Summary
يصف هذا البروتوكول كيفية استخدام الزيت الأحمر O لصبغ قطرات الدهون (LDs) ، وحساب حجم وعدد LDs في نموذج خلايا الكبد الدهنية التي يسببها الأحماض الدهنية ، واستخدام BODIPY 493/503 لمراقبة عملية اندماج LDs الصغيرة في LDs الكبيرة عن طريق تصوير الخلايا الحية.
Abstract
قطرات الدهون (LDs) هي عضيات تلعب دورا مهما في استقلاب الدهون وتخزين الدهون المحايد في الخلايا. ترتبط بمجموعة متنوعة من الأمراض الأيضية ، مثل السمنة وأمراض الكبد الدهنية والسكري. في الخلايا الكبدية ، تعد أحجام وأعداد LDs علامات على مرض الكبد الدهني. علاوة على ذلك ، غالبا ما يكون تفاعل الإجهاد التأكسدي ، والالتهام الذاتي للخلايا ، وموت الخلايا المبرمج مصحوبا بتغيرات في أحجام وأعداد LDs. نتيجة لذلك ، فإن أبعاد وكمية LDs هي أساس البحث الحالي فيما يتعلق بآلية التكوين الحيوي LD. هنا ، في الخلايا الكبدية البقرية التي تسببها الأحماض الدهنية ، نصف كيفية استخدام الزيت الأحمر O لتلطيخ LDs والتحقيق في أحجام وأعداد LDs. يتم تحليل توزيع حجم LDs إحصائيا. تتم ملاحظة عملية اندماج LDs الصغيرة في LDs الكبيرة أيضا بواسطة نظام تصوير الخلايا الحية. يوفر العمل الحالي طريقة لمراقبة اتجاه تغيير حجم LDs بشكل مباشر في ظل ظروف فسيولوجية مختلفة.
Introduction
تراكم قطرات الدهون (LD) في خلايا الكبد هو السمة النموذجية لمرض الكبد الدهني غير الكحولي (NAFLD) ، والذي يمكن أن يتطور إلى تليف الكبد وسرطان الخلايا الكبدية. وقد وجد أن أول مظهر من مظاهر مرض الكبد الدهني هو تنكس دهني ، يتميز بتراكم LD في السيتوبلازم في خلايا الكبد1. يرتبط تنكس دهني الكبد دائما بزيادة عدد و / أو توسيع حجم LDs2. يعتقد أن LDs تتولد من الشبكة الإندوبلازمية (ER) ، التي تتكون من الدهون الثلاثية (TG) كنواة ، وتحيط بها البروتينات والدهون الفوسفاتية3. باعتبارها العضية تحت الخلوية المسؤولة عن تخزين TG ، تظهر LDs ميزات مختلفة فيما يتعلق بحجمها وعددها وتكوين الدهون والبروتينات والتفاعل مع العضيات الأخرى ، وكلها تؤثر على توازن طاقة الخلية4. يرتبط مستوى TG بشكل إيجابي بحجم LDs ، ويمكن أن يشكل محتوى TG الأعلى داخل الخلايا LDsأكبر 5. يزداد حجم LDs من خلال التوليف المحلي ل TG ، ودمج الدهون في ER ، واندماج LDs متعددة6. الخلايا (الخلايا الشحمية ، خلايا الكبد ، إلخ) التي تحتوي على LDs كبيرة لديها آلية خاصة لزيادة تخزين الدهون بكفاءة عن طريق اندماج LD. تعكس التغييرات الديناميكية ل LDs حالات استقلاب الطاقة المختلفة للخلية. من الأهمية بمكان تطوير منهجيات تسمح بمراقبة وتحليل مختلف LDs الكبدية في الخلايا السليمة وغير الطبيعية.
الأصباغ الرئيسية غير الفلورية ل LDs هي السودان الأسود B والزيت الأحمر O. السودان الأسود B البقع الدهون المحايدة ، الدهون الفوسفاتية ، والمنشطات7. يستخدم الزيت الأحمر O بشكل أساسي لتلطيخ LDs للعضلات الهيكلية ، وخلايا عضلة القلب ، وأنسجة الكبد ، والخلايا الدهنية ، وما إلى ذلك8 ، ويعتبر أداة قياسية للكشف الكمي عن تنكس دهني الكبد في الفئران والبشر9. يتم التغيير الديناميكي ل LDs بشكل أساسي عن طريق الصباغة الفلورية. النيل الأحمر و BODIPY كلاهما شائع الاستخدام أصباغ الدهون الفلورية10,11. بالمقارنة مع أحمر النيل ، فإن BODIPY لديه نفاذية أنسجة أقوى ويرتبط بشكل أفضل مع LDs12. يمكن استخدام LDs المسمى BODIPY لتلطيخ الخلايا الحية والتمركز المشترك مع العضيات الأخرى13.
معدل الإصابة بمرض الكبد الدهني أعلى بكثير في الحيوانات المجترة منه في الحيوانات أحادية المعدة14. خلال الفترة الانتقالية ، تعاني أبقار الألبان من حالة من توازن الطاقة السلبي3. يتم تصنيع كميات كبيرة من الأحماض الدهنية غير الأسترية (حمض البالمتيك ، حمض الأوليك ، حمض اللينوليك ، إلخ) في TGs في خلايا الكبد البقري ، مما يؤدي إلى خلل وظيفي في الكبد ويقلل بشكل كبير من جودة منتجات الألبان وكفاءة الإنتاج15. تهدف الدراسة الحالية إلى توفير بروتوكول لتحليل حجم وعدد LDs ، وكذلك لمراقبة ديناميكيات اندماج LD. قمنا ببناء نموذج لتشكيل LD عن طريق إضافة تركيزات مختلفة من حمض اللينوليك (LA) في خلايا الكبد16 ولاحظنا التغيرات في حجم وعدد LDs أثناء العملية عن طريق تلطيخ LDs بالزيت الأحمر O. بالإضافة إلى ذلك ، لوحظت أيضا عملية الانصهار السريع ل LDs عن طريق تلطيخ BODIPY 493/503.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع الإجراءات وتنفيذها وفقا للمعايير الأخلاقية للجنة رعاية الحيوان بجامعة خنان الزراعية (مقاطعة خنان ، الصين).
1. زراعة خلايا الكبد البقري
- قم بإذابة خلايا الكبد الأولية17 وأجهزة الطرد المركزي 400 × جم لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: تم استزراع خلايا الكبد الأولية والحفاظ عليها بعد تقرير نشر سابقا17. - تخلص من محلول التخزين المجمد باستخدام ماصة وعلقه ب 1 مل من الوسط الذي يحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) ووسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM). بعد ذلك ، استخدم غرفة عد الخلايا لحساب عدد الخلايا لكل مليلتر ، ثم احسب تركيز تعليق الخلية أعلاه واضبط تركيز الخلية على 1 × 107 خلايا / مل.
- أضف معلق الخلية إلى طبق زراعة خلية 60 مم يحتوي على 3 مل من الوسط أعلاه. استزراع الخلايا واحتضانها عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة.
- عندما تنمو الخلايا إلى 80٪ ، تخلص من الوسط واشطفه بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، ثم أضف 750 ميكرولتر من 0.25٪ تربسين لهضم الخلايا. احتضان الخلايا على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ، ثم تحييدها بنفس الكمية من 10٪ FBS. جمع تعليق الخلية إلى أجهزة الطرد المركزي في 200 × غرام لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
2. النفط الأحمر يا تلطيخ
- أضف 800 ميكرولتر من وسط الاستزراع الذي يحتوي على 10٪ FBS و DMEM في كل بئر من صفيحة زراعة الخلايا المكونة من 24 بئرا والتي تحتوي على أغطية زجاجية. خذ 50 ميكرولتر من تعليق الخلية (تم الحصول عليها في الخطوة 1.3) وأضفها إلى 950 ميكرولتر من PBS للخلط. استخدم غرفة عد الخلايا لحساب عدد الخلايا لكل ملليلتر ، ثم احسب تركيز تعليق الخلية أعلاه. أخيرا ، اضبط تركيز الخلية على 4 × 104 / مل في كل بئر واحتضانها عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة.
- بعد 24 ساعة ، تخلص من وسط الثقافة واغسله باستخدام برنامج تلفزيوني. يعلق ب 800 ميكرولتر من وسط تحريض DMEM يحتوي على 1 ملغ / مل من ألبومين مصل الأبقار (BSA).
- قم بإذابة ما مجموعه 100 ميكرولتر من LA (انظر جدول المواد) في 900 ميكرولتر من الإيثانول اللامائي وإعداد محلول قياسي (100 مليمول / لتر). أضف تدرجا قدره 0 ميكرومول / لتر ، 100 ميكرومول / لتر ، 150 ميكرومول / لتر ، و 200 ميكرومول / لتر LA في لوحة 24 بئر. كرر كل علاج أربع مرات. احتضان في 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO2 لمدة 24 ساعة.
- إزالة وسط الثقافة وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات. ثبت مع 400 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 20 دقيقة. تخلص من المحلول المثبت واغسله باستخدام برنامج تلفزيوني ثلاث مرات.
- احتضان الخلايا مع 60 ٪ من الكحول الأيزوبروبيل لمدة 5 دقائق ، ثم تخلص منه. أضف محلول عمل O الأحمر المحضر حديثا (انظر جدول المواد) (نسبة 3: 2 من الزيت الأحمر O: الماء) لمدة 20-30 دقيقة وتخلص من محلول التلطيخ. اغسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني مرتين إلى خمس مرات حتى لا يكون هناك محلول صبغ زائد.
- أضف 300 ميكرولتر من محلول تلطيخ الهيماتوكسيلين (الهيماتوكسيلين: نسبة الماء 1:10) وأعد صبغ النواة لمدة 1-2 دقيقة. تخلص من محلول الصبغة واغسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني مرتين إلى خمس مرات. أخرج أغطية الزجاج من اللوحة المكونة من 24 بئرا وضعها على شرائح مجهرية (الجانب مع توجيه الخلايا لأسفل) بعد إسقاط 10 ميكرولتر من مانع تسرب الأقراص (انظر جدول المواد) على الشريحة.
- بعد الختم ، لاحظ وصور LDs للخلايا تحت عدسة الزيت للمجهر الضوئي (انظر جدول المواد). قم بقياس قطر LDs بواسطة برنامج cellSens وتحليل عدد وحجم LDS.
3. قياس حجم وعدد LDs
- التقاط الصور: قم بتشغيل مفتاح الكمبيوتر والمجهر على التوالي ، وضع الشريحة على منصة التحميل ، وافتح برنامج تحليل الصور (انظر جدول المواد) ، وقم بتوصيل الكمبيوتر لعرض الصورة.
- ابحث عن الصور بطاقة منخفضة وقم بتقطير كمية مناسبة من زيت الأرز على شريحة التصوير. اضبط عامل المراقبة على 100x ، واضبط التعرض التلقائي ، والتقط الصور عن طريق ضبط مجال الرؤية المناسب. حدد ثلاث شرائح خلية ملطخة لكل مجموعة للتصوير.
- قياس القطر: حدد عشوائيا 60 LDs لكل صورة لقياس الأقطار. بعد قياس كل صورة ، احفظ الصور وأخرج نتائج القياس في جدول للتحليل اللاحق لمتوسط الحجم ونسبة التوزيع ل LDs.
- قياس الكمية: حدد ثلاث صور لكل شريحة ملطخة ومصورة ، وحدد عشوائيا ثلاث خلايا لقياس الكمية في كل صورة. عد وحلل عدد LDs حول الخلية ، واحسب متوسط عدد LDs في الخلية.
4. الملاحظة الديناميكية لانصهار LD
- اتبع خطوات زراعة الخلايا كما هو مذكور في الخطوات 1.1-1.3. عندما تنمو الخلايا إلى 80٪ ، تخلص من الوسط واشطفه باستخدام برنامج تلفزيوني ، ثم هضمها ب 750 ميكرولتر من التربسين لمدة 3 دقائق. بعد ذلك ، أضف 750 ميكرولتر من الوسط ، جهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وتخلص من المادة الطافية.
- قم بتعليق الخلايا في 1 مل من وسط المزرعة ، وعد ، واضبط تركيز الخلية على 5 × 105 خلايا / مل في طبق 35 مم. الثقافة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة.
- عندما تنمو الخلايا إلى 80٪ ، قم بتغيير الوسط إلى DMEM + 150 μmol / L LA لمدة 24 ساعة ، واستمر في المزرعة في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لتجميع LDs.
- بعد 24 ساعة ، قم بإزالة وسط الثقافة. اغسل الخلايا الملتصقة ب PBS واحتضانها بمسبار فلورسنت محايد BODIPY 493/503 BODIPY 493/503 (انظر جدول المواد) في الظلام لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة ، اغسل الخلايا في طبق الاستزراع باستخدام برنامج تلفزيوني ثلاث مرات وأضف DMEM + 150 ميكرومول / لتر LA.
ملاحظة: تجنب التعرض للضوء أثناء وبعد تلطيخ BODIPY 10 ميكروغرام / مل ؛ تم تخفيف 1 ملغ / مل BODIPY مع برنامج تلفزيوني (1: 100). - ضع طبق الاستزراع في أخدود مجهر محطة الخلية الحية (انظر جدول المواد) لمراقبة التغيرات الديناميكية ل LDs. قم بتشغيل طاقة محطة عمل الخلية الحية وفقا لتسلسل البداية وتجنب الضوء.
- قم بتشغيل الطاقة ، ومصدر ضوء ناقل الحركة ، ومصدر طاقة المجهر ، ومصدر ضوء الفلورسنت لمصباح الزئبق ، ومصدر طاقة كاميرا الجهاز المقترن بالشحن (CCD) ، ومصدر طاقة مضيف الكمبيوتر ، وصمام CO 2 ، وحاضنة CO2.
- أضف الماء المقطر إلى الأخدود الموجود على منصة التحميل ، مع ضمان عدم تجاوز فتحة التهوية.
- قم بتشغيل الكمبيوتر وتشغيل "NIS-Elements". أولا ، ابحث عن مجال الرؤية المناسب على العدسة الموضوعية 4x ، ثم اضبطه على العدسة الموضوعية 40x على التوالي. حدد E100 لمراقبة العينة في المجهر و L100 لمعاينة العينة وتصويرها على الكمبيوتر.
ملاحظة: E100 و L100 عبارة عن أزرار ضبط مجهرية على محطة عمل الخلية الحية (انظر جدول المواد) ، تمثل العدسة وشاشة الكمبيوتر ، على التوالي. - صمم المعلمات مثل القناة الفلورية (على سبيل المثال ، Ph-40x ، Fluorescein isothiocyanate [FITC] ، الغالق) ووقت التصوير المتوقع للتجربة. اضبط وقت التصوير في الوقت المناسب ، بما في ذلك وقت الفاصل الزمني للتصوير البالغ 5 دقائق بين كل صورتين وإجمالي وقت التصوير 6 ساعات.
ملاحظة: يحتاج التصوير لفترة طويلة إلى استخدام وظيفة تثبيت التركيز البؤري لنظام التركيز البؤري المثالي (PFS). لهذا ، اضبط أولا مجال الرؤية وطول التركيز ، ثم انقر فوق PFS على شاشة الكمبيوتر ، وأخيرا اضبط دوامة التركيز الدقيق. - حدد أوضاع قناة مختلفة ، قناة واحدة أو كلها ، حدد حقل عرض مختلفا ، انقر فوق معاينة ، اضبط مجال العرض ، اضبط هذه المعلمات ، وانقر فوق بدء التشغيل لبدء التصوير . خذ لقطة تجريبية لمدة 5 دقائق أولا ؛ قد يستغرق الأمر وقتا طويلا بعد أن تكون العملية طبيعية.
- بعد تنفيذ التصوير ، اختر ملف > حفظ باسم > حفظ اكتب > تنسيق avi لتصدير البيانات إلى فيديو بتنسيق "avi". استخدم تنسيق الصورة ".nd2" لحفظ برنامج البيانات وتصدير الصور.
- لإيقاف تشغيل الجهاز ، قم بإيقاف تشغيله بترتيب عكسي.
5. الإحصاءات وتحليل النتائج
- تحليل البيانات باستخدام ANOVA. أبلغ عن النتائج كمتوسط ± خطأ قياسي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يوضح الشكل 1 تلطيخ LDs الخلية. تعكس النقاط الحمراء LDs الخلوية ، وتعكس النقاط الزرقاء النوى. يمكن ملاحظة أن حجم وعدد LDs في كل صورة مختلفان تحت معاملة LA.
مع الزيادة في جرعة LA ، أظهر متوسط قطر وعدد LDs اتجاها متزايدا بشكل ملحوظ ، اعتمادا على تركيز LA (الشكل 2). كما هو موضح في الشكل 2 أ ، كان عدد LDs لكل خلية مرتبطا سلبا بتركيزات مختلفة من LA. كان متوسط عدد LD لكل خلية 136 للمجموعة المعالجة 100 μmol / L LA ، وانخفض إلى 118 و 105 للمجموعات المعالجة 150 μmol / L و 200 μmol / L LA ، على التوالي. كان متوسط قطر LDs في المجموعة الضابطة 0.72 ميكرومتر ، و 1.38 ميكرومتر للمجموعة المعالجة 100 μmol / L LA ، و 1.51 ميكرومتر للمجموعة المعالجة 150 μmol / L LA ، و 1.64 ميكرومتر للمجموعة المعالجة 200 μmol / L LA (الشكل 2B).
في هذه الدراسة ، تم تعريف LDs التي يبلغ قطرها <1 ميكرومتر على أنها صغيرة ، وتم تعريف LDs التي يبلغ قطرها >4 ميكرومتر على أنها كبيرة. وقد وجد أن نسب توزيع LDs تغيرت أيضا مع تركيز LA ، كما هو موضح في الشكل 3 ؛ انخفضت نسبة LDs الصغيرة ، وزادت نسبة LDs الكبيرة. كانت نسبة LDs ذات القطر الصغير 43.33٪ عند 100 ميكرومول / لتر LA ، و 36.43٪ عند 150 μmol / L LA ، و 29.8٪ عند 200 μmol / L LA. بالنسبة ل LDs ذات القطر الكبير ، كانت أعلى نسبة 6.11٪ في 200 μmol / L LA ، ثم 3.15٪ و 1.48٪ في 150 و 100 μmol / L LA ، على التوالي. في مجموعة 200 μmol / L LA ، لوحظت LDs كبيرة جدا (قطرها >5 ميكرومتر) بشكل واضح ، وهو ما يمثل حوالي 6.30٪ ، أعلى من مجموعات 100 μmol / L LA (5.93٪) و 150 μmol / L LA (4.82٪). أشارت النتائج إلى أن التركيز العالي ل LA زاد من حجم LDs وقلل من عدد LDs. وفي الوقت نفسه ، زادت نسبة LDs الكبيرة ، وانخفضت نسبة LDs الصغيرة.
تم تشكيل LDs الكبيرة بشكل عام من خلال اندماج LDs الصغيرة. لوحظ اندماج LD من خلال تصوير الخلايا الحية لإثبات ذلك (الشكل 4). عولجت الخلايا ب 150 ميكرومول / لتر LA لمدة 24 ساعة وصبغت ب BODIPY. في ظل ظروف نمو الخلايا الطبيعية عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 ، تمت ملاحظة الخلايا بشكل مستمر لمدة 6 ساعات مع محطة عمل خلية حية. تم التقاط الصور كل 5 دقائق. كما هو موضح في الشكل 4 ، في أول 15 دقيقة ، لا يزال هناك LDs أصغر واضحة. بعد ذلك ، بدأت LDs في الاندماج ببطء من 20 دقيقة ، وتم دمجها بالكامل في LDs أكبر بمقدار 35 دقيقة.
الشكل 1: قطرات الليبيدات. خلايا خلايا الكبد المزروعة بتركيزات مختلفة من LA وملطخة بالزيت الأحمر O. عكست النقاط الحمراء LDs الملطخة باللون الأحمر الزيتي ، وعكست النقاط الزرقاء الأرجوانية النواة بالهيماتوكسيلين. تم اختيار ثلاث شرائح زجاجية للتلطيخ والتصوير في كل علاج. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: عدد وحجم LDs. خلايا الخلايا الكبدية المستزرعة في تدرج تركيز من 0 إلى 200 ميكرومول / لتر LA وملطخة بالزيت الأحمر O. (A) متوسط عدد LDs لكل خلية. تم حساب عدد LDs في 27 خلية في كل مجموعة. ب: متوسط قطر LDs في الخلية. تم حساب حجم 60 LDs في كل مجموعة. * ص < 0.05 ؛ ** ع < 0.01 ؛ ص < 0.001 ؛ ص < 0.0001. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: نسبة LD. خلايا خلايا الكبد المستزرعة بتركيزات مختلفة من LA وملطخة بالزيت الأحمر O. تم حساب نسبة LDs ذات الأحجام المختلفة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: اندماج LD. تم استزراع خلايا الكبد باستخدام 150 ميكرومول / لتر LA وتم حضنها باستخدام مسبار BODIPY 493/503. بعد المراقبة المستمرة لمدة 6 ساعات تحت صورة تكبير 40x ، تم تصوير LDs تحت الحقول الفلورية والساطعة. تم التقاط الصور كل 5 دقائق. تم وضع علامة الانصهار مع مربعات حمراء. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
اعتمادا على الحالات المرضية ، تخضع LDs الكبدية لتغييرات هائلة في حجمها وعددها. LDs موجودة على نطاق واسع في خلايا الكبد وتلعب دورا رئيسيا في صحة الكبد والأمراض18. كمية وحجم LDs هي أساس البحث الحالي حول التكوين الحيوي ل LDs19. يعكس حجم وعدد LDs للخلايا والأنسجة قدرتها على تخزين الطاقة وإطلاقها. تحافظ التغييرات الديناميكية ل LDs على استقرار أنشطة التمثيل الغذائي للدهون20,21. يحدث تراكم غير طبيعي ل LDs في حالات مرضية مختلفة ويمكن أن يكون مؤشرا على مرض التمثيل الغذائي22,23. يوفر هذا البروتوكول طريقة دقيقة لقياس حجم وكمية LDs في نموذج خلية الكبد الناجم عن الأحماض الدهنية ومراقبة اندماج LDs بشكل أكثر كفاءة وبديهية.
إن دراسة حجم والتغيرات الديناميكية في LDs له أهمية كبيرة لفهم حدوث الأمراض المتعلقة باضطرابات التمثيل الغذائي للدهون والتدخل الفعال. في هذه التجربة ، كانت الخطوات الرئيسية هي قياس وتحليل حجم وكمية LDs. أولا ، تم استخدام تركيزات مختلفة من LA للحث على تراكم LD في خلايا الكبد. يمكن أيضا استخدام الأحماض الدهنية الأخرى ، مثل الأوليت والبالميتات ، للتسبب في تراكم LD في خلايا خلايا الكبد24,25. بعد العلاج بتركيزات مختلفة من LA ، وجد أن حجم LDs قد زاد بطريقة تعتمد على الجرعة. أشارت هذه النتائج إلى أن تلطيخ الزيت الأحمر O يقيس بدقة قطر LDs. وقد وجد أيضا أن التركيز العالي ل LA يمكن أن يزيد من نسبة LDs كبيرة الحجم ، مما يشير إلى أن LDs الصغيرة تندمج مع بعضها البعض بسرعة. الانصهار السريع هو أحد التغييرات الديناميكية في LDs. قد يحدث الاندماج السريع LD في غضون بضع دقائق أو حتى عشرات الثواني ، ويتم التوسط فيه بشكل أساسي من خلال الدهون الفوسفاتية السطحية والبروتين22,26. في الدراسة الحالية ، لوحظ اندماج LD بوضوح من 20 دقيقة إلى 35 دقيقة باستخدام وسم BODIPY 493/503 بواسطة محطة عمل خلية حية. يمكن إعداد الفاصل الزمني للتصوير بين الصور في بضع ثوان إلى دقائق ، ويمكن ضبط إجمالي وقت التصوير من 1 ساعة إلى عدة أيام ، مما يوفر الراحة لمراقبة التغييرات الديناميكية ل LDs في خلايا مختلفة.
من حيث تحليل تلطيخ حجم LDs ، فإن تلطيخ الزيت الأحمر O أكثر ملاءمة وأرخص من تلطيخ الفلورسنت ، ويستخدم على نطاق واسع لقياس الحجم الظاهر ل LDs9. لا يحتاج إلى علاج ضد الضوء. علاوة على ذلك ، ليس من الصعب تحقيق متطلبات المعدات ، ويمكن استخدام عدسة الزيت للمجهر البصري العادي لمراقبة الصور. باستخدام هذه الطريقة ، يمكن للباحثين اختيار عدة مجموعات من الصور لقياس حجم وكمية LDs بشكل عشوائي. إنه بسيط ومريح للعمل ، ويمكن أن يزيد من حجم العينة ويقلل من الخطأ. علاوة على ذلك ، وفقا لحجم LD الذي تم قياسه وتحليله ، يمكن ملاحظة نسبة توزيع أحجام LD المختلفة مباشرة. يمكن إجراء التحليل الإحصائي بالطريقة المذكورة أعلاه بعد تلطيخ الزيت الأحمر O ، ويمكن أيضا تطبيق هذه الطريقة على الخلايا الأخرى ، بما في ذلك مجموعة واسعة من الخلايا المتأثرة بتراكم الدهون. في مرحلة الصباغة المبكرة ، وجد أن الزيت الأحمر O لم يكن من السهل تنظيفه بعد الصباغة ، وكانت هناك بقايا كبيرة من مجلة الصبغة. في المرحلة اللاحقة ، تم ترشيح الصبغة ، وتم اختيار وقت الصباغة المناسب من خلال الاختبارات المستمرة. بعد الصباغة ، يمكن أن تؤدي زيادة أوقات التنظيف إلى تجنب المشكلة المذكورة أعلاه.
صبغة الفلورسنت BODIPY 493/503 هي واحدة من أكثر المجسات شيوعا لتصور LD27. في هذه الدراسة ، تم إجراء اندماج LD عن طريق تسمية LD باللون الأخضر باستخدام BODIPY ومراقبة العملية باستخدام محطة عمل الخلية الحية. النيل الأحمر هو أيضا صبغة فلورية شائعة الاستخدام للدهون المحايدة ، ولكن نطاق الإثارة الواسع (450-560 نانومتر) ، والتلوين غير المحدد ، وضعف نفاذية الأنسجة ، وأوجه القصور الأخرى قد تؤثر على نتائج تلطيخ LD إلى حد ما. بالمقارنة مع تلطيخ مضان النيل الأحمر ، كان نطاق الإثارة ل BODIPY 493/503 أضيق (460-490 نانومتر) ، ويمكن تسميته بالاشتراك مع أصباغ الفلورسنت المختلفة11. ثانيا ، يتجنب BODIPY بشكل فعال تداخل أصباغ النبات28. أخيرا ، يتمتع BODIPY بنفاذية قوية للأنسجة ، وحساسية منخفضة للقطبية البيئية ، وليس من السهل إخماد12 ؛ لذلك ، يستخدم على نطاق واسع في تلطيخ مضان من LDs. ومع ذلك ، فإن تحليل اندماج LD له قيود معينة. من أجل الحصول على صورة مراقبة مستمرة للخلايا الحية ، لا يمكن تحريك العدسة ، لذلك يمكن ملاحظة اندماج LD المحلي فقط في الرؤية ، ولا يمكن تحليل كفاءة اندماج LD للخلية بأكملها بشكل أكثر دقة.
في الختام ، توفر هذه الدراسة طريقة بسيطة وقابلة للتكرار لمورفولوجيا LD وتحليل الحجم ، والتي يمكن تطبيقها على نطاق واسع على تحليل LD في دراسة استقلاب الدهون الخلوية. أثبت هذا العمل أيضا عملية اندماج LD ، ووضع الأساس لمزيد من الدراسة ل LDs في المستقبل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تم دعم هذا البحث بشكل مشترك من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (U1904116).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin | Gibco | 25200072 | reagent |
| 4% paraformaldehyde | Solarbio | P1110 | reagent |
| BODIPY 493/503 | invitrogen | 2295015 | reagent |
| Cedar oil | Solarbio | C7140 | reagent |
| cell counting chamber | equipment | ||
| cell culture dish | Corning | 353002 | material |
| cell sens software | Olympus IX73 | software | |
| Centrifuge | Eppendorf | equipment | |
| DMEM | HyClone | SH30022.01 | reagent |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 2492319 | reagent |
| hematoxylin | DingGuo | AR0712 | reagent |
| Image view | image analysis sodtware | ||
| linoleic acid | Solarbio | SL8520 | reagent |
| Live Cell Station | Nikon A1 HD25 | equipment | |
| NIS-Elements | Nikon | software | |
| oil red O | Solarbio | G1260 | reagent |
| optical microscope | Olympus IX73 | equipment | |
| Penicillin & Streptomycin 100× | NCM Biotech | CLOOC5 | reagent |
| Phosphate Buffered Saline | HyClone | SH30258.01 | reagent |
| Pipette | Eppendorf | equipment | |
| Sealing agent | Solarbio | S2150 | reagent |
References
- Fujimoto, T., Parton, R. G. Not just fat: the structure and function of the lipid droplet. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (3), 004838 (2011).
- Grasselli, E., et al. Models of non-alcoholic fatty liver disease and potential translational value: The effects of 3,5-L-diiodothyronine. Annals of Hepatology. 16 (5), 707-719 (2017).
- Herdt, T. H. Ruminant adaptation to negative energy balance: Influences on the etiology of ketosis and fatty liver. Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice. 16 (2), 215-230 (2000).
- Pino-de la Fuente, F., et al. Exercise regulation of hepatic lipid droplet metabolism. Life Sciences. 298, 120522 (2022).
- O'Connor, D., Byrne, A., Berselli, G. B., Long, C., Keyes, T. E. Mega-stokes pyrene ceramide conjugates for STED imaging of lipid droplets in live cells. Analyst. 144 (5), 1608-1621 (2019).
- Gao, G., et al. Control of lipid droplet fusion and growth by CIDE family proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA). Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (10), 1197-1204 (2017).
- Tütüncü Konyar, S. Dynamic changes in insoluble polysaccharides and neutral lipids in the developing anthers of an endangered plant species, Pancratium maritimum. Plant Systematics and Evolution. 304, 397-414 (2018).
- Spangenburg, E. E., Pratt, S. J. P., Wohlers, L. M., Lovering, R. M. Use of BODIPY (493/503) to visualize intramuscular lipid droplets in skeletal muscle. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 598358 (2011).
- Mehlem, A., Hagberg, C. E., Muhl, L., Eriksson, U., Falkevall, A. Imaging of neutral lipids by oil red O for analyzing the metabolic status in health and disease. Nature Protocols. 8 (6), 1149-1154 (2013).
- Diaz, G., Melis, M., Batetta, B., Angius, F., Falchi, A. M. Hydrophobic characterization of intracellular lipids in situ by Nile Red red/yellow emission ratio. Micron. 39 (7), 819-824 (2008).
- Duan, X., et al. The synthesis of polarity-sensitive fluorescent dyes based on the BODIPY chromophore. Dyes and Pigments. 89 (3), 217-222 (2011).
- Rumin, J., et al. The use of fluorescent Nile red and BODIPY for lipid measurement in microalgae. Biotechnology for Biofuels. 8, 42 (2015).
- Fam, T. K., Klymchenko, A. S., Collot, M. Recent advances in fluorescent probes for lipid droplets. Materials. 11 (9), 1768 (2018).
- Raboisson, D., Mounié, M., Maigné, É Diseases, reproductive performance, and changes in milk production associated with subclinical ketosis in dairy cows: A meta-analysis and review. Journal of Dairy Science. 97 (12), 7547-7563 (2014).
- Ospina, P. A., Nydam, D. V., Stokol, T., Overton, T. R. Associations of elevated nonesterified fatty acids and β-hydroxybutyrate concentrations with early lactation reproductive performance and milk production in transition dairy cattle in the northeastern United States. Journal of Dairy Science. 93 (4), 1596-1603 (2010).
- Campos-Espinosa, A., Guzmán, C. A model of experimental steatosis in vitro: hepatocyte cell culture in lipid overload-conditioned medium. Journal of Visualized Experiments. (171), e62543 (2021).
- Liu, L., et al. Effects of nonesterified fatty acids on the synthesis and assembly of very low density lipoprotein in bovine hepatocytes in vitro. Journal of Dairy Science. 97 (3), 1328-1335 (2014).
- Wang, L., Liu, J. Y., Miao, Z. J., Pan, Q. W., Cao, W. L. Lipid droplets and their interactions with other organelles in liver diseases. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 133, 105937 (2021).
- Sanjabi, B., et al. Lipid droplets hypertrophy: a crucial determining factor in insulin regulation by adipocytes. Scientific Reports. 5, 8816 (2015).
- Saponaro, C., Gaggini, M., Carli, F., Gastaldelli, A. The subtle balance between lipolysis and lipogenesis: a critical point in metabolic homeostasis. Nutrients. 7 (11), 9453-9474 (2015).
- Yang, A., Mottillo, E. P. Adipocyte lipolysis: from molecular mechanisms of regulation to disease and therapeutics. Biochemical Journal. 477 (5), 985-1008 (2020).
- Gluchowski, N. L., Becuwe, M., Walther, T. C., Farese, R. V. Lipid droplets and liver disease: from basic biology to clinical implications. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 14 (6), 343-355 (2017).
- Meex, R. C. R., Schrauwen, P., Hesselink, M. K. C. Modulation of myocellular fat stores: lipid droplet dynamics in health and disease. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 297 (4), 913-924 (2009).
- Sarnyai, F., et al. Effect of cis-and trans-monounsaturated fatty acids on palmitate toxicity and on palmitate-induced accumulation of ceramides and diglycerides. International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), 2626 (2020).
- Ricchi, M., et al. Differential effect of oleic and palmitic acid on lipid accumulation and apoptosis in cultured hepatocytes. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 24 (5), 830-840 (2009).
- Fei, W., et al. A role for phosphatidic acid in the formation of "supersized" lipid droplets. PLoS Genetics. 7 (7), e1002201 (2011).
- Kowada, T., Maeda, H., Kikuchi, K. BODIPY-based probes for the fluorescence imaging of biomolecules in living cells. Chemical Society Reviews. 44 (14), 4953-4972 (2015).
- Wang, J., et al. Application of the fluorescent dye BODIPY in the study of lipid dynamics of the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. Molecules. 23 (7), 1594 (2018).
