljerød O til å flekke LDs og å undersøke størrelser og antall LDs. Størrelsesfordelingen av LDs er statistisk analysert. Prosessen med små LD-er som smelter sammen til store LD-er, observeres også av et levende cellebildesystem. Det nåværende arbeidet gir en måte å direkte observere størrelsesendringstrenden til LD under forskjellige fysiologiske forhold.
Introduction
Akkumulering av lipiddråper (LD) i hepatocytter er den typiske egenskapen for ikke-alkoholholdig fettleversykdom (NAFLD), som kan utvikle seg til leverfibrose og hepatocellulært karsinom. Det har blitt funnet at den tidligste manifestasjonen av fettleversykdom er steatose, karakterisert ved LD-akkumulering i cytoplasma av hepatocytten1. Leverstatatose er alltid forbundet med økt antall og/eller utvidet størrelse på LDs2. LD antas å være generert fra endoplasmatisk retikulum (ER), bestående av triglyserid (TG) som kjernen, og er omgitt av proteiner og fosfolipider3. Som den subcellulære organellen som er ansvarlig for TG-lagring, viser LD-er forskjellige egenskaper angående størrelse, antall, lipidsammensetning, proteiner og interaksjon med andre organeller, som alle påvirker celleenergihomeostase4. TG-nivået er positivt korrelert med størrelsen på LD, og et høyere intracellulært TG-innhold kan danne større LDs5. LD øker i størrelse gjennom lokal syntese av TG, lipidinkorporering i ER, og fusjon av flere LDs6. Celler (adipocytter, hepatocytter, etc.) som inneholder store LDs har en spesiell mekanisme for effektivt å øke lipidlagring ved LD-fusjon. De dynamiske endringene i LD gjenspeiler cellens forskjellige energimetabolismetilstander. Det er avgjørende å utvikle metoder som tillater observasjon og analyse av de forskjellige lever-LDs i friske og unormale celler.
De viktigste ikke-fluorescerende fargestoffene for LD er Sudan Black B og oljerød O. Sudan Black B flekker nøytrale lipider, fosfolipider og steroider7. Oljerød O brukes hovedsakelig til farging av LD av skjelettmuskulatur, kardiomyocytter, levervev, fettceller, etc8., og regnes som et standardverktøy for kvantitativ påvisning av leverstatatose hos mus og mennesker9. Den dynamiske forandringen av LD utføres hovedsakelig ved fluorescensfarging. Nilrød og BODIPY er begge ofte brukte fluorescerende lipidfargestoffer10,11. Sammenlignet med Nilrød har BODIPY sterkere vevspermeabilitet og binder seg bedre med LDs12. BODIPY-merkede LD-er kan brukes til farging av levende celler og samlokalisering med andre organeller13.
Forekomsten av fettleversykdom er signifikant høyere hos drøvtyggere enn hos monogastriske dyr14. I overgangsperioden opplever melkekyr en tilstand av negativ energibalanse3. Store mengder ikke-esterifiserte fettsyrer (palmitinsyre, oljesyre, linolsyre, etc.) syntetiseres til TG i bovine hepatocytter, noe som fører til leverfunksjonell abnormitet og reduserer kvaliteten på melkeprodukter og produksjonseffektivitet15. Denne studien tar sikte på å gi en protokoll for å analysere størrelsen og antall LD-er, samt å overvåke LD-fusjonsdynamikken. Vi konstruerte en modell av LD-dannelse ved å legge til forskjellige konsentrasjoner av linolsyre (LA) i hepatocytter16 og observerte endringene i størrelsen og antall LDs under prosessen ved å fargelegge LDs med oljerød O. I tillegg ble prosessen med rask fusjon av LD også observert ved farging med BODIPY 493/503.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer ble godkjent og utført i samsvar med de etiske standardene til dyrepleiekomiteen ved Henan Agricultural University (Henan-provinsen, Kina).
1. Bovin hepatocyttcellekultur
- Tine de primære hepatocyttcellene17 og sentrifuger 400 x g i 4 minutter ved romtemperatur.
MERK: De primære hepatocyttcellene ble dyrket og vedlikeholdt etter en tidligere publisert rapport17. - Kast den frosne lagringsoppløsningen med en pipette og oppbevar den med 1 ml medium inneholdende 10 % føtalt bovint serum (FBS) og Dulbeccos modifiserte Eagle's medium (DMEM). Deretter bruker du et celletellingskammer for å beregne antall celler per milliliter, og beregner deretter konsentrasjonen av ovennevnte cellesuspensjon og justerer cellekonsentrasjonen til 1 x 107 celler / ml.
- Tilsett cellesuspensjonen i en 60 mm cellekulturskål inneholdende 3 ml av ovennevnte medium. Dyrk cellene og inkuber dem ved 37 °C og 5 % CO2 i 24 timer.
- Når cellene vokser til 80%, kast mediet og skyll med fosfatbufret saltvann (PBS), og tilsett deretter 750 μL 0,25% trypsin for å fordøye cellene. Inkuber cellene ved 37 ° C i 3 minutter, og nøytraliser dem deretter med samme mengde 10% FBS. Samle cellesuspensjonen til sentrifuge ved 200 x g i 4 minutter ved romtemperatur.
2. Olje rød O-farging
- Tilsett 800 μL kulturmedium inneholdende 10% FBS og DMEM i hver brønn i 24-brønns cellekulturplaten som inneholder glassdeksler. Ta 50 μL av cellesuspensjonen (oppnådd i trinn 1.3) og tilsett den til 950 μL PBS for å blande. Bruk et celletellingskammer til å beregne antall celler per milliliter, og beregn deretter konsentrasjonen av cellesuspensjonen ovenfor. Til slutt justeres cellekonsentrasjonen til 4 x 104/ml i hver brønn og ruges ved 37 °C og 5 % CO2 i 24 timer.
- Etter 24 timer, kast kulturmediet og vask med PBS. Suspenderes med 800 mikrol DMEM induksjonsmedium inneholdende 1 mg/ml bovint serumalbumin (BSA).
- Løs opp totalt 100 μl LA (se materialfortegnelse) i 900 μl vannfri etanol og lag en standardløsning (100 mmol / l). Legg til en gradient på 0 μmol / L, 100 μmol / L, 150 μmol / L og 200 μmol / L LA i 24-brønnplaten. Gjenta hver behandling fire ganger. Inkuber ved 37 °C og 5 % CO2 i 24 timer.
- Fjern kulturmediet og vask cellene med PBS tre ganger. Fiks med 400 μL 4% paraformaldehyd i 20 minutter. Kast fikseringsoppløsningen og vask den med PBS tre ganger.
- Inkuber cellene med 60% isopropylalkohol i 5 minutter, og kast den deretter. Tilsett nylaget oljerød O-arbeidsløsning (se materialtabell) (3:2-forhold mellom olje rød O:vann) i 20-30 minutter og kast fargeløsningen. Vask cellene med PBS to til fem ganger til det ikke er overflødig fargestoffoppløsning.
- Tilsett 300 μL hematoksylinfargeløsning (hematoksylin: vannforhold på 1:10) og farg kjernen på nytt i 1-2 minutter. Kast fargestoffoppløsningen og vask cellene med PBS to til fem ganger. Ta ut glassdekslene fra 24-brønnsplaten og plasser dem på mikroskopiske lysbilder (siden med cellene vendt ned) etter å ha sluppet 10 μL tablettforseglingsmiddel (se materialfortegnelse) på lysbildet.
- Etter forsegling, observer og avbilde LD-ene til cellene under oljelinsen til det optiske mikroskopet (se materialfortegnelse). Mål diameteren på LD-ene med cellSens-programvare og analyser antallet og størrelsen på LD-ene.
3. Måling av størrelse og antall LD-er
- Ta bilder: Slå på datamaskinen og mikroskopbryteren suksessivt, plasser lysbildet på lasteplattformen, åpne bildeanalyseprogramvaren (se materialfortegnelse), og koble til datamaskinen for å vise bildet.
- Finn bildene med lav effekt og drypp en passende mengde sedertreolje på bildelysbildet. Juster observasjonsfaktoren til 100x, still inn automatisk eksponering og ta bildene ved å justere riktig synsfelt. Velg tre fargede cellelysbilder for hver gruppe for avbildning.
- Diametermåling: Velg tilfeldig 60 LD-er for hvert bilde for å måle diametrene. Etter måling av hvert bilde, lagre bildene og send måleresultatene inn i en tabell for den påfølgende analysen av gjennomsnittlig størrelse og distribusjonsforhold for LD.
- Mengdemåling: Velg tre bilder for hvert farget og fotografert lysbilde, og velg tilfeldig tre celler for mengdemåling i hvert bilde. Telle og analysere antall LDs rundt cellen, og beregne gjennomsnittlig antall LDs i cellen.
4. Dynamisk observasjon av LD-fusjon
- Følg cellekulturtrinnene som nevnt i trinn 1.1-1.3. Når cellene vokser til 80%, kast mediet og skyll med PBS, fordøy dem deretter med 750 μL trypsin i 3 minutter. Deretter tilsettes 750 μL av mediet, sentrifuge ved 200 x g i 4 minutter ved romtemperatur, og kast supernatanten.
- Suspender cellene i 1 ml kulturmedium, tell, og juster cellekonsentrasjonen til 5 x 105 celler / ml i en 35 mm tallerken. Kultur ved 37 °C og 5 % CO2 i 24 timer.
- Når cellene har vokst til 80%, bytt medium til DMEM + 150 μmol / L LA i 24 timer, og fortsett kulturen i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO2 for å akkumulere LDs.
- Etter 24 timer, fjern kulturmediet. Vask de adherente cellene med PBS og inkuber dem med 10 μg/ml BODIPY 493/503 nøytral fluorescerende sonde (se materialfortegnelse) i mørket i 30 minutter. Etter inkubering, vask cellene i kulturskålen med PBS tre ganger og tilsett DMEM + 150 μmol / L LA.
MERK: Unngå lyseksponering under og etter 10 μg / ml BODIPY farging; 1 mg/ml BODIPY ble fortynnet med PBS (1:100). - Plasser dyrkningsfatet i sporet på mikroskopet til den levende cellestasjonen (se Materialfortegnelse) for å observere de dynamiske endringene i LD. Slå på strømmen til arbeidsstasjonen i levende celle i henhold til startsekvensen og unngå lys.
- Slå på strøm, overføring lyskilde, mikroskop strømkilde, kvikksølvlampe fluorescerende lyskilde, ladningskoblet enhet (CCD) kamera strømkilde, datamaskin vert strømkilde, CO 2 ventil, og CO2 inkubator.
- Tilsett destillert vann i sporet på lasteplattformen, og pass på at du ikke går over luftventilen.
- Slå på datamaskinen og kjør "NIS-Elements". Finn først riktig synsfelt på 4x objektivlinsen, og juster den deretter til 40x objektivlinsen suksessivt. Velg E100 for å observere prøven i mikroskopet og L100 for forhåndsvisning og fotografering av prøven på datamaskinen.
MERK: E100 og L100 er mikroskopjusteringsknapper på arbeidsstasjonen i levende celle (se materialfortegnelse), som representerer henholdsvis okularet og dataskjermen. - Utform parametrene som fluorescenskanal (f.eks. Ph-40x, fluoresceinisotiocyanat [FITC], lukker) og forventet opptakstid for eksperimentet. Still inn opptakstiden i tid, inkludert opptaksintervalltiden på 5 minutter mellom annethvert bilde og en total opptakstid på 6 timer.
MERK: Langtidsfotografering må bruke fokusstabiliseringsfunksjonen (perfect focus system, PFS). For dette, juster først synsfeltet og fokuslengden, klikk deretter på PFS på dataskjermen, og juster til slutt den fine fokusspiralen. - Velg forskjellige kanalmoduser, enkeltkanal eller alle, velg et annet synsfelt, klikk forhåndsvisning, juster synsfeltet, angi disse parametrene og klikk på begynn å løpe for å begynne å skyte. Ta et testbilde i 5 min først; Det kan ta lang tid etter at operasjonen er normal.
- Etter at opptaket er utført, velger du File > Save as > Save type > AVI-format for å eksportere dataene til en video i 'avi' format. Bruk '.nd2' bildeformat for å lagre dataprogrammet og eksportere bildene.
- For å slå av maskinen, slå den av i omvendt rekkefølge.
5. Statistikk og resultatanalyse
- Analyser dataene ved hjelp av enveis ANOVA. Rapporter resultatene som gjennomsnitt ± standardfeil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fargingen av celle LD er vist i figur 1. De røde prikkene reflekterer celle LD, og de blå prikkene reflekterer kjernene. Det kan sees at størrelsen og antallet LDs i hvert bilde er forskjellig under behandlingen av LA.
Med økningen i LA-dosering viste gjennomsnittlig diameter og antall LD-er en signifikant økende trend, avhengig av LA-konsentrasjon (figur 2). Som vist i figur 2A, var antall LD per celle negativt korrelert med forskjellige konsentrasjoner av LA. Median LD-tall per celle var 136 for gruppen behandlet med 100 μmol/L LA, redusert til 118 og 105 for gruppene behandlet med henholdsvis 150 μmol/L og 200 μmol/L LA. Gjennomsnittlig diameter av LDs i kontrollgruppen var 0,72 μm, 1,38 μm for gruppen behandlet med 100 μmol/L LA, 1,51 μm for gruppen behandlet med 150 μmol/L LA og 1,64 μm for gruppen behandlet med 200 μmol/L LA (figur 2B).
I denne studien ble LD-er med diameter <1 μm definert som små, og LD-er med diameter >4 μm ble definert som store. Det ble funnet at fordelingsandelene av LD også endret seg med LA-konsentrasjonen, som vist i figur 3; andelen små LD-medlemmer gikk ned, og andelen store LD-medlemmer økte. Andelen LD med liten diameter var 43,33 % ved 100 μmol/L LA, 36,43 % ved 150 μmol/L LA og 29,8 % ved 200 μmol/L LA. For LD med stor diameter var den høyeste andelen 6,11 % i 200 μmol/L LA, deretter 3,15 % og 1,48 % i henholdsvis 150 og 100 μmol/L LA. I 200 μmol / L LA-gruppen ble det åpenbart observert super store LDs (diameter >5 μm), som utgjorde ca. 6,30%, høyere enn 100 μmol / L LA (5,93%) og 150 μmol / L LA (4,82%) gruppene. Resultatene indikerte at en høy konsentrasjon av LA økte størrelsen på LDs og reduserte antall LDs. I mellomtiden økte andelen store LD-er, og andelen små LD-medlemmer gikk ned.
Store LD-verdier ble vanligvis dannet ved sammensmelting av små LD-er. LD-fusjon gjennom levende celleavbildning ble observert for å bevise dette (figur 4). Cellene ble behandlet med 150 μmol/L LA i 24 timer og farget med BODIPY. Under normal celleveksttilstand ved 37 °C og 5 % CO2 ble cellene observert kontinuerlig i 6 timer med en arbeidsstasjon med levende celler. Bildene ble tatt hvert 5. Som vist i figur 4, var det i løpet av de første 15 minuttene fortsatt tydelige mindre LD-er. Deretter begynte LD-ene sakte å smelte sammen fra 20 min, og ble helt smeltet sammen til større LD-er med 35 min.
Figur 1: Lipiddråper. Hepatocyttceller dyrket i forskjellige konsentrasjoner av LA og farget med oljerød O. De røde prikkene reflekterte LD-er farget med oljerødt, og de blålilla prikkene reflekterte kjernen med hematoksylin. Tre glassglass ble valgt ut for farging og avbildning i hver behandling. Skala bar = 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Antall og størrelse på LD-er. Hepatocyttceller dyrket i en konsentrasjonsgradient fra 0 til 200 μmol / L LA og farget med oljerød O. (A) Gjennomsnittlig antall LDs per celle. Antall LD-er i 27 celler ble talt i hver gruppe. (B) Den gjennomsnittlige diameteren av LD i en celle. Størrelsen på 60 LDs ble talt i hver gruppe. *p < 0,05; **p < 0,01; p < 0,001; p < 0,0001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: LD-andel. Hepatocyttceller dyrket i forskjellige konsentrasjoner av LA og farget med oljerød O. Andelsforholdet mellom LD av forskjellige størrelser ble beregnet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: LD-fusjon. Hepatocyttceller ble dyrket med 150 μmol/L LA og inkubert med BODIPY 493/503-sonden. Etter kontinuerlig observasjon i 6 timer under et 40x forstørrelsesbilde, ble LD-ene under fluorescens og lyse felt fotografert. Bildene ble tatt hvert 5. Fusion var merket med røde bokser. Skala bar = 20 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Avhengig av de patologiske tilstandene, gjennomgår hepatiske LDs enorme endringer i størrelse og antall. LD er allment tilstede i hepatocyttceller og spiller en nøkkelrolle i leverens helse og sykdom18. Mengden og størrelsen på LDs er grunnlaget for dagens forskning på biogenesen av LDs19. Størrelsen og antallet LD-verdier for celler og vev gjenspeiler deres evne til å lagre og frigjøre energi. De dynamiske endringene i LD opprettholder stabiliteten til lipidmetabolske aktiviteter20,21. En unormal akkumulering av LD forekommer i ulike patologiske forhold og kan være en indikator på metabolsk sykdom22,23. Denne protokollen gir en nøyaktig metode for å måle størrelsen og mengden av LDs i en fettsyreindusert hepatocyttcellemodell og observere fusjonen av LDs mer effektivt og intuitivt.
Å studere størrelsen og dynamiske endringer av LDs er av stor betydning for å forstå forekomsten av sykdommer relatert til lipidmetabolismeforstyrrelser og effektiv intervensjon. I dette eksperimentet var nøkkeltrinnene måling og analyse av størrelsen og mengden av LD-er. For det første ble forskjellige konsentrasjoner av LA brukt til å indusere LD-akkumulering i hepatocytter. Andre fettsyrer, som oleat og palmitat, kan også brukes til å forårsake LD-akkumulering i hepatocyttceller24,25. Etter behandling med forskjellige konsentrasjoner av LA ble det funnet at størrelsen på LDs ble økt på en doseavhengig måte. Disse resultatene indikerte at den oljerøde O-fargingen nøyaktig målte diameteren på LD-er. Det ble også funnet at en høy konsentrasjon av LA kunne øke andelen store LD-er, noe som tyder på at små LD-er smeltet raskt sammen med hverandre. Rask fusjon er en av de dynamiske endringene i LD-er; LD-rask fusjon kan forekomme i løpet av få minutter eller til og med titalls sekunder, og den er hovedsakelig mediert av overflatefosfolipider og protein22,26. I denne studien ble LD-fusjon tydelig observert fra 20 minutter til 35 minutter ved bruk av BODIPY 493/503-merking av en arbeidsstasjon med levende celler. Opptaksintervallet mellom bilder kan settes opp på noen få sekunder til minutter, og den totale opptakstiden kan stilles inn fra 1 time til flere dager, noe som gir bekvemmelighet for å observere de dynamiske endringene i LD i forskjellige celler.
Når det gjelder fargeanalyse av størrelsen på LD, er oljerød O-farging mer praktisk og billigere enn fluorescerende farging, og er mer utbredt brukt til å måle den tilsynelatende størrelsen på LDs9. Det trenger ikke å bli behandlet mot lys. Dessuten er utstyrskravene ikke vanskelig å oppnå, og oljelinsen til et vanlig optisk mikroskop kan brukes til fotoobservasjon. Ved hjelp av denne metoden kan forskerne velge flere grupper av bilder for å tilfeldig måle størrelsen og mengden av LDs; Det er enkelt og praktisk å betjene, og kan øke prøvestørrelsen og redusere feilen. Videre, i henhold til den målte og analyserte LD-størrelsen, kan fordelingsforholdet mellom forskjellige LD-størrelser observeres direkte. Statistisk analyse kan utføres ved hjelp av metoden ovenfor etter oljerød O-farging, og denne metoden kan også brukes på andre celler, inkludert et bredt spekter av celler påvirket av lipidakkumulering. I det tidlige fargingsstadiet ble det funnet at oljerød O ikke var lett å rengjøre etter farging, og det var betydelige fargemagasinrester. I det senere stadiet ble fargestoffet filtrert, og riktig fargetid ble valgt gjennom kontinuerlige tester. Etter farging kan økt rengjøringstid unngå problemet ovenfor.
BODIPY 493/503 fluorescerende fargestoff er en av de vanligste sondene for LD-visualisering27. I denne studien ble LD-fusjon utført ved å merke LD grønn med BODIPY og observere prosessen med en arbeidsstasjon med levende celler. Nilrød er også et vanlig fluorescerende fargestoff for nøytrale lipider, men det brede eksitasjonsbåndet (450-560 nm), ikke-spesifikk farging, dårlig vevpermeabilitet og andre mangler kan påvirke resultatene av LD-farging til en viss grad. Sammenlignet med Nilrød fluorescensfarging var eksitasjonsbåndet til BODIPY 493/503 smalere (460-490 nm), og det kunne merkes sammen med forskjellige fluorescerende fargestoffer11. For det andre unngår BODIPY effektivt forstyrrelser av plantepigmenter28. Endelig har BODIPY sterk vevspermeabilitet, lav følsomhet for miljøpolaritet, og er ikke lett å slukke12; Derfor er det mye brukt i fluorescensfarging av LD. Imidlertid har analysen av LD-fusjon visse begrensninger. For å oppnå et kontinuerlig observasjonsbilde av levende celler, kan linsen ikke flyttes, så bare en lokal LD-fusjon kan observeres i visjonen, og LD-fusjonseffektiviteten til hele cellen kan ikke analyseres mer nøyaktig.
Avslutningsvis gir denne studien en enkel og reproduserbar metode for LD-morfologi og størrelsesanalyse, som kan brukes mye på LD-analyse ved å studere cellulær lipidmetabolisme. Dette arbeidet viste også prosessen med LD-fusjon, og la grunnlaget for videre studier av LDs i fremtiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikter.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet i fellesskap av National Natural Science Foundation of China (U1904116).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin | Gibco | 25200072 | reagent |
| 4% paraformaldehyde | Solarbio | P1110 | reagent |
| BODIPY 493/503 | invitrogen | 2295015 | reagent |
| Cedar oil | Solarbio | C7140 | reagent |
| cell counting chamber | equipment | ||
| cell culture dish | Corning | 353002 | material |
| cell sens software | Olympus IX73 | software | |
| Centrifuge | Eppendorf | equipment | |
| DMEM | HyClone | SH30022.01 | reagent |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 2492319 | reagent |
| hematoxylin | DingGuo | AR0712 | reagent |
| Image view | image analysis sodtware | ||
| linoleic acid | Solarbio | SL8520 | reagent |
| Live Cell Station | Nikon A1 HD25 | equipment | |
| NIS-Elements | Nikon | software | |
| oil red O | Solarbio | G1260 | reagent |
| optical microscope | Olympus IX73 | equipment | |
| Penicillin & Streptomycin 100× | NCM Biotech | CLOOC5 | reagent |
| Phosphate Buffered Saline | HyClone | SH30258.01 | reagent |
| Pipette | Eppendorf | equipment | |
| Sealing agent | Solarbio | S2150 | reagent |
References
- Fujimoto, T., Parton, R. G. Not just fat: the structure and function of the lipid droplet. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (3), 004838 (2011).
- Grasselli, E., et al. Models of non-alcoholic fatty liver disease and potential translational value: The effects of 3,5-L-diiodothyronine. Annals of Hepatology. 16 (5), 707-719 (2017).
- Herdt, T. H. Ruminant adaptation to negative energy balance: Influences on the etiology of ketosis and fatty liver. Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice. 16 (2), 215-230 (2000).
- Pino-de la Fuente, F., et al. Exercise regulation of hepatic lipid droplet metabolism. Life Sciences. 298, 120522 (2022).
- O'Connor, D., Byrne, A., Berselli, G. B., Long, C., Keyes, T. E. Mega-stokes pyrene ceramide conjugates for STED imaging of lipid droplets in live cells. Analyst. 144 (5), 1608-1621 (2019).
- Gao, G., et al. Control of lipid droplet fusion and growth by CIDE family proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA). Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (10), 1197-1204 (2017).
- Tütüncü Konyar, S. Dynamic changes in insoluble polysaccharides and neutral lipids in the developing anthers of an endangered plant species, Pancratium maritimum. Plant Systematics and Evolution. 304, 397-414 (2018).
- Spangenburg, E. E., Pratt, S. J. P., Wohlers, L. M., Lovering, R. M. Use of BODIPY (493/503) to visualize intramuscular lipid droplets in skeletal muscle. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 598358 (2011).
- Mehlem, A., Hagberg, C. E., Muhl, L., Eriksson, U., Falkevall, A. Imaging of neutral lipids by oil red O for analyzing the metabolic status in health and disease. Nature Protocols. 8 (6), 1149-1154 (2013).
- Diaz, G., Melis, M., Batetta, B., Angius, F., Falchi, A. M. Hydrophobic characterization of intracellular lipids in situ by Nile Red red/yellow emission ratio. Micron. 39 (7), 819-824 (2008).
- Duan, X., et al. The synthesis of polarity-sensitive fluorescent dyes based on the BODIPY chromophore. Dyes and Pigments. 89 (3), 217-222 (2011).
- Rumin, J., et al. The use of fluorescent Nile red and BODIPY for lipid measurement in microalgae. Biotechnology for Biofuels. 8, 42 (2015).
- Fam, T. K., Klymchenko, A. S., Collot, M. Recent advances in fluorescent probes for lipid droplets. Materials. 11 (9), 1768 (2018).
- Raboisson, D., Mounié, M., Maigné, É Diseases, reproductive performance, and changes in milk production associated with subclinical ketosis in dairy cows: A meta-analysis and review. Journal of Dairy Science. 97 (12), 7547-7563 (2014).
- Ospina, P. A., Nydam, D. V., Stokol, T., Overton, T. R. Associations of elevated nonesterified fatty acids and β-hydroxybutyrate concentrations with early lactation reproductive performance and milk production in transition dairy cattle in the northeastern United States. Journal of Dairy Science. 93 (4), 1596-1603 (2010).
- Campos-Espinosa, A., Guzmán, C. A model of experimental steatosis in vitro: hepatocyte cell culture in lipid overload-conditioned medium. Journal of Visualized Experiments. (171), e62543 (2021).
- Liu, L., et al. Effects of nonesterified fatty acids on the synthesis and assembly of very low density lipoprotein in bovine hepatocytes in vitro. Journal of Dairy Science. 97 (3), 1328-1335 (2014).
- Wang, L., Liu, J. Y., Miao, Z. J., Pan, Q. W., Cao, W. L. Lipid droplets and their interactions with other organelles in liver diseases. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 133, 105937 (2021).
- Sanjabi, B., et al. Lipid droplets hypertrophy: a crucial determining factor in insulin regulation by adipocytes. Scientific Reports. 5, 8816 (2015).
- Saponaro, C., Gaggini, M., Carli, F., Gastaldelli, A. The subtle balance between lipolysis and lipogenesis: a critical point in metabolic homeostasis. Nutrients. 7 (11), 9453-9474 (2015).
- Yang, A., Mottillo, E. P. Adipocyte lipolysis: from molecular mechanisms of regulation to disease and therapeutics. Biochemical Journal. 477 (5), 985-1008 (2020).
- Gluchowski, N. L., Becuwe, M., Walther, T. C., Farese, R. V. Lipid droplets and liver disease: from basic biology to clinical implications. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 14 (6), 343-355 (2017).
- Meex, R. C. R., Schrauwen, P., Hesselink, M. K. C. Modulation of myocellular fat stores: lipid droplet dynamics in health and disease. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 297 (4), 913-924 (2009).
- Sarnyai, F., et al. Effect of cis-and trans-monounsaturated fatty acids on palmitate toxicity and on palmitate-induced accumulation of ceramides and diglycerides. International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), 2626 (2020).
- Ricchi, M., et al. Differential effect of oleic and palmitic acid on lipid accumulation and apoptosis in cultured hepatocytes. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 24 (5), 830-840 (2009).
- Fei, W., et al. A role for phosphatidic acid in the formation of "supersized" lipid droplets. PLoS Genetics. 7 (7), e1002201 (2011).
- Kowada, T., Maeda, H., Kikuchi, K. BODIPY-based probes for the fluorescence imaging of biomolecules in living cells. Chemical Society Reviews. 44 (14), 4953-4972 (2015).
- Wang, J., et al. Application of the fluorescent dye BODIPY in the study of lipid dynamics of the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. Molecules. 23 (7), 1594 (2018).
