Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल बताता है कि लिपिड बूंदों (एलडी) को रंगने के लिए तेल लाल ओ का उपयोग कैसे करें, फैटी एसिड-प्रेरित फैटी हेपेटोसाइट मॉडल में एलडी के आकार और संख्या की गणना करें, और लाइव सेल इमेजिंग द्वारा बड़े एलडी में फ्यूज होने वाले छोटे एलडी की प्रक्रिया का निरीक्षण करने के लिए बीओडीआईपीवाई 493/503 का उपयोग करें।
Abstract
लिपिड ड्रॉपलेट्स (एलडी) ऑर्गेनेल हैं जो कोशिकाओं में लिपिड चयापचय और तटस्थ लिपिड भंडारण में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। वे विभिन्न प्रकार के चयापचय रोगों से जुड़े होते हैं, जैसे मोटापा, फैटी यकृत रोग और मधुमेह। यकृत कोशिकाओं में, एलडी के आकार और संख्या फैटी यकृत रोग के संकेत हैं। इसके अलावा, ऑक्सीडेटिव तनाव प्रतिक्रिया, सेल ऑटोफैगी और एपोप्टोसिस अक्सर एलडी के आकार और संख्या में परिवर्तन के साथ होते हैं। नतीजतन, एलडी के आयाम और मात्रा एलडी बायोजेनेसिस के तंत्र के बारे में वर्तमान शोध का आधार हैं। यहां, फैटी एसिड-प्रेरित गोजातीय यकृत कोशिकाओं में, हम वर्णन करते हैं कि एलडी को दागने के लिए तेल लाल ओ का उपयोग कैसे करें और एलडी के आकार और संख्या की जांच करें। एलडी के आकार वितरण का सांख्यिकीय विश्लेषण किया जाता है। छोटे एलडी के बड़े एलडी में फ्यूज होने की प्रक्रिया को लाइव सेल इमेजिंग सिस्टम द्वारा भी देखा जाता है। वर्तमान कार्य विभिन्न शारीरिक स्थितियों के तहत एलडी के आकार परिवर्तन की प्रवृत्ति का सीधे निरीक्षण करने का एक तरीका प्रदान करता है।
Introduction
हेपेटोसाइट्स में लिपिड ड्रॉपलेट (एलडी) संचय गैर-मादक फैटी यकृत रोग (एनएएफएलडी) की विशिष्ट विशेषता है, जो यकृत फाइब्रोसिस और हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा में प्रगति कर सकता है। यह पाया गया है कि फैटी यकृत रोग की सबसे पहली अभिव्यक्ति स्टीटोसिस है, जो हेपेटोसाइट1 के साइटोप्लाज्म में एलडी संचय की विशेषता है। लिवर स्टीटोसिस हमेशा एलडीएस2 की बढ़ी हुई संख्या और / या विस्तारित आकार से जुड़ा होता है। एलडी को एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) से उत्पन्न माना जाता है, जिसमें कोर के रूप में ट्राइग्लिसराइड (टीजी) होता है, और प्रोटीन और फॉस्फोलिपिड्स3 से घिरा होता है। टीजी भंडारण के लिए जिम्मेदार उपकोशिकीय अंग के रूप में, एलडी अपने आकार, संख्या, लिपिड संरचना, प्रोटीन और अन्य ऑर्गेनेल के साथ बातचीत के बारे में विभिन्न विशेषताओं का प्रदर्शन करते हैं, जिनमें से सभी सेल ऊर्जा होमियोस्टैसिस4 को प्रभावित करते हैं। टीजी स्तर एलडी के आकार के साथ सकारात्मक रूप से सहसंबद्ध है, और एक उच्च इंट्रासेल्युलर टीजी सामग्री बड़े एलडी5 का निर्माण कर सकती है। टीजी के स्थानीय संश्लेषण, ईआर में लिपिड निगमन और कई एलडी6 के संलयन के माध्यम से एलडी आकार में वृद्धि करते हैं। कोशिकाओं (एडिपोसाइट्स, हेपेटोसाइट्स, आदि) जिनमें बड़े एलडी होते हैं, उनमें एलडी संलयन द्वारा लिपिड भंडारण को कुशलतापूर्वक बढ़ाने के लिए एक विशेष तंत्र होता है। एलडी के गतिशील परिवर्तन सेल के विभिन्न ऊर्जा चयापचय राज्यों को दर्शाते हैं। ऐसी पद्धतियों को विकसित करना महत्वपूर्ण है जो स्वस्थ और असामान्य कोशिकाओं में विभिन्न यकृत एलडी के अवलोकन और विश्लेषण की अनुमति देते हैं।
एलडी के लिए मुख्य गैर-फ्लोरोसेंट रंजक सूडान ब्लैक बी और तेल लाल ओ सूडान ब्लैक बी दाग तटस्थ लिपिड, फॉस्फोलिपिड्स और स्टेरॉयड7 हैं। तेल लाल ओ मुख्य रूप से कंकाल की मांसपेशी, कार्डियोमायोसाइट्स, यकृत ऊतक, वसा कोशिकाओं आदि के एलडी को धुंधला करने के लिए उपयोग किया जाताहै, और चूहोंऔर मनुष्यों में यकृत स्टीटोसिस की मात्रात्मक पहचान के लिए एक मानक उपकरण माना जाता है। एलडी का गतिशील परिवर्तन मुख्य रूप से प्रतिदीप्ति रंगाई द्वारा किया जाता है। नील लाल और बीओडीआईपीवाई दोनों आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले फ्लोरोसेंट लिपिड रंजक10,11 हैं। नील लाल की तुलना में, बीओडीआईपीवाई में मजबूत ऊतक पारगम्यता होती है और एलडी12 के साथ बेहतर बांधती है। बीओडीआईपीवाई-लेबल वाले एलडी का उपयोग जीवित कोशिकाओं को धुंधला करने और अन्य ऑर्गेनेल13 के साथ सह-स्थानीयकरण के लिए किया जा सकता है।
मोनोगैस्ट्रिक जानवरों की तुलना में जुगाली करनेवाले जानवरों में फैटी यकृत रोग की घटना काफी अधिक है। संक्रमण अवधि के दौरान, डेयरी गायों को नकारात्मक ऊर्जा संतुलन की स्थिति का अनुभव होताहै। बड़ी मात्रा में गैर-एस्टरिफाइड फैटी एसिड (पामिटिक एसिड, ओलिक एसिड, लिनोलिक एसिड, आदि) गोजातीय हेपेटोसाइट्स में टीजी में संश्लेषित होते हैं, जिससे यकृत कार्यात्मक असामान्यता होती है और दूध उत्पादों की गुणवत्ता औरउत्पादन दक्षता बहुत कम हो जाती है। वर्तमान अध्ययन का उद्देश्य एलडी के आकार और संख्या का विश्लेषण करने के साथ-साथ एलडी संलयन गतिशीलता की निगरानी के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करना है। हमने हेपेटोसाइट्स16 में लिनोलिक एसिड (एलए) की विभिन्न सांद्रता को जोड़कर एलडी गठन का एक मॉडल बनाया और तेल लाल ओ के साथ एलडी को धुंधला करके प्रक्रिया के दौरान एलडी के आकार और संख्या में परिवर्तन देखा। इसके अलावा, एलडी के तेजी से संलयन की प्रक्रिया को बीओडीआईपीवाई 493/503 के साथ धुंधला करके भी देखा गया था।
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Protocol
सभी प्रक्रियाओं को हेनान कृषि विश्वविद्यालय (हेनान प्रांत, चीन) की पशु देखभाल समिति के नैतिक मानकों के अनुसार अनुमोदित और प्रदर्शन किया गया था।
1. गोजातीय हेपेटोसाइट सेल कल्चर
- कमरे के तापमान पर 4 मिनट के लिए प्राथमिक हेपेटोसाइट कोशिकाओंको 17 और सेंट्रीफ्यूज 400 एक्स जी पिघलाएं।
नोट: प्राथमिक हेपेटोसाइट कोशिकाओं को पहले प्रकाशित रिपोर्ट17 के बाद सुसंस्कृत और बनाए रखा गया था। - जमे हुए भंडारण समाधान को पिपेट के साथ छोड़ दें और इसे 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और डलबेकको के संशोधित ईगल ्स मीडियम (डीएमईएम) युक्त 1 एमएल माध्यम के साथ निलंबित करें। इसके बाद, प्रति मिलीलीटर कोशिकाओं की संख्या की गणना करने के लिए एक सेल काउंटिंग चैंबर का उपयोग करें, और फिर उपरोक्त सेल निलंबन की एकाग्रता की गणना करें और सेल एकाग्रता को 1 x 107 सेल / एमएल में समायोजित करें।
- सेल सस्पेंशन को 60 मिमी सेल कल्चर डिश में जोड़ें जिसमें उपरोक्त माध्यम के 3 एमएल शामिल हैं। कोशिकाओं को कल्चर करें और उन्हें 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट करें।
- जब कोशिकाएं 80% तक बढ़ जाती हैं, तो माध्यम को त्याग दें और फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) से कुल्ला करें, फिर कोशिकाओं को पचाने के लिए 0.25% ट्रिप्सिन के 750 μL जोड़ें। 3 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें, फिर उन्हें 10% एफबीएस की समान मात्रा के साथ बेअसर करें। कमरे के तापमान पर 4 मिनट के लिए 200 x g पर सेंट्रीफ्यूज करने के लिए सेल सस्पेंशन इकट्ठा करें।
2. तेल लाल ओ धुंधला
- ग्लास कवरलिप्स युक्त 24-वेल सेल कल्चर प्लेट के प्रत्येक कुएं में 10% एफबीएस और डीएमईएम युक्त 800 μL कल्चर माध्यम जोड़ें। सेल सस्पेंशन का 50 μL लें (चरण 1.3 में प्राप्त) और इसे मिश्रण करने के लिए पीबीएस के 950 μL में जोड़ें। प्रति मिलीलीटर कोशिकाओं की संख्या की गणना करने के लिए एक सेल गिनती कक्ष का उपयोग करें, और फिर उपरोक्त सेल निलंबन की एकाग्रता की गणना करें। अंत में, प्रत्येक कुएं में सेल एकाग्रता को 4 x 104 / एमएल में समायोजित करें और 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट करें।
- 24 घंटे के बाद, संस्कृति माध्यम को त्याग दें और पीबीएस से धो लें। डीएमईएम प्रेरण माध्यम के 800 μL के साथ निलंबित करें जिसमें 1 मिलीग्राम / एमएल गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) होता है।
- निर्जल इथेनॉल के 900 μL में कुल 100 μL LA ( सामग्री की तालिका देखें) को घोलें और एक मानक समाधान (100 mmol / L) तैयार करें। 24-वेल प्लेट में 0 μmol/L, 100 μmol/L, 150 μmol/L, और 200 μmol/L LA का ढाल जोड़ें। प्रत्येक उपचार को चार बार दोहराएं। 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट करें।
- कल्चर माध्यम को हटा दें और पीबीएस के साथ कोशिकाओं को तीन बार धोएं। 20 मिनट के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के 400 μL के साथ ठीक करें। फिक्सेटिव समाधान को त्याग दें और इसे पीबीएस के साथ तीन बार धो लें।
- 5 मिनट के लिए 60% आइसोप्रोपिल अल्कोहल के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें, फिर इसे छोड़ दें। 20-30 मिनट के लिए ताजा तैयार तेल लाल ओ वर्किंग सॉल्यूशन (सामग्री की तालिका देखें) (तेल लाल ओ: पानी का 3: 2 अनुपात) जोड़ें और धुंधला घोल छोड़ दें। पीबीएस के साथ कोशिकाओं को दो से पांच बार धोएं जब तक कि कोई अतिरिक्त डाई समाधान न हो।
- हेमटोक्सीलिन धुंधला घोल (हेमटोक्सीलिन: 1: 10 का पानी अनुपात) के 300 μL जोड़ें और नाभिक को 1-2 मिनट के लिए फिर से डाई करें। डाई घोल को त्याग दें और पीबीएस के साथ कोशिकाओं को दो से पांच बार धोएं। 24-वेल प्लेट से ग्लास कवरलिप्स को बाहर निकालें और स्लाइड पर 10 μL टैबलेट सीलेंट ( सामग्री की तालिका देखें) छोड़ने के बाद उन्हें सूक्ष्म स्लाइड (नीचे की ओर कोशिकाओं के साथ साइड) पर रखें।
- सील करने के बाद, ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के तेल लेंस के तहत कोशिकाओं के एलडी का निरीक्षण और छवि बनाएं ( सामग्री की तालिका देखें)। सेलसेंस सॉफ्टवेयर द्वारा एलडी के व्यास को मापें और एलडी की संख्या और आकार का विश्लेषण करें।
3. एलडी के आकार और संख्या का माप
- छवियों को कैप्चर करें: कंप्यूटर और माइक्रोस्कोप स्विच को क्रमिक रूप से चालू करें, स्लाइड को लोडिंग प्लेटफॉर्म पर रखें, छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर खोलें ( सामग्री की तालिका देखें), और छवि देखने के लिए कंप्यूटर को कनेक्ट करें।
- कम शक्ति पर छवियों को ढूंढें और इमेजिंग स्लाइड पर उचित मात्रा में देवदार का तेल टपकाएं। अवलोकन कारक को 100x पर समायोजित करें, स्वचालित एक्सपोज़र सेट करें, और दृश्य के उपयुक्त क्षेत्र को समायोजित करके छवियों को कैप्चर करें। इमेजिंग के लिए प्रत्येक समूह के लिए तीन दाग वाली सेल स्लाइड का चयन करें।
- व्यास माप: व्यास को मापने के लिए प्रत्येक छवि के लिए यादृच्छिक रूप से 60 एलडी का चयन करें। प्रत्येक छवि के माप के बाद, छवियों को सहेजें और एलडी के औसत आकार और वितरण अनुपात के बाद के विश्लेषण के लिए माप परिणामों को एक तालिका में आउटपुट करें।
- मात्रा माप: प्रत्येक दाग और फोटो खिंचवाने वाली स्लाइड के लिए तीन छवियों का चयन करें, और प्रत्येक चित्र में मात्रा माप के लिए यादृच्छिक रूप से तीन कक्षों का चयन करें। सेल के चारों ओर एलडी की संख्या की गणना और विश्लेषण करें, और सेल में एलडी की औसत संख्या की गणना करें।
4. एलडी संलयन का गतिशील अवलोकन
- चरण 1.1-1.3 में उल्लिखित कक्ष संस्कृति चरणों का पालन करें। जब कोशिकाएं 80% तक बढ़ जाती हैं, तो माध्यम को त्याग दें और पीबीएस के साथ कुल्ला करें, फिर उन्हें 3 मिनट के लिए ट्रिप्सिन के 750 μL के साथ पचाएं। इसके बाद, मध्यम के 750 μL जोड़ें, कमरे के तापमान पर 4 मिनट के लिए 200 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें, और सतह पर तैरनेवाला को छोड़ दें।
- 1 एमएल कल्चर माध्यम में कोशिकाओं को निलंबित करें, गिनती करें, और 35 मिमी डिश में सेल एकाग्रता को 5 x 105 कोशिकाओं / एमएल में समायोजित करें। 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर संस्कृति।
- जब कोशिकाएं 80% तक बढ़ जाती हैं, तो 24 घंटे के लिए माध्यम को डीएमईएम + 150 μmol / L LA में बदलें, और LDs को जमा करने के लिए 37 °C और 5%CO2 पर इनक्यूबेटर में संस्कृति जारी रखें।
- 24 घंटे के बाद, संस्कृति माध्यम को हटा दें। पीबीएस के साथ अनुयायी कोशिकाओं को धोएं और उन्हें 30 मिनट के लिए अंधेरे में 10 μg / mL BODIPY 493/503 तटस्थ फ्लोरोसेंट जांच ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के बाद, पीबीएस के साथ कल्चर डिश में कोशिकाओं को तीन बार धोएं और डीएमईएम + 150 μmol / L LA जोड़ें।
नोट: 10 μg / mL BODIPY धुंधला होने के दौरान और बाद में प्रकाश के संपर्क से बचें; 1 मिलीग्राम / एमएल बीओडीआईपीवाई को पीबीएस (1: 100) के साथ पतला किया गया था। - एलडी के गतिशील परिवर्तनों का निरीक्षण करने के लिए लिविंग सेल स्टेशन ( सामग्री की तालिका देखें) के माइक्रोस्कोप के खांचे में कल्चर डिश रखें। शुरुआती अनुक्रम के अनुसार जीवित सेल वर्कस्टेशन की शक्ति चालू करें और प्रकाश से बचें।
- पावर, ट्रांसमिशन लाइट सोर्स, माइक्रोस्कोप पावर सोर्स, पारा लैंप फ्लोरोसेंट लाइट सोर्स, चार्ज-युग्मित डिवाइस (सीसीडी) कैमरा पावर सोर्स, कंप्यूटर होस्ट पावर सोर्स, सीओ 2 वाल्व और सीओ2 इनक्यूबेटर चालू करें।
- लोडिंग प्लेटफॉर्म पर नाली में आसुत जल जोड़ें, यह सुनिश्चित करें कि एयर वेंट पर न जाए।
- कंप्यूटर चालू करें और "एनआईएस-तत्व" चलाएँ। सबसे पहले, 4x ऑब्जेक्टिव लेंस पर दृश्य का उपयुक्त क्षेत्र खोजें, फिर इसे क्रमिक रूप से 40x ऑब्जेक्टिव लेंस में समायोजित करें। माइक्रोस्कोप में नमूने को देखने के लिए ई 100 और कंप्यूटर पर नमूने का पूर्वावलोकन और फोटोग्राफ करने के लिए एल 100 का चयन करें।
नोट: ई 100 और एल 100 जीवित सेल वर्कस्टेशन ( सामग्री की तालिका देखें) पर माइक्रोस्कोप समायोजन बटन हैं, जो क्रमशः आईपीस और कंप्यूटर स्क्रीन का प्रतिनिधित्व करते हैं। - प्रतिदीप्ति चैनल (जैसे, पीएच -40 एक्स, फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट [एफआईटीसी], शटर) जैसे मापदंडों को डिजाइन करें और प्रयोग के लिए अपेक्षित शूटिंग समय। शूटिंग का समय समय निर्धारित करें, जिसमें हर दो छवियों के बीच 5 मिनट का शूटिंग अंतराल समय और 6 घंटे का कुल शूटिंग समय शामिल है।
नोट: लंबे समय तक शूटिंग को सही फोकस सिस्टम (पीएफएस) फोकस स्थिरीकरण फ़ंक्शन का उपयोग करने की आवश्यकता है। इसके लिए, पहले दृष्टि के क्षेत्र और फोकस लंबाई को समायोजित करें, फिर कंप्यूटर स्क्रीन पर पीएफएस पर क्लिक करें, और अंत में ठीक फोकस सर्पिल को समायोजित करें। - विभिन्न चैनल मोड, एकल चैनल या सभी का चयन करें, दृश्य के एक अलग फ़ील्ड का चयन करें, पूर्वावलोकन पर क्लिक करें, दृश्य के क्षेत्र को समायोजित करें, इन मापदंडों को सेट करें, और शूटिंग शुरू करने के लिए चलना शुरू करें पर क्लिक करें। पहले 5 मिनट के लिए एक परीक्षण शॉट लें; ऑपरेशन सामान्य होने के बाद इसमें लंबा समय लग सकता है।
- शूटिंग पूरी होने के बाद, 'एवीआई' प्रारूप में वीडियो में डेटा निर्यात करने के लिए फ़ाइल > सेव > टाइप > एवी प्रारूप के रूप में सहेजें चुनें। डेटा प्रोग्राम को सहेजने और फ़ोटो निर्यात करने के लिए '.nd2' छवि स्वरूप का उपयोग करें।
- मशीन को बंद करने के लिए, इसे रिवर्स ऑर्डर में बंद कर दें।
5. सांख्यिकी और परिणाम विश्लेषण
- एक-तरफ़ा एनोवा का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण करें। परिणामों को औसत ± मानक त्रुटि के रूप में रिपोर्ट करें.
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Representative Results
सेल एलडी का धुंधलापन चित्र 1 में दिखाया गया है। लाल बिंदु सेल एलडी को दर्शाते हैं, और नीले बिंदु नाभिक को दर्शाते हैं। यह देखा जा सकता है कि एलए के उपचार के तहत प्रत्येक तस्वीर में एलडी का आकार और संख्या अलग-अलग है।
एलए खुराक में वृद्धि के साथ, एलए एकाग्रता (चित्रा 2) के आधार पर औसत व्यास और एलडी की संख्या में काफी वृद्धि की प्रवृत्ति देखी गई। जैसा कि चित्रा 2 ए में दिखाया गया है, प्रति सेल एलडी की संख्या एलए की विभिन्न सांद्रता के साथ नकारात्मक रूप से सहसंबद्ध थी। प्रति सेल औसत एलडी संख्या 100 μmol / L LA उपचारित समूह के लिए 136 थी, जो क्रमशः 150 μmol / L और 200 μmol / L एलए उपचारित समूहों के लिए 118 और 105 तक कम हो गई। नियंत्रण समूह में LDs का औसत व्यास 0.72 μm, 100 μmol/L LA उपचारित समूह के लिए 1.38 μm, 150 μmol/L LA उपचारित समूह के लिए 1.51 μm और 200 μmol/L LA उपचारित समूह के लिए 1.64 μm था (चित्रा 2B)।
इस अध्ययन में, व्यास <1 μm वाले LDs को छोटे के रूप में परिभाषित किया गया था, और व्यास >4 μm वाले LD को बड़े के रूप में परिभाषित किया गया था। यह पाया गया कि एलए एकाग्रता के साथ एलडी का वितरण अनुपात भी बदल गया, जैसा कि चित्र 3 में दिखाया गया है; छोटे एलडी का अनुपात कम हो गया, और बड़े एलडी का अनुपात बढ़ गया। छोटे व्यास वाले LDs का अनुपात 100 μmol / L LA पर 43.33%, 150 μmol / L LA पर 36.43% और 200 μmol / L LA पर 29.8% था। बड़े व्यास वाले LDs के लिए, उच्चतम अनुपात 200 μmol / L LA में 6.11% था, फिर 150 और 100 μmol / L LA में क्रमशः 3.15% और 1.48% था। 200 μmol / L LA समूह में, सुपर बड़े LDs (व्यास >5 μm) स्पष्ट रूप से देखे गए थे, जो लगभग 6.30% के लिए जिम्मेदार थे, जो 100 μmol / L LA (5.93%) और 150 μmol / L LA (4.82%) समूहों से अधिक थे। परिणामों ने संकेत दिया कि एलए की उच्च सांद्रता ने एलडी के आकार में वृद्धि की और एलडी की संख्या में कमी आई। इस बीच, बड़े एलडी का अनुपात बढ़ गया, और छोटे एलडी का अनुपात कम हो गया।
बड़े LD आमतौर पर छोटे LDs के संलयन के माध्यम से बनते थे। इसे साबित करने के लिए लाइव सेल इमेजिंग के माध्यम से LD संलयन देखा गया था (चित्रा 4)। कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए 150 μmol / L LA के साथ इलाज किया गया और BODIPY के साथ दाग दिया गया। 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर सामान्य सेल बढ़ने की स्थिति के तहत, कोशिकाओं को लाइव सेल वर्कस्टेशन के साथ 6 घंटे तक लगातार देखा गया। तस्वीरें हर 5 मिनट में ली जाती हैं। जैसा कि चित्र 4 में दिखाया गया है, पहले 15 मिनट में, अभी भी स्पष्ट छोटे एलडी थे। फिर, एलडी धीरे-धीरे 20 मिनट से फ्यूज होने लगे, और 35 मिनट तक पूरी तरह से बड़े एलडी में जुड़ गए।
चित्र 1: लिपिड बूंदें। हेपेटोसाइट कोशिकाएं एलए की विभिन्न सांद्रता में संवर्धित होती हैं और तेल लाल ओ से सना होता है। लाल बिंदु तेल लाल से सना एलडी को प्रतिबिंबित करते हैं, और नीले-बैंगनी बिंदु हेमटोक्सिलिन के साथ नाभिक को प्रतिबिंबित करते हैं। प्रत्येक उपचार में धुंधला और इमेजिंग के लिए तीन ग्लास स्लाइड का चयन किया गया था। स्केल बार = 10 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2: LDs की संख्या और आकार। हेपेटोसाइट कोशिकाओं को 0 से 200 μmol / L LA तक सांद्रता ढाल में संवर्धित किया जाता है और तेल लाल O. (A) प्रति सेल LD की औसत संख्या से सना होता है। प्रत्येक समूह में 27 कोशिकाओं में एलडी की संख्या की गणना की गई थी। (बी) एक सेल में एलडी का औसत व्यास। प्रत्येक समूह में 60 एलडी का आकार गिना गया था। * पी < 0.05; ** पी < 0.01; पी < 0.001; पी < 0.0001. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3: एलडी अनुपात। एलए की विभिन्न सांद्रता में संवर्धित हेपेटोसाइट कोशिकाएं और तेल लाल ओ से सना हुआ है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4: एलडी संलयन। हेपेटोसाइट कोशिकाओं को 150 μmol / L LA के साथ संवर्धित किया गया था और BODIPY 493/503 जांच के साथ इनक्यूबेट किया गया था। 40x आवर्धन छवि के तहत 6 घंटे के लिए निरंतर अवलोकन के बाद, प्रतिदीप्ति और उज्ज्वल क्षेत्रों के तहत एलडी की तस्वीर ली गई। तस्वीरें हर 5 मिनट में ली जाती हैं। फ्यूजन को लाल बक्से के साथ चिह्नित किया गया था। स्केल बार = 20 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
पैथोलॉजिकल राज्यों के आधार पर, हेपेटिक एलडी उनके आकार और संख्या में जबरदस्त बदलाव से गुजरते हैं। एलडी व्यापक रूप से हेपेटोसाइट कोशिकाओं में मौजूद हैं और यकृत स्वास्थ्य और रोग18 में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। एलडी की मात्रा और आकार एलडीएस19 के बायोजेनेसिस पर वर्तमान शोध का आधार हैं। कोशिकाओं और ऊतकों के लिए एलडी का आकार और संख्या ऊर्जा को संग्रहीत करने और जारी करने की उनकी क्षमता को दर्शाती है। एलडी के गतिशील परिवर्तन लिपिड चयापचय गतिविधियों की स्थिरता को बनाए रखते हैं20,21. एलडी का एक असामान्य संचय विभिन्न रोग स्थितियों में होता है और चयापचय रोग22,23 का संकेतक हो सकता है। यह प्रोटोकॉल फैटी एसिड-प्रेरित हेपेटोसाइट सेल मॉडल में एलडी के आकार और मात्रा को मापने के लिए एक सटीक विधि प्रदान करता है और एलडी के संलयन को अधिक कुशलतापूर्वक और सहज रूप से देखता है।
लिपिड चयापचय विकारों और प्रभावी हस्तक्षेप से संबंधित बीमारियों की घटना को समझने के लिए एलडी के आकार और गतिशील परिवर्तनों का अध्ययन करना बहुत महत्वपूर्ण है। इस प्रयोग में, प्रमुख कदम एलडी के आकार और मात्रा का माप और विश्लेषण थे। सबसे पहले, हेपेटोसाइट्स में एलडी संचय को प्रेरित करने के लिए एलए की विभिन्न सांद्रता का उपयोग किया गया था। अन्य फैटी एसिड, जैसे कि ओलेट और पामिटेट, का उपयोग हेपेटोसाइट कोशिकाओं24,25 में एलडी संचय का कारण बनने के लिए भी किया जा सकता है। एलए की विभिन्न सांद्रता के साथ उपचार के बाद, यह पाया गया कि एलडी का आकार खुराक-निर्भर तरीके से बढ़ाया गया था। इन परिणामों ने संकेत दिया कि तेल लाल ओ धुंधला ने एलडी के व्यास को सटीक रूप से मापा। यह भी पाया गया कि एलए की उच्च सांद्रता बड़े आकार के एलडी के अनुपात को बढ़ा सकती है, यह सुझाव देते हुए कि छोटे एलडी तेजी से एक दूसरे के साथ जुड़े हुए हैं। तेजी से संलयन एलडी में गतिशील परिवर्तनों में से एक है; एलडी तेजी से संलयन कुछ मिनटों या यहां तक कि दसियों सेकंड के भीतर हो सकता है, और यह मुख्य रूप से इसकी सतह फॉस्फोलिपिड्स और प्रोटीन22,26 द्वारा मध्यस्थता की जाती है। वर्तमान अध्ययन में, एलडी संलयन को एक जीवित सेल वर्कस्टेशन द्वारा बीओडीआईपीवाई 493/503 लेबलिंग का उपयोग करके 20 मिनट से 35 मिनट तक स्पष्ट रूप से देखा गया था। छवियों के बीच शूटिंग अंतराल कुछ सेकंड से मिनट में सेट किया जा सकता है, और कुल शूटिंग समय 1 घंटे से कई दिनों तक सेट किया जा सकता है, जो विभिन्न कोशिकाओं में एलडी के गतिशील परिवर्तनों को देखने के लिए सुविधा प्रदान करता है।
एलडी के आकार के धुंधला विश्लेषण के संदर्भ में, तेल लाल ओ धुंधला फ्लोरोसेंट धुंधला होने की तुलना में अधिक सुविधाजनक और सस्ता है, और एलडी9 के स्पष्ट आकार को मापने के लिए अधिक व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। इसे प्रकाश के खिलाफ इलाज करने की आवश्यकता नहीं है। इसके अलावा, उपकरण आवश्यकताओं को प्राप्त करना कठिन नहीं है, और एक साधारण ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के तेल लेंस का उपयोग फोटो अवलोकन के लिए किया जा सकता है। इस विधि का उपयोग करके, शोधकर्ता एलडी के आकार और मात्रा को यादृच्छिक रूप से मापने के लिए छवियों के कई समूहों का चयन कर सकते हैं; यह संचालित करने के लिए सरल और सुविधाजनक है, और नमूना आकार बढ़ा सकता है और त्रुटि को कम कर सकता है। इसके अलावा, मापा और विश्लेषण किए गए एलडी आकार के अनुसार, विभिन्न एलडी आकारों का वितरण अनुपात सीधे देखा जा सकता है। तेल लाल ओ धुंधला होने के बाद उपरोक्त विधि द्वारा सांख्यिकीय विश्लेषण किया जा सकता है, और इस विधि को लिपिड संचय से प्रभावित कोशिकाओं की एक विस्तृत श्रृंखला सहित अन्य कोशिकाओं पर भी लागू किया जा सकता है। शुरुआती रंगाई चरण में, यह पाया गया कि रंगाई के बाद तेल लाल ओ को साफ करना आसान नहीं था, और पर्याप्त डाई पत्रिका अवशेष थे। बाद के चरण में, डाई को फ़िल्टर किया गया था, और निरंतर परीक्षणों के माध्यम से उचित रंगाई समय का चयन किया गया था। रंगाई के बाद, सफाई के समय को बढ़ाने से उपरोक्त समस्या से बचा जा सकता है।
BODIPY 493/503 फ्लोरोसेंट डाई एलडी विज़ुअलाइज़ेशन27 के लिए सबसे आम जांच में से एक है। इस अध्ययन में, एलडी संलयन को बीओडीआईपीवाई के साथ एलडी ग्रीन लेबल करके और एक जीवित सेल वर्कस्टेशन के साथ प्रक्रिया का अवलोकन करके किया गया था। नील लाल तटस्थ लिपिड के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किया जाने वाला फ्लोरोसेंट डाई भी है, लेकिन इसकी विस्तृत उत्तेजना बैंड (450-560 एनएम), गैर-विशिष्ट धुंधलापन, खराब ऊतक पारगम्यता और अन्य कमियां एलडी धुंधला होने के परिणामों को कुछ हद तक प्रभावित कर सकती हैं। नील लाल प्रतिदीप्ति धुंधला होने की तुलना में, बीओडीआईपीवाई 493/503 का उत्तेजना बैंड संकरा (460-490 एनएम) था, और इसे विभिन्न फ्लोरोसेंट रंगों11 के साथ सह-लेबल किया जा सकता है। दूसरे, बीओडीआईपीवाई प्रभावी रूप से पौधे पिगमेंट28 के हस्तक्षेप से बचता है। अंत में, बीओडीआईपीवाई में मजबूत ऊतक पारगम्यता, पर्यावरणीय ध्रुवीयता के प्रति कम संवेदनशीलता है, और12 को बुझाना आसान नहीं है; इसलिए, यह व्यापक रूप से एलडी के प्रतिदीप्ति धुंधला होने में उपयोग किया जाता है। हालांकि, एलडी संलयन के विश्लेषण की कुछ सीमाएं हैं। जीवित कोशिकाओं की निरंतर अवलोकन छवि प्राप्त करने के लिए, लेंस को स्थानांतरित नहीं किया जा सकता है, इसलिए दृष्टि में केवल एक स्थानीय एलडी संलयन देखा जा सकता है, और पूरे सेल की एलडी संलयन दक्षता का अधिक सटीक विश्लेषण नहीं किया जा सकता है।
निष्कर्ष में, यह अध्ययन एलडी आकृति विज्ञान और आकार विश्लेषण के लिए एक सरल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि प्रदान करता है, जिसे सेलुलर लिपिड चयापचय का अध्ययन करने में एलडी विश्लेषण के लिए व्यापक रूप से लागू किया जा सकता है। इस काम ने एलडी संलयन की प्रक्रिया को भी साबित किया, जिससे भविष्य में एलडी के आगे के अध्ययन की नींव रखी गई।
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Disclosures
लेखक ों ने घोषणा की है कि उनके पास हितों का कोई टकराव नहीं है।
Acknowledgments
इस शोध को संयुक्त रूप से चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (U1904116) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin | Gibco | 25200072 | reagent |
| 4% paraformaldehyde | Solarbio | P1110 | reagent |
| BODIPY 493/503 | invitrogen | 2295015 | reagent |
| Cedar oil | Solarbio | C7140 | reagent |
| cell counting chamber | equipment | ||
| cell culture dish | Corning | 353002 | material |
| cell sens software | Olympus IX73 | software | |
| Centrifuge | Eppendorf | equipment | |
| DMEM | HyClone | SH30022.01 | reagent |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 2492319 | reagent |
| hematoxylin | DingGuo | AR0712 | reagent |
| Image view | image analysis sodtware | ||
| linoleic acid | Solarbio | SL8520 | reagent |
| Live Cell Station | Nikon A1 HD25 | equipment | |
| NIS-Elements | Nikon | software | |
| oil red O | Solarbio | G1260 | reagent |
| optical microscope | Olympus IX73 | equipment | |
| Penicillin & Streptomycin 100× | NCM Biotech | CLOOC5 | reagent |
| Phosphate Buffered Saline | HyClone | SH30258.01 | reagent |
| Pipette | Eppendorf | equipment | |
| Sealing agent | Solarbio | S2150 | reagent |
References
- Fujimoto, T., Parton, R. G. Not just fat: the structure and function of the lipid droplet. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (3), 004838 (2011).
- Grasselli, E., et al. Models of non-alcoholic fatty liver disease and potential translational value: The effects of 3,5-L-diiodothyronine. Annals of Hepatology. 16 (5), 707-719 (2017).
- Herdt, T. H. Ruminant adaptation to negative energy balance: Influences on the etiology of ketosis and fatty liver. Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice. 16 (2), 215-230 (2000).
- Pino-de la Fuente, F., et al. Exercise regulation of hepatic lipid droplet metabolism. Life Sciences. 298, 120522 (2022).
- O'Connor, D., Byrne, A., Berselli, G. B., Long, C., Keyes, T. E. Mega-stokes pyrene ceramide conjugates for STED imaging of lipid droplets in live cells. Analyst. 144 (5), 1608-1621 (2019).
- Gao, G., et al. Control of lipid droplet fusion and growth by CIDE family proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA). Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (10), 1197-1204 (2017).
- Tütüncü Konyar, S. Dynamic changes in insoluble polysaccharides and neutral lipids in the developing anthers of an endangered plant species, Pancratium maritimum. Plant Systematics and Evolution. 304, 397-414 (2018).
- Spangenburg, E. E., Pratt, S. J. P., Wohlers, L. M., Lovering, R. M. Use of BODIPY (493/503) to visualize intramuscular lipid droplets in skeletal muscle. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 598358 (2011).
- Mehlem, A., Hagberg, C. E., Muhl, L., Eriksson, U., Falkevall, A. Imaging of neutral lipids by oil red O for analyzing the metabolic status in health and disease. Nature Protocols. 8 (6), 1149-1154 (2013).
- Diaz, G., Melis, M., Batetta, B., Angius, F., Falchi, A. M. Hydrophobic characterization of intracellular lipids in situ by Nile Red red/yellow emission ratio. Micron. 39 (7), 819-824 (2008).
- Duan, X., et al. The synthesis of polarity-sensitive fluorescent dyes based on the BODIPY chromophore. Dyes and Pigments. 89 (3), 217-222 (2011).
- Rumin, J., et al. The use of fluorescent Nile red and BODIPY for lipid measurement in microalgae. Biotechnology for Biofuels. 8, 42 (2015).
- Fam, T. K., Klymchenko, A. S., Collot, M. Recent advances in fluorescent probes for lipid droplets. Materials. 11 (9), 1768 (2018).
- Raboisson, D., Mounié, M., Maigné, É Diseases, reproductive performance, and changes in milk production associated with subclinical ketosis in dairy cows: A meta-analysis and review. Journal of Dairy Science. 97 (12), 7547-7563 (2014).
- Ospina, P. A., Nydam, D. V., Stokol, T., Overton, T. R. Associations of elevated nonesterified fatty acids and β-hydroxybutyrate concentrations with early lactation reproductive performance and milk production in transition dairy cattle in the northeastern United States. Journal of Dairy Science. 93 (4), 1596-1603 (2010).
- Campos-Espinosa, A., Guzmán, C. A model of experimental steatosis in vitro: hepatocyte cell culture in lipid overload-conditioned medium. Journal of Visualized Experiments. (171), e62543 (2021).
- Liu, L., et al. Effects of nonesterified fatty acids on the synthesis and assembly of very low density lipoprotein in bovine hepatocytes in vitro. Journal of Dairy Science. 97 (3), 1328-1335 (2014).
- Wang, L., Liu, J. Y., Miao, Z. J., Pan, Q. W., Cao, W. L. Lipid droplets and their interactions with other organelles in liver diseases. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 133, 105937 (2021).
- Sanjabi, B., et al. Lipid droplets hypertrophy: a crucial determining factor in insulin regulation by adipocytes. Scientific Reports. 5, 8816 (2015).
- Saponaro, C., Gaggini, M., Carli, F., Gastaldelli, A. The subtle balance between lipolysis and lipogenesis: a critical point in metabolic homeostasis. Nutrients. 7 (11), 9453-9474 (2015).
- Yang, A., Mottillo, E. P. Adipocyte lipolysis: from molecular mechanisms of regulation to disease and therapeutics. Biochemical Journal. 477 (5), 985-1008 (2020).
- Gluchowski, N. L., Becuwe, M., Walther, T. C., Farese, R. V. Lipid droplets and liver disease: from basic biology to clinical implications. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 14 (6), 343-355 (2017).
- Meex, R. C. R., Schrauwen, P., Hesselink, M. K. C. Modulation of myocellular fat stores: lipid droplet dynamics in health and disease. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 297 (4), 913-924 (2009).
- Sarnyai, F., et al. Effect of cis-and trans-monounsaturated fatty acids on palmitate toxicity and on palmitate-induced accumulation of ceramides and diglycerides. International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), 2626 (2020).
- Ricchi, M., et al. Differential effect of oleic and palmitic acid on lipid accumulation and apoptosis in cultured hepatocytes. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 24 (5), 830-840 (2009).
- Fei, W., et al. A role for phosphatidic acid in the formation of "supersized" lipid droplets. PLoS Genetics. 7 (7), e1002201 (2011).
- Kowada, T., Maeda, H., Kikuchi, K. BODIPY-based probes for the fluorescence imaging of biomolecules in living cells. Chemical Society Reviews. 44 (14), 4953-4972 (2015).
- Wang, J., et al. Application of the fluorescent dye BODIPY in the study of lipid dynamics of the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. Molecules. 23 (7), 1594 (2018).
