Summary
Bu protokol, lipit damlacıklarını (LD'ler) boyamak, yağ asidi kaynaklı yağlı hepatosit modelinde LD'lerin boyutunu ve sayısını hesaplamak ve canlı hücre görüntüleme ile küçük LD'lerin büyük LD'lere kaynaşma sürecini gözlemlemek için BODIPY 493/503'ün nasıl kullanılacağını açıklamaktadır.
Abstract
Lipid damlacıkları (LD'ler), lipid metabolizmasında ve hücrelerde nötr lipid depolanmasında önemli rol oynayan organellerdir. Obezite, yağlı karaciğer hastalığı ve diyabet gibi çeşitli metabolik hastalıklarla ilişkilidirler. Hepatik hücrelerde, LD'lerin boyutları ve sayıları yağlı karaciğer hastalığının belirtileridir. Ayrıca, oksidatif stres reaksiyonu, hücre otofajisi ve apoptoza genellikle LD'lerin boyutlarında ve sayılarında değişiklikler eşlik eder. Sonuç olarak, LD'lerin boyutları ve miktarları, LD biyogenezinin mekanizması ile ilgili mevcut araştırmaların temelini oluşturmaktadır. Burada, yağ asidine bağlı sığır karaciğer hücrelerinde, LD'leri boyamak ve LD'lerin boyutlarını ve sayılarını araştırmak için yağ kırmızısı O'nun nasıl kullanılacağını açıklıyoruz. LD'lerin boyut dağılımı istatistiksel olarak analiz edilmiştir. Küçük LD'lerin büyük LD'lere kaynaşma süreci de canlı hücre görüntüleme sistemi tarafından gözlemlenir. Mevcut çalışma, farklı fizyolojik koşullar altında LD'lerin boyut değişim eğilimini doğrudan gözlemlemenin bir yolunu sunmaktadır.
Introduction
Hepatositlerde lipid damlacığı (LD) birikimi, karaciğer fibrozisi ve hepatosellüler karsinoma ilerleyebilen alkolsüz yağlı karaciğer hastalığının (NAFLD) tipik özelliğidir. Yağlı karaciğer hastalığının en erken belirtisinin, hepatosit1'in sitoplazmasında LD birikimi ile karakterize steatoz olduğu bulunmuştur. Karaciğer steatozu her zaman LDs2'nin artmış sayısı ve / veya genişlemiş boyutu ile ilişkilidir. LD'lerin, çekirdek olarak trigliseritten (TG) oluşan endoplazmik retikulumdan (ER) üretildiği ve proteinler ve fosfolipitlerle çevrili olduğu düşünülmektedir3. TG depolamasından sorumlu hücre altı organel olarak, LD'ler boyutları, sayıları, lipit kompozisyonları, proteinleri ve diğer organellerle etkileşimleri ile ilgili farklı özellikler sergilerler ve bunların hepsi hücre enerjisi homeostazını etkiler4. TG seviyesi LD'lerin boyutu ile pozitif ilişkilidir ve daha yüksek bir hücre içi TG içeriği daha büyük LD'leroluşturabilir 5. LD'ler, TG'nin lokal sentezi, ER'de lipit katılımı ve çoklu LD'lerin füzyonu yoluyla boyut olarak artar6. Büyük LD'ler içeren hücreler (adipositler, hepatositler, vb.), LD füzyonu ile lipit depolanmasını etkili bir şekilde arttırmak için özel bir mekanizmaya sahiptir. LD'lerin dinamik değişiklikleri, hücrenin farklı enerji metabolizması durumlarını yansıtır. Sağlıklı ve anormal hücrelerdeki çeşitli hepatik LD'lerin gözlemlenmesine ve analizine izin veren metodolojiler geliştirmek çok önemlidir.
LD'ler için ana floresan olmayan boyalar Sudan Siyah B ve yağ kırmızısı O. Sudan Siyah B nötr lipitleri, fosfolipitleri ve steroidleri boyar7. Yağ kırmızısı O esas olarak iskelet kası, kardiyomiyositler, karaciğer dokusu, yağ hücreleri, vb.LD'leri boyamak için kullanılır 8 ve farelerde ve insanlarda karaciğer steatozunun kantitatif tespiti için standart bir araç olarak kabul edilir9. LD'lerin dinamik değişimi esas olarak floresan boyama ile gerçekleştirilir. Nil kırmızısı ve BODIPY yaygın olarak kullanılan floresan lipit boyalarıdır10,11. Nil kırmızısı ile karşılaştırıldığında, BODIPY daha güçlü doku geçirgenliğine sahiptir ve LDs12 ile daha iyi bağlanır. BODIPY etiketli LD'ler, canlı hücreleri boyamak ve diğer organellerle kolokalizasyon için kullanılabilir13.
Ruminant hayvanlarda yağlı karaciğer hastalığı insidansı monogastrik hayvanlara göre anlamlı derecede yüksektir14. Geçiş döneminde, süt negatif enerji dengesi durumu yaşarlar3. Büyük miktarlarda esterleştirilmemiş yağ asitleri (palmitik asit, oleik asit, linoleik asit, vb.) sığır hepatositlerinde TG'lere sentezlenir, bu da karaciğer fonksiyonel anormalliğine yol açar ve süt ürünlerinin kalitesini ve üretim verimliliğini büyük ölçüde azaltır15. Bu çalışma, LD'lerin boyut ve sayılarını analiz etmek ve LD füzyon dinamiklerini izlemek için bir protokol sağlamayı amaçlamaktadır. Hepatositler16'ya farklı konsantrasyonlarda linoleik asit (LA) ekleyerek bir LD oluşum modeli oluşturduk ve LD'leri yağ kırmızısı O ile boyayarak işlem sırasında LD'lerin boyutundaki ve sayısındaki değişiklikleri gözlemledik. Ek olarak, LD'lerin hızlı füzyon süreci BODIPY 493/503 ile boyanarak da gözlenmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm prosedürler Henan Tarım Üniversitesi (Henan Eyaleti, Çin) Hayvan Bakım Komitesi'nin etik standartlarına uygun olarak onaylanmış ve gerçekleştirilmiştir.
1. Sığır hepatosit hücre kültürü
- Birincil hepatosit hücreleri17'yi çözün ve oda sıcaklığında 4 dakika boyunca 400 x g santrifüj yapın.
NOT: Primer hepatosit hücreleri kültürlendi ve daha önce yayınlanmış bir rapor17'yi takiben muhafaza edildi. - Dondurulmuş depolama solüsyonunu bir pipetle atın ve% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve Dulbecco'nun modifiye Eagle's medium (DMEM) içeren 1 mL ortam ile askıya alın. Ardından, mililitre başına hücre sayısını hesaplamak için bir hücre sayma odası kullanın ve ardından yukarıdaki hücre süspansiyonunun konsantrasyonunu hesaplayın ve hücre konsantrasyonunu 1 x 107 hücre / mL'ye ayarlayın.
- Hücre süspansiyonunu, yukarıdaki ortamın 3 mL'sini içeren 60 mm'lik bir hücre kültürü kabına ekleyin. Hücreleri kültürleyin ve 24 saat boyunca 37 ° C'de ve% 5 CO2'de inkübe edin.
- Hücreler% 80'e büyüdüğünde, ortamı atın ve fosfat tamponlu salin (PBS) ile durulayın, ardından hücreleri sindirmek için 750 μL% 0.25 tripsin ekleyin. Hücreleri 3 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin, ardından aynı miktarda% 10 FBS ile nötralize edin. Oda sıcaklığında 4 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj yapmak için hücre süspansiyonunu toplayın.
2. Yağ kırmızısı O boyama
- Cam kapaklar içeren 24 delikli hücre kültür plakasının her bir kuyucuğuna %10 FBS ve DMEM içeren 800 μL kültür ortamı ekleyin. Hücre süspansiyonunun 50 μL'sini alın (adım 1.3'te elde edilen) ve karıştırmak için 950 μL PBS'ye ekleyin. Mililitre başına hücre sayısını hesaplamak için bir hücre sayma odası kullanın ve ardından yukarıdaki hücre süspansiyonunun konsantrasyonunu hesaplayın. Son olarak, hücre konsantrasyonunu her bir kuyucukta 4 x 104 / mL'ye ayarlayın ve 24 saat boyunca 37 ° C'de ve% 5 CO2'de inkübe edin.
- 24 saat sonra, kültür ortamını atın ve PBS ile yıkayın. 1 mg/mL sığır serum albümini (BSA) içeren 800 μL DMEM indüksiyon ortamı ile askıya alın.
- Toplam 100 μL LA'yı 900 μL susuz etanol içinde çözün ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve standart bir çözelti (100 mmol / L) hazırlayın. 24 delikli plakaya 0 μmol/L, 100 μmol/L, 150 μmol/L ve 200 μmol/L LA gradyanı ekleyin. Her tedaviyi dört kez tekrarlayın. 24 saat boyunca 37 ° C'de ve% 5 CO2'de inkübe edin.
- Kültür ortamını çıkarın ve hücreleri PBS ile üç kez yıkayın. 20 dakika boyunca 400 μL% 4 paraformaldehit ile sabitleyin. Fiksatif çözeltiyi atın ve PBS ile üç kez yıkayın.
- Hücreleri 5 dakika boyunca% 60 izopropil alkol ile inkübe edin, sonra atın. Taze hazırlanmış yağ kırmızısı O çalışma solüsyonunu ( bakınız Malzeme Tablosu) (3:2 yağ kırmızısı O:su oranı) 20-30 dakika boyunca ekleyin ve boyama solüsyonunu atın. Fazla boya çözeltisi kalmayana kadar hücreleri PBS ile iki ila beş kez yıkayın.
- 300 μL hematoksilin boyama çözeltisi ekleyin (hematoksilin: 1:10 su oranı) ve çekirdeği 1-2 dakika boyunca yeniden boyayın. Boya çözeltisini atın ve hücreleri PBS ile iki ila beş kez yıkayın. Cam kapak kapaklarını 24 delikli plakadan çıkarın ve slaytın üzerine 10 μL tablet sızdırmazlık maddesi (bkz.
- Sızdırmazlıktan sonra, optik mikroskobun yağ merceği altındaki hücrelerin LD'lerini gözlemleyin ve görüntüleyin (bkz. LD'lerin çapını cellSens yazılımı ile ölçün ve LD'lerin sayısını ve boyutunu analiz edin.
3. LD'lerin boyutunun ve sayısının ölçülmesi
- Görüntü yakalama: Bilgisayarı ve mikroskop anahtarını art arda açın, slaytı yükleme platformuna yerleştirin, görüntü analiz yazılımını açın (bkz. Malzeme Tablosu) ve görüntüyü görüntülemek için bilgisayarı bağlayın.
- Görüntüleri düşük güçte bulun ve görüntüleme slaytına uygun miktarda sedir yağı damlatın. Gözlem faktörünü 100x'e ayarlayın, otomatik pozlamayı ayarlayın ve uygun görüş alanını ayarlayarak görüntüleri yakalayın. Görüntüleme için her grup için üç boyalı hücre slaytı seçin.
- Çap ölçümü: Çapları ölçmek için her görüntü için rastgele 60 LD seçin. Her görüntünün ölçümünden sonra, görüntüleri kaydedin ve LD'lerin ortalama boyutunun ve dağılım oranının daha sonraki analizi için ölçüm sonuçlarını bir tabloya çıkarın.
- Miktar ölçümü: Her boyanmış ve fotoğraflanmış slayt için üç görüntü seçin ve her resimde miktar ölçümü için rastgele üç hücre seçin. Hücrenin etrafındaki LD sayısını sayıp analiz edin ve hücredeki ortalama LD sayısını hesaplayın.
4. LD füzyonunun dinamik gözlemi
- Adım 1.1-1.3'te belirtilen hücre kültürü adımlarını izleyin. Hücreler% 80'e kadar büyüdüğünde, ortamı atın ve PBS ile durulayın, ardından 3 dakika boyunca 750 μL tripsin ile sindirin. Daha sonra, 750 μL ortam ekleyin, oda sıcaklığında 4 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı atın.
- Hücreleri 1 mL kültür ortamında askıya alın, sayın ve hücre konsantrasyonunu 35 mm'lik bir tabakta 5 x 105 hücre / mL'ye ayarlayın. 37 °C'de kültür ve 24 saat boyunca %5 CO2 .
- Hücreler% 80'e büyüdüğünde, ortamı 24 saat boyunca DMEM + 150 μmol / L LA olarak değiştirin ve LD'leri biriktirmek için kültüre 37 ° C'de ve% 5 CO2'de bir inkübatörde devam edin.
- 24 saat sonra, kültür ortamını çıkarın. Yapışkan hücreleri PBS ile yıkayın ve karanlıkta 30 dakika boyunca 10 μg / mL BODIPY 493/503 nötr floresan probu (bkz. Kuluçkadan sonra, kültür kabındaki hücreleri PBS ile üç kez yıkayın ve DMEM + 150 μmol / L LA ekleyin.
NOT: 10 μg/mL BODIPY boyama sırasında ve sonrasında ışığa maruz kalmaktan kaçının; 1 mg/mL BODIPY PBS (1:100) ile seyreltildi. - LD'lerin dinamik değişikliklerini gözlemlemek için kültür kabını canlı hücre istasyonunun mikroskobunun oluğuna yerleştirin (bkz.
- Güç, iletim ışık kaynağı, mikroskop güç kaynağı, cıva lambası floresan ışık kaynağı, şarj bağlantılı cihaz (CCD) kamera güç kaynağı, bilgisayar ana bilgisayar güç kaynağı, CO 2 valfi ve CO2 inkübatörünü açın.
- Yükleme platformundaki oluğa damıtılmış su ekleyerek havalandırma deliğinden geçmediğinizden emin olun.
- Bilgisayarı açın ve "NIS-Elements" ı çalıştırın. İlk olarak, 4x objektif lenste uygun görüş alanını bulun, ardından art arda 40x objektif lense ayarlayın. Örneği mikroskopta gözlemlemek için E100'ü ve örneği bilgisayarda önizlemek ve fotoğraflamak için L100'ü seçin.
NOT: E100 ve L100, canlı hücre iş istasyonundaki mikroskop ayar düğmeleridir (bkz. Malzeme Tablosu), sırasıyla göz merceğini ve bilgisayar ekranını temsil eder. - Floresan kanalı (örneğin, Ph-40x, Floresein izotiyosiyanat [FITC], deklanşör) ve deney için beklenen çekim süresi gibi parametreleri tasarlayın. Her iki görüntü arasındaki 5 dakikalık çekim aralığı ve toplam 6 saatlik çekim süresi dahil olmak üzere çekim süresini zamanında ayarlayın.
NOT: Uzun süreli çekimlerde mükemmel netleme sistemi (PFS) netleme sabitleme işlevinin kullanılması gerekir. Bunun için önce görüş alanını ve netleme uzunluğunu ayarlayın, ardından bilgisayar ekranında PFS'ye tıklayın ve son olarak ince netleme spiralini ayarlayın. - Farklı kanal modları, tek kanal veya tümü seçin, farklı bir görüş alanı seçin, önizleme'yi tıklayın, görüş alanını ayarlayın, bu parametreleri ayarlayın ve çekime başlamak için koşmaya başla'yı tıklayın. Önce 5 dakika boyunca bir test çekimi yapın; Operasyon normal olduktan sonra uzun zaman alabilir.
- Çekim gerçekleştirildikten sonra, verileri 'avi' formatında bir videoya dışa aktarmak için Dosya > Farklı Kaydet > Kaydet türü > avi formatını seçin. Veri programını kaydetmek ve fotoğrafları dışa aktarmak için '.nd2' görüntü biçimini kullanın.
- Makineyi kapatmak için, ters sırada kapatın.
5. İstatistik ve sonuç analizi
- Tek yönlü ANOVA kullanarak verileri analiz edin. Sonuçları ortalama ± standart hata olarak raporlayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
LD hücrelerinin boyanması Şekil 1'de gösterilmiştir. Kırmızı noktalar hücre LD'lerini yansıtır ve mavi noktalar çekirdekleri yansıtır. LA tedavisinde her resimdeki LD'lerin boyut ve sayısının farklı olduğu görülebilir.
LA dozajındaki artışla birlikte, LD'lerin ortalama çapı ve sayısı, LA konsantrasyonuna bağlı olarak önemli ölçüde artan bir eğilim göstermiştir (Şekil 2). Şekil 2A'da gösterildiği gibi, hücre başına LD sayısı, farklı LA konsantrasyonları ile negatif korelasyon göstermiştir. Hücre başına medyan LD sayısı, 100 μmol / L LA ile tedavi edilen grup için 136 idi, sırasıyla 150 μmol / L ve 200 μmol / L LA ile tedavi edilen gruplar için 118 ve 105'e düştü. Kontrol grubundaki LD'lerin ortalama çapı 0.72 μm, 100 μmol/L LA ile tedavi edilen grup için 1.38 μm, 150 μmol/L LA ile tedavi edilen grup için 1.51 μm ve 200 μmol/L LA ile tedavi edilen grup için 1.64 μm idi (Şekil 2B).
Bu çalışmada <1 μm çapında LD'ler küçük, >4 μm çapında LD'ler büyük olarak tanımlanmıştır. LD'lerin dağılım oranlarının da Şekil 3'te gösterildiği gibi LA konsantrasyonu ile değiştiği bulunmuştur; küçük LD'lerin oranı azaldı ve büyük LD'lerin oranı arttı. Küçük çaplı LD'lerin oranı 100 μmol/L LA'da %43.33, 150 μmol/L LA'da %36.43 ve 200 μmol/L LA'da %29.8 idi. Büyük çaplı LD'ler için en yüksek oran 200 μmol / L LA'da% 6.11, daha sonra 150 ve 100 μmol / L LA'da sırasıyla% 3.15 ve% 1.48 idi. 200 μmol / L LA grubunda, süper büyük LD'ler (çap >5 μm) açıkça gözlendi, yaklaşık% 6.30'u oluşturuyordu, 100 μmol / L LA (% 5.93) ve 150 μmol / L LA (% 4.82) gruplarından daha yüksekti. Sonuçlar, yüksek bir LA konsantrasyonunun LD'lerin boyutunu arttırdığını ve LD sayısını azalttığını göstermiştir. Bu arada, büyük LD'lerin oranı arttı ve küçük LD'lerin oranı azaldı.
Büyük LD'ler genellikle küçük LD'lerin füzyonu ile oluşmuştur. canlı hücre görüntüleme yoluyla LD füzyonunun bunu kanıtladığı gözlenmiştir (Şekil 4). Hücreler 24 saat boyunca 150 μmol / L LA ile tedavi edildi ve BODIPY ile boyandı. 37 ° C ve% 5 CO2'deki normal hücre büyüme koşulu altında, hücreler canlı bir hücre iş istasyonu ile 6 saat boyunca sürekli olarak gözlendi. Görüntüler her 5 dakikada bir çekildi. Şekil 4'te gösterildiği gibi, ilk 15 dakikada, hala belirgin daha küçük LD'ler vardı. Daha sonra, LD'ler yavaşça 20 dakikadan itibaren kaynaşmaya başladı ve 35 dakika boyunca daha büyük LD'lere tamamen kaynaştı.
Şekil 1: Lipid damlacıkları. Hepatosit hücreleri farklı LA konsantrasyonlarında kültürlendi ve yağ kırmızısı O ile boyandı. Kırmızı noktalar yağ kırmızısı ile boyanmış LD'leri yansıtıyordu ve mavi-mor noktalar çekirdeği hematoksilin ile yansıtıyordu. Her tedavide boyama ve görüntüleme için üç cam slayt seçildi. Ölçek çubuğu = 10 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: LD'lerin sayısı ve boyutu. Hepatosit hücreleri, 0 ila 200 μmol / L LA arasında bir konsantrasyon gradyanında kültürlenir ve yağ kırmızısı O. (A) ile boyanır. hücre başına ortalama LD sayısı. Her grupta 27 hücredeki LD sayısı sayıldı. (B) Bir hücredeki LD'lerin ortalama çapı. Her grupta 60 LD'nin büyüklüğü sayıldı. *p < 0,05; **p < 0,01; p < 0.001; p < 0.0001. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: LD oranı. Farklı LA konsantrasyonlarında kültürlenen ve yağ kırmızısı O ile boyanan hepatosit hücreleri, farklı boyutlardaki LD'lerin oran oranı hesaplandı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: LD füzyonu. Hepatosit hücreleri 150 μmol/L LA ile kültürlendi ve BODIPY 493/503 probu ile inkübe edildi. 40x büyütmeli bir görüntü altında 6 saat boyunca sürekli gözlemden sonra, floresan altındaki LD'ler ve parlak alanlar fotoğraflandı. Görüntüler her 5 dakikada bir çekildi. Füzyon kırmızı kutularla işaretlendi. Ölçek çubuğu = 20 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Patolojik durumlara bağlı olarak, hepatik LD'ler boyutlarında ve sayılarında muazzam değişikliklere uğrarlar. LD'ler hepatosit hücrelerinde yaygın olarak bulunur ve karaciğer sağlığı ve hastalığında önemli bir rol oynar18. LD'lerin miktarı ve büyüklüğü, LD'lerin biyogenezi üzerine yapılan güncel araştırmaların temelidir19. Hücreler ve dokular için LD'lerin büyüklüğü ve sayısı, enerji depolama ve serbest bırakma yeteneklerini yansıtır. LD'lerin dinamik değişiklikleri lipid metabolik aktivitelerinin stabilitesini korur20,21. LD'lerin anormal birikimi çeşitli patolojik durumlarda ortaya çıkar ve metabolik hastalığın bir göstergesi olabilir22,23. Bu protokol, yağ asidi kaynaklı hepatosit hücre modelinde LD'lerin boyutunu ve miktarını ölçmek ve LD'lerin füzyonunu daha verimli ve sezgisel bir şekilde gözlemlemek için doğru bir yöntem sağlar.
LD'lerin boyut ve dinamik değişimlerini incelemek, lipid metabolizması bozukluklarına bağlı hastalıkların oluşumunu anlamak ve etkili müdahale açısından büyük önem taşımaktadır. Bu deneyde kilit adımlar, LD'lerin büyüklüğünün ve miktarının ölçülmesi ve analiziydi. İlk olarak, hepatositlerde LD birikimini indüklemek için farklı LA konsantrasyonları kullanılmıştır. Oleat ve palmitat gibi diğer yağ asitleri de hepatosit hücrelerinde LD birikimine neden olmak için kullanılabilir24,25. Farklı konsantrasyonlarda LA ile yapılan tedaviden sonra, LD'lerin boyutunun doza bağımlı bir şekilde arttığı bulunmuştur. Bu sonuçlar, yağ kırmızısı O boyamasının LD'lerin çapını doğru bir şekilde ölçtüğünü göstermiştir. Ayrıca, yüksek bir LA konsantrasyonunun büyük boyutlu LD'lerin oranını artırabileceği ve küçük LD'lerin birbirleriyle hızla kaynaştığını düşündürdüğü bulunmuştur. Hızlı füzyon, LD'lerdeki dinamik değişikliklerden biridir; LD hızlı füzyonu birkaç dakika hatta onlarca saniye içinde ortaya çıkabilir ve esas olarak yüzey fosfolipitleri ve protein22,26 aracılık eder. Bu çalışmada, LD füzyonu, canlı bir hücre iş istasyonu tarafından BODIPY 493/503 etiketlemesi kullanılarak 20 dakika ila 35 dakika arasında açıkça gözlenmiştir. Görüntüler arasındaki çekim aralığı birkaç saniye ila birkaç dakika içinde ayarlanabilir ve toplam çekim süresi 1 saatten birkaç güne ayarlanabilir, bu da LD'lerin farklı hücrelerdeki dinamik değişikliklerini gözlemlemek için kolaylık sağlar.
LD'lerin boyutunun boyama analizi açısından, yağ kırmızısı O boyama, floresan boyamadan daha uygun ve daha ucuzdur ve LD'lerin görünür boyutunu ölçmek için daha yaygın olarak kullanılır9. Işığa karşı tedavi edilmesine gerek yoktur. Dahası, ekipman gereksinimlerinin karşılanması zor değildir ve sıradan bir optik mikroskobun yağ lensi fotoğraf gözlemi için kullanılabilir. Bu yöntemi kullanarak, araştırmacılar LD'lerin boyutunu ve miktarını rastgele ölçmek için birkaç görüntü grubu seçebilirler; Kullanımı basit ve kullanışlıdır ve numune boyutunu artırabilir ve hatayı azaltabilir. Ayrıca, ölçülen ve analiz edilen LD boyutuna göre, farklı LD boyutlarının dağılım oranı doğrudan gözlemlenebilir. İstatistiksel analiz, yağ kırmızısı O boyamasından sonra yukarıdaki yöntemle yapılabilir ve bu yöntem, lipit birikiminden etkilenen çok çeşitli hücreler de dahil olmak üzere diğer hücrelere de uygulanabilir. Erken boyama aşamasında, yağ kırmızısı O'nun boyamadan sonra temizlenmesinin kolay olmadığı ve önemli miktarda boya dergisi kalıntıları olduğu bulunmuştur. Daha sonraki aşamada, boya filtrelendi ve sürekli testlerle uygun boyama süresi seçildi. Boyamadan sonra, temizleme sürelerinin arttırılması yukarıdaki sorunu önleyebilir.
BODIPY 493/503 floresan boya, LD görselleştirme27 için en yaygın problardan biridir. Bu çalışmada LD yeşili BODIPY ile etiketlenerek ve canlı hücre iş istasyonu ile süreç gözlemlenerek LD füzyonu gerçekleştirilmiştir. Nil kırmızısı aynı zamanda nötr lipitler için yaygın olarak kullanılan bir floresan boyadır, ancak geniş uyarma bandı (450-560 nm), spesifik olmayan boyama, zayıf doku geçirgenliği ve diğer eksiklikler LD boyama sonuçlarını bir dereceye kadar etkileyebilir. Nil kırmızısı floresan boyaması ile karşılaştırıldığında, BODIPY 493/503'ün uyarma bandı daha dardı (460-490 nm) ve çeşitli floresan boyalarla birlikte etiketlenebilir11. İkincisi, BODIPY bitki pigmentlerinin müdahalesini etkili bir şekilde önler28. Son olarak, BODIPY güçlü doku geçirgenliğine, çevresel polariteye karşı düşük duyarlılığa sahiptir ve söndürülmesi kolay değildir12; bu nedenle, LD'lerin floresan boyamasında yaygın olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, LD füzyonunun analizinin bazı sınırlamaları vardır. Canlı hücrelerin sürekli bir gözlem görüntüsünü elde etmek için lens hareket ettirilemez, bu nedenle görmede sadece lokal bir LD füzyonu gözlenebilir ve tüm hücrenin LD füzyon etkinliği daha doğru bir şekilde analiz edilemez.
Sonuç olarak, bu çalışma, LD morfolojisi ve boyut analizi için, hücresel lipid metabolizmasının incelenmesinde LD analizine yaygın olarak uygulanabilecek basit ve tekrarlanabilir bir yöntem sunmaktadır. Bu çalışma aynı zamanda LD füzyonu sürecini kanıtladı ve gelecekte LD'lerin daha fazla araştırılması için temel oluşturdu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu araştırma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (U1904116) tarafından ortaklaşa desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin | Gibco | 25200072 | reagent |
| 4% paraformaldehyde | Solarbio | P1110 | reagent |
| BODIPY 493/503 | invitrogen | 2295015 | reagent |
| Cedar oil | Solarbio | C7140 | reagent |
| cell counting chamber | equipment | ||
| cell culture dish | Corning | 353002 | material |
| cell sens software | Olympus IX73 | software | |
| Centrifuge | Eppendorf | equipment | |
| DMEM | HyClone | SH30022.01 | reagent |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 2492319 | reagent |
| hematoxylin | DingGuo | AR0712 | reagent |
| Image view | image analysis sodtware | ||
| linoleic acid | Solarbio | SL8520 | reagent |
| Live Cell Station | Nikon A1 HD25 | equipment | |
| NIS-Elements | Nikon | software | |
| oil red O | Solarbio | G1260 | reagent |
| optical microscope | Olympus IX73 | equipment | |
| Penicillin & Streptomycin 100× | NCM Biotech | CLOOC5 | reagent |
| Phosphate Buffered Saline | HyClone | SH30258.01 | reagent |
| Pipette | Eppendorf | equipment | |
| Sealing agent | Solarbio | S2150 | reagent |
References
- Fujimoto, T., Parton, R. G. Not just fat: the structure and function of the lipid droplet. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (3), 004838 (2011).
- Grasselli, E., et al. Models of non-alcoholic fatty liver disease and potential translational value: The effects of 3,5-L-diiodothyronine. Annals of Hepatology. 16 (5), 707-719 (2017).
- Herdt, T. H. Ruminant adaptation to negative energy balance: Influences on the etiology of ketosis and fatty liver. Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice. 16 (2), 215-230 (2000).
- Pino-de la Fuente, F., et al. Exercise regulation of hepatic lipid droplet metabolism. Life Sciences. 298, 120522 (2022).
- O'Connor, D., Byrne, A., Berselli, G. B., Long, C., Keyes, T. E. Mega-stokes pyrene ceramide conjugates for STED imaging of lipid droplets in live cells. Analyst. 144 (5), 1608-1621 (2019).
- Gao, G., et al. Control of lipid droplet fusion and growth by CIDE family proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA). Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (10), 1197-1204 (2017).
- Tütüncü Konyar, S. Dynamic changes in insoluble polysaccharides and neutral lipids in the developing anthers of an endangered plant species, Pancratium maritimum. Plant Systematics and Evolution. 304, 397-414 (2018).
- Spangenburg, E. E., Pratt, S. J. P., Wohlers, L. M., Lovering, R. M. Use of BODIPY (493/503) to visualize intramuscular lipid droplets in skeletal muscle. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 598358 (2011).
- Mehlem, A., Hagberg, C. E., Muhl, L., Eriksson, U., Falkevall, A. Imaging of neutral lipids by oil red O for analyzing the metabolic status in health and disease. Nature Protocols. 8 (6), 1149-1154 (2013).
- Diaz, G., Melis, M., Batetta, B., Angius, F., Falchi, A. M. Hydrophobic characterization of intracellular lipids in situ by Nile Red red/yellow emission ratio. Micron. 39 (7), 819-824 (2008).
- Duan, X., et al. The synthesis of polarity-sensitive fluorescent dyes based on the BODIPY chromophore. Dyes and Pigments. 89 (3), 217-222 (2011).
- Rumin, J., et al. The use of fluorescent Nile red and BODIPY for lipid measurement in microalgae. Biotechnology for Biofuels. 8, 42 (2015).
- Fam, T. K., Klymchenko, A. S., Collot, M. Recent advances in fluorescent probes for lipid droplets. Materials. 11 (9), 1768 (2018).
- Raboisson, D., Mounié, M., Maigné, É Diseases, reproductive performance, and changes in milk production associated with subclinical ketosis in dairy cows: A meta-analysis and review. Journal of Dairy Science. 97 (12), 7547-7563 (2014).
- Ospina, P. A., Nydam, D. V., Stokol, T., Overton, T. R. Associations of elevated nonesterified fatty acids and β-hydroxybutyrate concentrations with early lactation reproductive performance and milk production in transition dairy cattle in the northeastern United States. Journal of Dairy Science. 93 (4), 1596-1603 (2010).
- Campos-Espinosa, A., Guzmán, C. A model of experimental steatosis in vitro: hepatocyte cell culture in lipid overload-conditioned medium. Journal of Visualized Experiments. (171), e62543 (2021).
- Liu, L., et al. Effects of nonesterified fatty acids on the synthesis and assembly of very low density lipoprotein in bovine hepatocytes in vitro. Journal of Dairy Science. 97 (3), 1328-1335 (2014).
- Wang, L., Liu, J. Y., Miao, Z. J., Pan, Q. W., Cao, W. L. Lipid droplets and their interactions with other organelles in liver diseases. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 133, 105937 (2021).
- Sanjabi, B., et al. Lipid droplets hypertrophy: a crucial determining factor in insulin regulation by adipocytes. Scientific Reports. 5, 8816 (2015).
- Saponaro, C., Gaggini, M., Carli, F., Gastaldelli, A. The subtle balance between lipolysis and lipogenesis: a critical point in metabolic homeostasis. Nutrients. 7 (11), 9453-9474 (2015).
- Yang, A., Mottillo, E. P. Adipocyte lipolysis: from molecular mechanisms of regulation to disease and therapeutics. Biochemical Journal. 477 (5), 985-1008 (2020).
- Gluchowski, N. L., Becuwe, M., Walther, T. C., Farese, R. V. Lipid droplets and liver disease: from basic biology to clinical implications. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 14 (6), 343-355 (2017).
- Meex, R. C. R., Schrauwen, P., Hesselink, M. K. C. Modulation of myocellular fat stores: lipid droplet dynamics in health and disease. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 297 (4), 913-924 (2009).
- Sarnyai, F., et al. Effect of cis-and trans-monounsaturated fatty acids on palmitate toxicity and on palmitate-induced accumulation of ceramides and diglycerides. International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), 2626 (2020).
- Ricchi, M., et al. Differential effect of oleic and palmitic acid on lipid accumulation and apoptosis in cultured hepatocytes. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 24 (5), 830-840 (2009).
- Fei, W., et al. A role for phosphatidic acid in the formation of "supersized" lipid droplets. PLoS Genetics. 7 (7), e1002201 (2011).
- Kowada, T., Maeda, H., Kikuchi, K. BODIPY-based probes for the fluorescence imaging of biomolecules in living cells. Chemical Society Reviews. 44 (14), 4953-4972 (2015).
- Wang, J., et al. Application of the fluorescent dye BODIPY in the study of lipid dynamics of the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. Molecules. 23 (7), 1594 (2018).
