Summary
本协议描述了如何使用油红O染色脂滴（LDs），计算脂肪酸诱导的脂肪肝细胞模型中LDs的大小和数量，并使用BODIPY 493 / 503观察小LDs通过活细胞成像融合成大LD的过程。
Abstract
脂滴（LD）是在细胞中的脂质代谢和中性脂质储存中起重要作用的细胞器。它们与多种代谢疾病有关，如肥胖、脂肪肝和糖尿病。在肝细胞中，LD的大小和数量是脂肪肝疾病的征兆。此外，氧化应激反应、细胞自噬和细胞凋亡通常伴随着LDs的大小和数量的变化。因此，LDs的尺寸和数量是目前LD生物发生机制研究的基础。在这里，在脂肪酸诱导的牛肝细胞中，我们描述了如何使用油红O来染色LD并研究LD的大小和数量。对LDs的大小分布进行统计分析。活细胞成像系统也观察到小LD融合成大LD的过程。本工作为直接观察不同生理条件下LDs的大小变化趋势提供了一种途径。
Introduction
脂滴（LD）在肝细胞中的积累是非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的典型特征，可进展为肝纤维化和肝细胞癌。已经发现脂肪肝疾病的最早表现是脂肪变性，其特征是LD在肝细胞1的细胞质中蓄积。肝脂肪变性总是与LDs的数量增加和/或扩大有关2。LD被认为是由内质网（ER）产生的，由甘油三酯（TG）作为核心组成，并被蛋白质和磷脂包围3。作为负责TG储存的亚细胞器，LDs在大小，数量，脂质组成，蛋白质以及与其他细胞器的相互作用方面表现出不同的特征，所有这些都会影响细胞能量稳态4。TG水平与LDs的大小呈正相关，较高的细胞内TG含量可以形成更大的LDs5。LD通过TG的局部合成，ER中的脂质掺入以及多个LD的融合而增加尺寸6。含有大LD的细胞（脂肪细胞，肝细胞等）具有通过LD融合有效增加脂质储存的特殊机制。LDs的动态变化反映了细胞不同的能量代谢状态。开发能够观察和分析健康和异常细胞中各种肝LD的方法至关重要。
LDs的主要非荧光染料是苏丹黑B和油红O.苏丹黑B染色中性脂质，磷脂和类固醇7。油红O主要用于骨骼肌、心肌细胞、肝组织、脂肪细胞等LD染色8.，被认为是定量检测小鼠和人类肝脂肪变性的标准工具9。LDs的动态变化主要通过荧光染色进行。尼罗红和BODIPY都是常用的荧光脂质染料10,11。与尼罗河红相比，BODIPY具有更强的组织通透性，与LDs12结合更好。BODIPY标记的LD可用于活细胞染色和与其他细胞器共定位13。
反刍动物脂肪肝的发病率明显高于单胃动物14。在过渡期间，奶牛会经历负能量平衡状态3.牛肝细胞中大量非酯化脂肪酸（棕榈酸、油酸、亚油酸等）合成TGs，导致肝功能异常，大大降低奶制品品质和生产效率15。本研究旨在提供一种协议来分析LD的大小和数量，以及监测LD融合动力学。通过在肝细胞16 中添加不同浓度的亚油酸（LA）构建LD形成模型，并通过用油红O染色LD观察LD在此过程中大小和数量的变化。此外，通过用BODIPY 493/503染色也观察到LDs快速融合的过程。
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Protocol
所有程序均按照河南农业大学（中国河南省）动物护理委员会的道德标准进行批准和执行。
1.牛肝细胞培养
- 解冻原代肝细胞17 ，并在室温下离心400× g4 分钟。
注意：原代肝细胞按照先前发表的报告17进行培养和维持。 - 用移液管丢弃冷冻储存溶液，并用含有 10% 胎牛血清 （FBS） 和 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM） 的 1 mL 培养基悬浮。接下来，使用细胞计数室计算每毫升的细胞数，然后计算上述细胞悬液的浓度并将细胞浓度调节为1 x 107 个细胞/ mL。
- 将细胞悬液加入含有3mL上述培养基的60 mm细胞培养皿中。培养细胞并在37°C和5%CO2 下孵育24小时。
- 当细胞生长到80%时，丢弃培养基并用磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗，然后加入750μL0.25%胰蛋白酶以消化细胞。将细胞在37°C孵育3分钟，然后用等量的10%FBS中和它们。收集细胞悬液以在室温下以200× g 离心4分钟。
2.油红O染色
- 将 800 μL 含有 10% FBS 和 DMEM 的培养基加入到含有玻璃盖玻片的 24 孔细胞培养板的每个孔中。取 50 μL 细胞悬液（在步骤 1.3 中获得）并将其加入 950 μL PBS 中混合。使用细胞计数室计算每毫升的细胞数，然后计算上述细胞悬浮液的浓度。最后，将每个孔中的细胞浓度调节至4 x 104 / mL，并在37°C和5%CO2 下孵育24小时。
- 24小时后，丢弃培养基并用PBS洗涤。用含有 1 mg/mL 牛血清白蛋白 （BSA） 的 800 μL DMEM 诱导培养基悬浮。
- 将总共 100 μL LA（参见 材料表）溶解在 900 μL 无水乙醇中，并制备标准溶液 （100 mmol/L）。将 0 μmol/L、100 μmol/L、150 μmol/L 和 200 μmol/L LA 的梯度添加到 24 孔板中。每次治疗重复四次。在37°C和5%CO2 下孵育24小时。
- 取出培养基并用PBS洗涤细胞三次。用 400 μL 4% 多聚甲醛固定 20 分钟。丢弃固定剂溶液并用PBS洗涤三次。
- 用60%异丙醇孵育细胞5分钟，然后丢弃。加入新鲜制备的油红O工作溶液（见 材料表）（油红O：水的比例为3：2）20-30分钟，弃去染色溶液。用PBS洗涤细胞两到五次，直到没有多余的染料溶液。
- 加入 300 μL 苏木精染色溶液（苏木精：水比为 1：10），并将细胞核重新染色 1-2 分钟。丢弃染料溶液并用PBS洗涤细胞两到五次。从 24 孔板中取出玻璃盖玻片，将 10 μL 片剂密封剂（参见 材料表）滴到载玻片上后，将它们放在显微镜载玻片上（细胞朝下的一侧）。
- 密封后，在光学显微镜的油透镜下观察并成像细胞的LD（参见 材料表）。通过cellSens软件测量LD的直径，并分析LD的数量和大小。
3. LD的大小和数量的测量
- 拍摄图像：依次打开计算机和显微镜开关，将载玻片放在加载平台上，打开图像分析软件（见 材料表），连接计算机查看图像。
- 找到低功率的图像，并在成像载玻片上滴上适量的雪松油。将观察因子调整为100倍，设置自动曝光，并通过调整适当的视野来捕获图像。为每组选择三张染色的细胞载玻片进行成像。
- 直径测量：为每个图像随机选择 60 个 LD 来测量直径。每幅图像测量完毕后，保存图像并将测量结果输出到表格中，用于后续分析LD的平均尺寸和分布比例。
- 数量测量：为每张染色和拍照的载玻片选择三张图像，并在每张图片中随机选择三个单元格进行数量测量。计算和分析细胞周围的LD数量，并计算细胞中LD的平均数量。
4. LD融合的动态观测
- 按照步骤1.1-1.3中提到的细胞培养步骤进行操作。当细胞生长到80%时，丢弃培养基并用PBS冲洗，然后用750μL胰蛋白酶消化3分钟。接下来，加入 750 μL 培养基，在室温下以 200 x g 离心 4 分钟，弃去上清液。
- 将细胞悬浮在 1 mL 培养基中，计数，并在 35 mm 培养皿中将细胞浓度调节至 5 x 105 个细胞/mL。在37°C和5%CO2 下培养24小时。
- 当细胞生长到80%时，将培养基更换为DMEM + 150μmol/ L LA24小时，并在37°C和5%CO2 的培养箱中继续培养以积累LD。
- 24小时后，除去培养基。用PBS洗涤贴壁细胞，并用10μg/ mL BODIPY 493 / 503中性荧光探针（参见 材料表）在黑暗中孵育30分钟。孵育后，用PBS洗涤培养皿中的细胞三次，并加入DMEM + 150μmol/ L LA。
注意：在 10 μg/mL BODIPY 染色期间和之后避免光照;用PBS（1：100）稀释1mg/mL BODIPY。 - 将培养皿放在活细胞站显微镜的凹槽中（见 材料表），观察LDs的动态变化。 根据启动顺序打开活细胞工作站的电源，避光。
- 打开电源、透射光源、显微镜电源、汞灯荧光光源、电荷耦合器件（CCD）相机电源、计算机主机电源、CO2 阀门和CO2 培养箱。
- 将蒸馏水添加到装载平台上的凹槽中，确保不要越过通风口。
- 打开计算机并运行“NIS-Elements”。首先，在4倍物镜上找到合适的视场，然后依次调整到40倍物镜。选择E100用于在显微镜中观察样品，选择L100用于在计算机上预览和拍摄样品。
注意：E100和L100是活细胞工作站上的显微镜调节按钮（见 材料表），分别代表目镜和计算机屏幕。 - 设计参数，如荧光通道（例如，Ph-40x，异硫氰酸荧光素[FITC]，快门）和实验的预期拍摄时间。设置拍摄 时间，包括每两张图像之间5分钟的拍摄间隔时间和6小时的总拍摄时间。
注意：长时间拍摄需要使用完美对焦系统（PFS）对焦稳定功能。为此，首先调整视野和焦距，然后点击电脑屏幕上的 PFS ，最后调整精细对焦螺旋。 - 选择不同的通道模式，单通道或全部，选择不同的视野，单击 预览，调整视野，设置这些参数，然后单击开始 运行开始 拍摄。先试拍5分钟;操作正常后可能需要很长时间。
- 执行拍摄后，选择 “文件>另存为”>保存类型> avi 格式 将数据导出到“avi”格式的视频中。使用“.nd2”图像格式保存数据程序并导出照片。
- 要关闭机器电源，请按相反顺序将其关闭。
5. 统计和结果分析
- 使用单因子方差分析分析数据。将结果报告为平均±标准误差。
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Representative Results
细胞LD的染色如图 1所示。红点反映细胞LD，蓝点反映细胞核。可以看出，在LA的处理下，每张图片中LD的大小和数量是不同的。
随着LA剂量的增加，LD的平均直径和数量显示出显着增加的趋势，这取决于LA浓度（图2）。如图2A所示，每个细胞的LD数量与不同浓度的 LA呈负相关。100 μmol/L LA处理组每个细胞的中位LD数为136,150μmol/L和200μmol/L LA处理组分别降至118和105。对照组中LD的平均直径为0.72μm，100μmol/L LA处理组为1.38μm，150μmol/L LA处理组为1.51μm，200μmol/L LA处理组为1.64μm（图2B）。
在这项研究中，直径<1μm的LD被定义为小，直径>4μm的LDs被定义为大。结果发现LDs的分布比例也随LA浓度的变化而变化， 如图3所示;小LD的比例下降，大LD的比例增加。小直径LDs的比例在100 μmol/L LA时为43.33%，在150 μmol/L LA时为36.43%，在200 μmol/L LA时为29.8%。对于大直径LDs，200 μmol/L LA中的比例最高为6.11%，然后在150和100 μmol/L LA中分别为3.15%和1.48%。在200 μmol/L LA组中，观察到超大LDs（直径>5 μm），约占6.30%，高于100 μmol/L LA（5.93%）和150 μmol/L LA（4.82%）组。结果表明，高浓度的LA增加了LDs的大小，减少了LDs的数量。同时，大LD的比例增加，小LD的比例下降。
大LD通常通过小LD的融合形成，通过活细胞成像观察到LD融合以证明这一点（图4）。用150μmol/ L LA处理细胞24小时并用BODIPY染色。在37 °C和5%CO2的正常细胞生长条件下，用活细胞工作站连续观察细胞6 h。每5分钟拍摄一次图像。如图 4所示，在前15分钟内，仍然有明显的较小LD。然后，LD从20分钟开始缓慢融合，并在35分钟时完全融合成更大的LD。
图1：脂滴。 在不同浓度的LA中培养的肝细胞并用油红O染色。红点反射用油红色染色的LD，蓝紫色点反射苏木精的细胞核。在每次处理中，选择三张载玻片进行染色和成像。比例尺 = 10 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：LD 的数量和大小。 肝细胞以0至200μmol/ L LA的浓度梯度培养并用油红染色O.（A）每个细胞的平均LD数。每组计数27个细胞中的LD数量。（B）细胞中LD的平均直径。每组计算60个LD的大小。*p < 0.05;**p < 0.01;< 0.001;p < 0.0001。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：LD 比例。 用不同浓度的LA培养并用油红O染色的肝细胞，计算不同大小LD的比例比。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：LD 融合。 用150μmol/L LA培养肝细胞，并与BODIPY 493/503探针孵育。在40倍放大图像下连续观察6 h后，拍摄荧光和明场下的LD。每5分钟拍摄一次图像。融合用红色框标记。比例尺 = 20 μm。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
根据病理状态，肝LD的大小和数量会发生巨大变化。LD广泛存在于肝细胞中，在肝脏健康和疾病中起关键作用18。LDs的数量和大小是目前LDs19生物发生研究的基础。细胞和组织LD的大小和数量反映了它们储存和释放能量的能力。LDs的动态变化维持脂质代谢活动的稳定性20,21。LDs的异常积累发生在各种病理条件下，可能是代谢疾病的指标22,23。该协议提供了一种准确的方法来测量脂肪酸诱导的肝细胞模型中LD的大小和数量，并更有效地，更直观地观察LD的融合。
研究LDs的大小和动态变化，对于了解脂质代谢紊乱相关疾病的发生和有效干预具有重要意义。在这个实验中，关键步骤是测量和分析LDs的大小和数量。首先，使用不同浓度的LA诱导LD在肝细胞中积累。其他脂肪酸，如油酸酯和棕榈酸酯，也可用于引起肝细胞中的LD积累24,25。用不同浓度的LA处理后，发现LDs的大小以剂量依赖性方式增加。这些结果表明，油红O染色准确测量了LDs的直径。还发现高浓度的LA可以增加大尺寸LDs的比例，表明小LDs相互融合迅速。快速聚变是LDs的动态变化之一;LD快速融合可能在几分钟甚至几十秒内发生，主要由其表面磷脂和蛋白质22,26介导。在本研究中，使用活细胞工作站标记BODIPY 493/503标记在20分钟至35分钟内清楚地观察到LD融合。图像之间的拍摄间隔可以在几秒钟到几分钟内设置，总拍摄时间可以从1小时到几天不等，为观察不同细胞中LD的动态变化提供了便利。
在LDs大小的染色分析方面，油红O染色比荧光染色更方便，更便宜，并且更广泛地用于测量LDs9的表观尺寸。它不需要对光进行处理。而且，设备要求不难达到，普通光学显微镜的油状透镜可用于照片观察。使用这种方法，研究人员可以选择几组图像来随机测量LD的大小和数量;操作简单方便，可以增加样本量，减少误差。而且，根据实测和分析的LD尺寸，可以直接观察到不同LD尺寸的分布比例。油红O染色后可以通过上述方法进行统计分析，该方法也可以应用于其他细胞，包括受脂质积累影响的多种细胞。在染色初期，发现油红O染色后不易清洗，并且有大量染料杂志残留。后期对染料进行过滤，通过连续试验选择合适的染色时间。染色后，增加清洗次数可以避免上述问题。
BODIPY 493/503荧光染料是LD可视化最常见的探针之一27。在这项研究中，LD融合是通过用BODIPY标记LD绿色并用活细胞工作站观察过程来进行的。尼罗红也是中性脂质常用的荧光染料，但其激发带宽（450-560nm）、非特异性染色、组织通透性差等缺点可能在一定程度上影响LD染色的结果。与尼罗红荧光染色相比，BODIPY 493/503的激发带更窄（460-490 nm），可与多种荧光染料共标记11。其次，BODIPY有效避免了植物色素28的干扰。最后，BODIPY组织通透性强，对环境极性敏感性低，不易淬灭12;因此，它被广泛用于LD的荧光染色。然而，LD融合的分析具有一定的局限性。为了获得活细胞的连续观察图像，晶状体不能移动，因此在视觉中只能观察到局部LD融合，无法更准确地分析整个细胞的LD融合效率。
本研究为LD形态和大小分析提供了一种简单、可重复的方法，可广泛应用于LD分析研究细胞脂质代谢。这项工作也证明了LD融合的过程，为今后进一步研究LDs奠定了基础。
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Disclosures
提交人声明他们没有利益冲突。
Acknowledgments
本研究由国家自然科学基金（U1904116）共同支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin | Gibco | 25200072 | reagent |
| 4% paraformaldehyde | Solarbio | P1110 | reagent |
| BODIPY 493/503 | invitrogen | 2295015 | reagent |
| Cedar oil | Solarbio | C7140 | reagent |
| cell counting chamber | equipment | ||
| cell culture dish | Corning | 353002 | material |
| cell sens software | Olympus IX73 | software | |
| Centrifuge | Eppendorf | equipment | |
| DMEM | HyClone | SH30022.01 | reagent |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 2492319 | reagent |
| hematoxylin | DingGuo | AR0712 | reagent |
| Image view | image analysis sodtware | ||
| linoleic acid | Solarbio | SL8520 | reagent |
| Live Cell Station | Nikon A1 HD25 | equipment | |
| NIS-Elements | Nikon | software | |
| oil red O | Solarbio | G1260 | reagent |
| optical microscope | Olympus IX73 | equipment | |
| Penicillin & Streptomycin 100× | NCM Biotech | CLOOC5 | reagent |
| Phosphate Buffered Saline | HyClone | SH30258.01 | reagent |
| Pipette | Eppendorf | equipment | |
| Sealing agent | Solarbio | S2150 | reagent |
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