Summary
Detta protokoll beskriver hur man använder oljeröd O för att färga lipiddroppar (LD), beräkna storleken och antalet LD i en fettsyrainducerad fetthepatocytmodell och använda BODIPY 493/503 för att observera processen med små LD som smälter samman till stora LD genom levande cellavbildning.
Abstract
Lipiddroppar (LD) är organeller som spelar en viktig roll i lipidmetabolism och neutral lipidlagring i celler. De är förknippade med en mängd olika metaboliska sjukdomar, såsom fetma, fettlever och diabetes. I leverceller är storleken och antalet LD tecken på fettlever. Dessutom åtföljs den oxidativa stressreaktionen, cellautofagi och apoptos ofta av förändringar i storleken och antalet LD. Som ett resultat är dimensionerna och kvantiteten av LD grunden för den aktuella forskningen om mekanismen för LD-biogenes. Här, i fettsyrainducerade bovina leverceller, beskriver vi hur man använder oljeröd O för att färga LD och för att undersöka storleken och antalet LD. Storleksfördelningen av LD analyseras statistiskt. Processen med små LD smälter samman till stora LD observeras också av ett levande cellavbildningssystem. Det nuvarande arbetet ger ett sätt att direkt observera storleksförändringstrenden för LD under olika fysiologiska förhållanden.
Introduction
Lipiddroppe (LD) ackumulering i hepatocyter är den typiska egenskapen för alkoholfri fettleversjukdom (NAFLD), som kan utvecklas till leverfibros och hepatocellulärt karcinom. Det har visat sig att den tidigaste manifestationen av fettleversjukdom är steatos, kännetecknad av LD-ackumulering i cytoplasman hos hepatocyt1. Leverstatos är alltid associerad med ett ökat antal och/eller utökad storlek av LDs2. LDs tros genereras från endoplasmatisk retikulum (ER), bestående av triglycerid (TG) som kärna, och omges av proteiner och fosfolipider3. Som den subcellulära organellen som är ansvarig för TG-lagring uppvisar LD olika egenskaper när det gäller deras storlek, antal, lipidsammansättning, proteiner och interaktion med andra organeller, som alla påverkar cellenergihomeostas4. TG-nivån är positivt korrelerad med storleken på LDs, och ett högre intracellulärt TG-innehåll kan bilda större LDs5. LD ökar i storlek genom den lokala syntesen av TG, lipidinkorporering i ER och fusion av flera LDs6. Celler (adipocyter, hepatocyter, etc.) som innehåller stora LD har en speciell mekanism för att effektivt öka lipidlagring genom LD-fusion. De dynamiska förändringarna av LD återspeglar cellens olika energimetabolismstillstånd. Det är viktigt att utveckla metoder som möjliggör observation och analys av de olika hepatiska LD i friska och onormala celler.
De viktigaste icke-fluorescerande färgämnena för LD är Sudan Black B och oljeröd O. Sudan Black B fläckar neutrala lipider, fosfolipider och steroider7. Oljeröd O används huvudsakligen för färgning av LD i skelettmuskulatur, kardiomyocyter, levervävnad, fettceller etc8., och anses vara ett standardverktyg för kvantitativ detektion av leverstatos hos möss och människor9. Den dynamiska förändringen av LD utförs huvudsakligen genom fluorescensfärgning. Nilrött och BODIPY är båda vanliga fluorescerande lipidfärgämnen10,11. Jämfört med Nilrött har BODIPY starkare vävnadspermeabilitet och binder bättre med LDs12. BODIPY-märkta LDs kan användas för färgning av levande celler och samlokalisering med andra organeller13.
Incidensen av fettlever är signifikant högre hos idisslare än hos enkelmagade djur14. Under övergångsperioden upplever mjölkkor ett tillstånd av negativ energibalans3. Stora mängder icke-förestrade fettsyror (palmitinsyra, oljesyra, linolsyra etc.) syntetiseras till TG i bovina hepatocyter, vilket leder till leverfunktionell abnormitet och kraftigt minskar kvaliteten på mjölkprodukter och produktionseffektivitet15. Den aktuella studien syftar till att tillhandahålla ett protokoll för att analysera storleken och antalet LD, samt att övervaka LD-fusionsdynamiken. Vi konstruerade en modell av LD-bildning genom att tillsätta olika koncentrationer av linolsyra (LA) i hepatocyter16 och observerade förändringarna i storleken och antalet LD under processen genom färgning av LD med oljeröd O. Dessutom observerades processen för snabb fusion av LD också genom färgning med BODIPY 493/503.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla procedurer godkändes och utfördes i enlighet med de etiska normerna för djurvårdskommittén vid Henan Agricultural University (Henan-provinsen, Kina).
1. Bovin hepatocytcellodling
- Tina de primära hepatocytcellerna17 och centrifugera 400 x g i 4 min vid rumstemperatur.
OBS: De primära hepatocytcellerna odlades och upprätthölls efter en tidigare publicerad rapport17. - Kassera den frysta förvaringslösningen med en pipett och suspendera den med 1 ml medium innehållande 10% fetalt bovint serum (FBS) och Dulbeccos modifierade Eagle's medium (DMEM). Använd sedan en cellräkningskammare för att beräkna antalet celler per milliliter och beräkna sedan koncentrationen av ovanstående cellsuspension och justera cellkoncentrationen till 1 x 107 celler / ml.
- Tillsätt cellsuspensionen i en 60 mm cellodlingsskål innehållande 3 ml av ovanstående medium. Odla cellerna och inkubera dem vid 37 °C och 5 %CO2 i 24 timmar.
- När cellerna växer till 80%, kassera mediet och skölj med fosfatbuffrad saltlösning (PBS), tillsätt sedan 750 μL 0,25% trypsin för att smälta cellerna. Inkubera cellerna vid 37 °C i 3 minuter och neutralisera dem sedan med samma mängd 10 % FBS. Samla upp cellsuspensionen för att centrifugera vid 200 x g i 4 min vid rumstemperatur.
2. Oljeröd O-färgning
- Tillsätt 800 μL odlingsmedium innehållande 10 % FBS och DMEM i varje brunn på cellodlingsplattan med 24 brunnar som innehåller glastäckglas. Ta 50 μL av cellsuspensionen (erhållen i steg 1.3) och tillsätt den till 950 μL PBS för att blanda. Använd en cellräkningskammare för att beräkna antalet celler per milliliter och beräkna sedan koncentrationen av ovanstående cellsuspension. Slutligen justera cellkoncentrationen till 4 x 104/ml i varje brunn och inkubera vid 37 °C och 5 %CO2 i 24 timmar.
- Efter 24 timmar, kassera odlingsmediet och tvätta med PBS. Suspendera med 800 μl DMEM-induktionsmedium innehållande 1 mg/ml bovint serumalbumin (BSA).
- Lös totalt 100 μl LA (se materialtabell) i 900 μL vattenfri etanol och bered en standardlösning (100 mmol/l). Tillsätt en gradient på 0 μmol / L, 100 μmol / L, 150 μmol / L och 200 μmol / L LA i 24-brunnsplattan. Upprepa varje behandling fyra gånger. Inkubera vid 37 °C och 5 %CO2 i 24 timmar.
- Ta bort odlingsmediet och tvätta cellerna med PBS tre gånger. Fixera med 400 μL 4% paraformaldehyd i 20 min. Kassera fixeringslösningen och tvätta den med PBS tre gånger.
- Inkubera cellerna med 60% isopropylalkohol i 5 minuter och kassera dem sedan. Tillsätt nyberedd oljeröd O-arbetslösning (se materialtabell) (3: 2-förhållandet oljerött O: vatten) i 20-30 minuter och kassera färgningslösningen. Tvätta cellerna med PBS två till fem gånger tills det inte finns något överskott av färglösning.
- Tillsätt 300 μL hematoxylinfärgningslösning (hematoxylin:vattenförhållande 1:10) och färga om kärnan i 1-2 minuter. Kassera färglösningen och tvätta cellerna med PBS två till fem gånger. Ta ut glastäcket från plattan med 24 brunnar och placera dem på mikroskopiska objektglas (sidan med cellerna nedåt) efter att ha tappat 10 μL tabletttätningsmedel (se Materialförteckning) på objektglaset.
- Efter tätning, observera och avbilda LD av cellerna under oljelinsen i det optiska mikroskopet (se materialförteckning). Mät LDs diameter med cellSens programvara och analysera antalet och storleken på LDs.
3. Mätning av LD:s storlek och antal
- Ta bilder: Slå på datorn och mikroskopomkopplaren successivt, placera bilden på laddningsplattformen, öppna bildanalysprogrammet (se materialförteckning) och anslut datorn för att visa bilden.
- Hitta bilderna med låg effekt och droppa en lämplig mängd cederolja på bildbilden. Justera observationsfaktorn till 100x, ställ in automatisk exponering och ta bilderna genom att justera lämpligt synfält. Välj tre färgade cellbilder för varje grupp för avbildning.
- Diametermätning: Välj slumpmässigt 60 LD för varje bild för att mäta diametrarna. Efter mätningen av varje bild, spara bilderna och mata ut mätresultaten i en tabell för efterföljande analys av genomsnittlig storlek och distributionsförhållande för LD.
- Kvantitetsmätning: Välj tre bilder för varje färgad och fotograferad bild och välj slumpmässigt tre celler för kvantitetsmätning i varje bild. Räkna och analysera antalet LD runt cellen och beräkna det genomsnittliga antalet LD i cellen.
4. Dynamisk observation av LD-fusion
- Följ cellodlingsstegen som nämns i steg 1.1-1.3. När cellerna växer till 80%, kassera mediet och skölj med PBS, smälta dem sedan med 750 μL trypsin i 3 minuter. Tillsätt sedan 750 μL av mediet, centrifugera vid 200 x g i 4 minuter vid rumstemperatur och kassera supernatanten.
- Suspendera cellerna i 1 ml odlingsmedium, räkna och justera cellkoncentrationen till 5 x 105 celler/ml i en 35 mm skål. Kultur vid 37 °C och 5%CO2 i 24 timmar.
- När cellerna har vuxit till 80%, byt mediet till DMEM + 150 μmol / L LA i 24 timmar och fortsätt kulturen i en inkubator vid 37 ° C och 5% CO2 för att ackumulera LD: erna.
- Ta bort odlingsmediet efter 24 timmar. Tvätta de vidhäftande cellerna med PBS och inkubera dem med 10 μg/ml BODIPY 493/503 neutralfluorescerande sond (se materialtabell) i mörker i 30 minuter. Efter inkubation, tvätta cellerna i odlingsskålen med PBS tre gånger och tillsätt DMEM + 150 μmol / L LA.
Observera: Undvik ljusexponering under och efter 10 μg/ml BODIPY-färgning. 1 mg/ml BODIPY späddes med PBS (1:100). - Placera odlingsskålen i spåret i mikroskopet på den levande cellstationen (se materialförteckning) för att observera de dynamiska förändringarna av LD. Slå på strömmen till arbetsstationen för levande celler enligt startsekvensen och undvik ljus.
- Slå på strömmen, överföringsljuskällan, mikroskopströmkällan, kvicksilverlampans fluorescerande ljuskälla, laddningskopplad enhet (CCD) kamerakälla, datorns värdströmkälla, CO 2-ventil och CO2-inkubator.
- Tillsätt destillerat vatten i spåret på lastplattformen, se till att inte gå över luftventilen.
- Slå på datorn och kör "NIS-Elements". Hitta först rätt synfält på 4x objektivlinsen och justera den sedan successivt till 40x objektivlinsen. Välj E100 för att observera provet i mikroskopet och L100 för att förhandsgranska och fotografera provet på datorn.
E100 och L100 är justeringsknappar för mikroskop på arbetsstationen för levande celler (se Materialförteckning), som representerar okularet respektive datorskärmen. - Designa parametrar som fluorescenskanal (t.ex. Ph-40x, fluoresceinisotiocyanat [FITC], slutare) och förväntad fotograferingstid för experimentet. Ställ in fotograferingstiden i tid, inklusive fotograferingsintervalltiden på 5 min mellan varannan bild och en total fotograferingstid på 6 timmar.
OBS: Långvarig fotografering måste använda fokusstabiliseringsfunktionen för perfekt fokussystem (PFS). För detta, justera först synfältet och fokuslängden, klicka sedan på PFS på datorskärmen och justera slutligen finfokusspiralen. - Välj olika kanallägen, en kanal eller alla, välj ett annat synfält, klicka på förhandsgranska, justera synfältet, ställ in dessa parametrar och klicka på börja springa för att börja fotografera . Ta ett testskott i 5 minuter först; Det kan ta lång tid efter att operationen är normal.
- När fotograferingen har utförts väljer du Arkiv > Spara som > Spara typ > avi-format för att exportera data till en video i "avi" -format. Använd bildformatet '.nd2' för att spara dataprogrammet och exportera fotona.
- För att stänga av maskinen, stäng av den i omvänd ordning.
5. Statistik och resultatanalys
- Analysera data med envägs ANOVA. Rapportera resultaten som medelvärde ± standardfel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Färgningen av cell LD visas i figur 1. De röda prickarna reflekterar cell LD och de blå prickarna återspeglar kärnorna. Det kan ses att storleken och antalet LD i varje bild är olika under behandlingen av LA.
Med ökningen av LA-doseringen visade den genomsnittliga diametern och antalet LD en signifikant ökande trend, beroende på LA-koncentrationen (figur 2). Som visas i figur 2A var antalet LD per cell negativt korrelerat med olika koncentrationer av LA. Medianvärdet för LD per cell var 136 för gruppen som behandlades med 100 μmol/l LA, vilket minskade till 118 och 105 för grupperna som behandlades med 150 μmol/l respektive 200 μmol/l LA. Den genomsnittliga diametern för LD i kontrollgruppen var 0,72 μm, 1,38 μm för 100 μmol / L LA-behandlad grupp, 1,51 μm för 150 μmol / L LA-behandlad grupp och 1,64 μm för 200 μmol / L LA-behandlad grupp (figur 2B).
I denna studie definierades LD med en diameter <1 μm som små och LD med en diameter >4 μm definierades som stora. Det konstaterades att fördelningsproportionerna för LD också förändrades med LA-koncentrationen, såsom visas i figur 3. andelen små LD minskade och andelen stora LD ökade. Andelen LD med liten diameter var 43,33% vid 100 μmol / L LA, 36,43% vid 150 μmol / L LA och 29,8% vid 200 μmol / L LA. För LD med stor diameter var den högsta andelen 6,11% i 200 μmol / L LA, sedan 3,15% och 1,48% i 150 respektive 100 μmol / L LA. I 200 μmol / L LA-gruppen observerades uppenbarligen superstora LD (diameter >5 μm) och stod för cirka 6,30%, högre än 100 μmol / L LA (5,93%) och 150 μmol / L LA (4,82%) grupper. Resultaten indikerade att en hög koncentration av LA ökade storleken på LD och minskade antalet LD. Under tiden ökade andelen stora LD och andelen små LD minskade.
Stora LD bildades i allmänhet genom fusion av små LD. LD-fusion genom levande cellavbildning observerades för att bevisa detta (figur 4). Cellerna behandlades med 150 μmol/L LA i 24 timmar och färgades med BODIPY. Under normala cellodlingsförhållanden vid 37 °C och 5 %CO2 observerades cellerna kontinuerligt under 6 timmar med en arbetsstation med levande celler. Bilderna togs var 5:e minut. Som framgår av figur 4 fanns det under de första 15 minuterna fortfarande uppenbara mindre LD. Sedan började LD: erna långsamt smälta från 20 minuter och smältes helt samman till större LD med 35 minuter.
Figur 1: Lipiddroppar. Hepatocytceller odlade i olika koncentrationer av LA och färgade med oljerött O. De röda prickarna reflekterade LD färgade med oljerött och de blålila prickarna reflekterade kärnan med hematoxylin. Tre glasskivor valdes ut för färgning och avbildning i varje behandling. Skalstapel = 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: TLD:s antal och storlek. Hepatocytceller odlade i en koncentrationsgradient från 0 till 200 μmol/L LA och färgade med oljerött O. (A) Genomsnittligt antal LD per cell. Antalet LD i 27 celler räknades i varje grupp. (B) Den genomsnittliga diametern av LD i en cell. Storleken på 60 LD räknades i varje grupp. *p < 0,05; **p < 0,01; p < 0,001; p < 0,0001. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: LD-andel. Hepatocytceller odlade i olika koncentrationer av LA och färgade med oljeröd O. Proportionsförhållandet mellan LD av olika storlekar beräknades. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: LD-fusion. Hepatocytceller odlades med 150 μmol/L LA och inkuberades med BODIPY 493/503-sonden. Efter kontinuerlig observation i 6 timmar under en 40x förstoringsbild fotograferades LD: erna under fluorescensen och ljusa fält. Bilderna togs var 5:e minut. Fusion markerades med röda rutor. Skalstapel = 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Beroende på de patologiska tillstånden genomgår hepatiska LD enorma förändringar i deras storlek och antal. LD är allmänt närvarande i hepatocytceller och spelar en nyckelroll i leverhälsa och sjukdom18. Mängden och storleken på LDs är grunden för den aktuella forskningen om biogenes av LDs19. Storleken och antalet LD för celler och vävnader återspeglar deras förmåga att lagra och frigöra energi. De dynamiska förändringarna av LD upprätthåller stabiliteten hos lipidmetaboliska aktiviteter20,21. En onormal ackumulering av LD förekommer vid olika patologiska tillstånd och kan vara en indikator på metabolisk sjukdom22,23. Detta protokoll ger en exakt metod för att mäta storleken och kvantiteten av LD i en fettsyrainducerad hepatocytcellmodell och observera fusionen av LD mer effektivt och intuitivt.
Att studera LDs storlek och dynamiska förändringar är av stor betydelse för att förstå förekomsten av sjukdomar relaterade till lipidmetabolismstörningar och effektiv intervention. I detta experiment var de viktigaste stegen mätning och analys av storleken och mängden LD. Först användes olika koncentrationer av LA för att inducera LD-ackumulering i hepatocyter. Andra fettsyror, såsom oleat och palmitat, kan också användas för att orsaka LD-ackumulering i hepatocytceller24,25. Efter behandling med olika koncentrationer av LA fann man att storleken på LD ökade på ett dosberoende sätt. Dessa resultat indikerade att den oljeröda O-färgningen noggrant mätte LD: s diameter. Det visade sig också att en hög koncentration av LA kunde öka andelen stora LD, vilket tyder på att små LD smälte samman med varandra snabbt. Snabb fusion är en av de dynamiska förändringarna i LD; LD-snabb fusion kan inträffa inom några minuter eller till och med tiotals sekunder, och den medieras huvudsakligen av dess ytfosfolipider och protein22,26. I den aktuella studien observerades LD-fusion tydligt från 20 min till 35 min med BODIPY 493/503-märkning av en levande cellarbetsstation. Fotograferingsintervallet mellan bilder kan ställas in på några sekunder till minuter, och den totala fotograferingstiden kan ställas in från 1 timme till flera dagar, vilket ger bekvämlighet för att observera de dynamiska förändringarna av LD i olika celler.
När det gäller färgningsanalysen av LD: s storlek är oljeröd O-färgning bekvämare och billigare än fluorescerande färgning och används mer allmänt för att mäta den uppenbara storleken på LDs9. Det behöver inte behandlas mot ljus. Dessutom är utrustningskraven inte svåra att uppnå, och oljelinsen i ett vanligt optiskt mikroskop kan användas för fotoobservation. Med hjälp av denna metod kan forskarna välja flera grupper av bilder för att slumpmässigt mäta storleken och mängden LD; Det är enkelt och bekvämt att använda och kan öka provstorleken och minska felet. Enligt den uppmätta och analyserade LD-storleken kan dessutom fördelningsförhållandet för olika LD-storlekar observeras direkt. Statistisk analys kan utföras med ovanstående metod efter oljeröd O-färgning, och denna metod kan också tillämpas på andra celler, inklusive ett brett spektrum av celler som påverkas av lipidackumulering. I det tidiga färgningsstadiet fann man att oljeröd O inte var lätt att rengöra efter färgning, och det fanns betydande färgmagasinrester. I det senare skedet filtrerades färgämnet och lämplig färgningstid valdes genom kontinuerliga tester. Efter färgning kan man undvika ovanstående problem genom att öka rengöringstiderna.
BODIPY 493/503 fluorescerande färgämne är en av de vanligaste proberna för LD-visualisering27. I denna studie utfördes LD-fusion genom att märka LD grönt med BODIPY och observera processen med en levande cellarbetsstation. Nilrött är också ett vanligt fluorescerande färgämne för neutrala lipider, men dess breda excitationsband (450-560 nm), icke-specifik färgning, dålig vävnadspermeabilitet och andra brister kan påverka resultaten av LD-färgning till viss del. Jämfört med Nilens röda fluorescensfärgning var excitationsbandet för BODIPY 493/503 smalare (460-490 nm), och det kunde märkas med olika fluorescerande färgämnen11. För det andra undviker BODIPY effektivt störningar av växtpigment28. Slutligen har BODIPY stark vävnadspermeabilitet, låg känslighet för miljöpolaritet och är inte lätt att släcka12; därför används den ofta vid fluorescensfärgning av LD. Analysen av LD-fusion har dock vissa begränsningar. För att få en kontinuerlig observationsbild av levande celler kan linsen inte flyttas, så endast en lokal LD-fusion kan observeras i visionen, och LD-fusionseffektiviteten hos hela cellen kan inte analyseras mer exakt.
Sammanfattningsvis ger denna studie en enkel och reproducerbar metod för LD-morfologi och storleksanalys, som kan tillämpas i stor utsträckning på LD-analys vid studier av cellulär lipidmetabolism. Detta arbete bevisade också processen för LD-fusion och lade grunden för vidare studier av LD i framtiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några intressekonflikter.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes gemensamt av National Natural Science Foundation of China (U1904116).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin | Gibco | 25200072 | reagent |
| 4% paraformaldehyde | Solarbio | P1110 | reagent |
| BODIPY 493/503 | invitrogen | 2295015 | reagent |
| Cedar oil | Solarbio | C7140 | reagent |
| cell counting chamber | equipment | ||
| cell culture dish | Corning | 353002 | material |
| cell sens software | Olympus IX73 | software | |
| Centrifuge | Eppendorf | equipment | |
| DMEM | HyClone | SH30022.01 | reagent |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 2492319 | reagent |
| hematoxylin | DingGuo | AR0712 | reagent |
| Image view | image analysis sodtware | ||
| linoleic acid | Solarbio | SL8520 | reagent |
| Live Cell Station | Nikon A1 HD25 | equipment | |
| NIS-Elements | Nikon | software | |
| oil red O | Solarbio | G1260 | reagent |
| optical microscope | Olympus IX73 | equipment | |
| Penicillin & Streptomycin 100× | NCM Biotech | CLOOC5 | reagent |
| Phosphate Buffered Saline | HyClone | SH30258.01 | reagent |
| Pipette | Eppendorf | equipment | |
| Sealing agent | Solarbio | S2150 | reagent |
References
- Fujimoto, T., Parton, R. G. Not just fat: the structure and function of the lipid droplet. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (3), 004838 (2011).
- Grasselli, E., et al. Models of non-alcoholic fatty liver disease and potential translational value: The effects of 3,5-L-diiodothyronine. Annals of Hepatology. 16 (5), 707-719 (2017).
- Herdt, T. H. Ruminant adaptation to negative energy balance: Influences on the etiology of ketosis and fatty liver. Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice. 16 (2), 215-230 (2000).
- Pino-de la Fuente, F., et al. Exercise regulation of hepatic lipid droplet metabolism. Life Sciences. 298, 120522 (2022).
- O'Connor, D., Byrne, A., Berselli, G. B., Long, C., Keyes, T. E. Mega-stokes pyrene ceramide conjugates for STED imaging of lipid droplets in live cells. Analyst. 144 (5), 1608-1621 (2019).
- Gao, G., et al. Control of lipid droplet fusion and growth by CIDE family proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA). Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (10), 1197-1204 (2017).
- Tütüncü Konyar, S. Dynamic changes in insoluble polysaccharides and neutral lipids in the developing anthers of an endangered plant species, Pancratium maritimum. Plant Systematics and Evolution. 304, 397-414 (2018).
- Spangenburg, E. E., Pratt, S. J. P., Wohlers, L. M., Lovering, R. M. Use of BODIPY (493/503) to visualize intramuscular lipid droplets in skeletal muscle. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 598358 (2011).
- Mehlem, A., Hagberg, C. E., Muhl, L., Eriksson, U., Falkevall, A. Imaging of neutral lipids by oil red O for analyzing the metabolic status in health and disease. Nature Protocols. 8 (6), 1149-1154 (2013).
- Diaz, G., Melis, M., Batetta, B., Angius, F., Falchi, A. M. Hydrophobic characterization of intracellular lipids in situ by Nile Red red/yellow emission ratio. Micron. 39 (7), 819-824 (2008).
- Duan, X., et al. The synthesis of polarity-sensitive fluorescent dyes based on the BODIPY chromophore. Dyes and Pigments. 89 (3), 217-222 (2011).
- Rumin, J., et al. The use of fluorescent Nile red and BODIPY for lipid measurement in microalgae. Biotechnology for Biofuels. 8, 42 (2015).
- Fam, T. K., Klymchenko, A. S., Collot, M. Recent advances in fluorescent probes for lipid droplets. Materials. 11 (9), 1768 (2018).
- Raboisson, D., Mounié, M., Maigné, É Diseases, reproductive performance, and changes in milk production associated with subclinical ketosis in dairy cows: A meta-analysis and review. Journal of Dairy Science. 97 (12), 7547-7563 (2014).
- Ospina, P. A., Nydam, D. V., Stokol, T., Overton, T. R. Associations of elevated nonesterified fatty acids and β-hydroxybutyrate concentrations with early lactation reproductive performance and milk production in transition dairy cattle in the northeastern United States. Journal of Dairy Science. 93 (4), 1596-1603 (2010).
- Campos-Espinosa, A., Guzmán, C. A model of experimental steatosis in vitro: hepatocyte cell culture in lipid overload-conditioned medium. Journal of Visualized Experiments. (171), e62543 (2021).
- Liu, L., et al. Effects of nonesterified fatty acids on the synthesis and assembly of very low density lipoprotein in bovine hepatocytes in vitro. Journal of Dairy Science. 97 (3), 1328-1335 (2014).
- Wang, L., Liu, J. Y., Miao, Z. J., Pan, Q. W., Cao, W. L. Lipid droplets and their interactions with other organelles in liver diseases. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 133, 105937 (2021).
- Sanjabi, B., et al. Lipid droplets hypertrophy: a crucial determining factor in insulin regulation by adipocytes. Scientific Reports. 5, 8816 (2015).
- Saponaro, C., Gaggini, M., Carli, F., Gastaldelli, A. The subtle balance between lipolysis and lipogenesis: a critical point in metabolic homeostasis. Nutrients. 7 (11), 9453-9474 (2015).
- Yang, A., Mottillo, E. P. Adipocyte lipolysis: from molecular mechanisms of regulation to disease and therapeutics. Biochemical Journal. 477 (5), 985-1008 (2020).
- Gluchowski, N. L., Becuwe, M., Walther, T. C., Farese, R. V. Lipid droplets and liver disease: from basic biology to clinical implications. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 14 (6), 343-355 (2017).
- Meex, R. C. R., Schrauwen, P., Hesselink, M. K. C. Modulation of myocellular fat stores: lipid droplet dynamics in health and disease. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 297 (4), 913-924 (2009).
- Sarnyai, F., et al. Effect of cis-and trans-monounsaturated fatty acids on palmitate toxicity and on palmitate-induced accumulation of ceramides and diglycerides. International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), 2626 (2020).
- Ricchi, M., et al. Differential effect of oleic and palmitic acid on lipid accumulation and apoptosis in cultured hepatocytes. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 24 (5), 830-840 (2009).
- Fei, W., et al. A role for phosphatidic acid in the formation of "supersized" lipid droplets. PLoS Genetics. 7 (7), e1002201 (2011).
- Kowada, T., Maeda, H., Kikuchi, K. BODIPY-based probes for the fluorescence imaging of biomolecules in living cells. Chemical Society Reviews. 44 (14), 4953-4972 (2015).
- Wang, J., et al. Application of the fluorescent dye BODIPY in the study of lipid dynamics of the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. Molecules. 23 (7), 1594 (2018).
