Summary
本プロトコルでは、オイルレッドOを使用して脂肪滴(LD)を染色する方法、脂肪酸誘発脂肪肝細胞モデルでLDのサイズと数を計算する方法、およびBODIPY 493/503を使用して小さなLDが大きなLDに融合するプロセスを観察する方法について説明しますライブセルイメージングによる。
Abstract
脂肪滴(LD)は、細胞内の脂質代謝および中性脂質貯蔵において重要な役割を果たす細胞小器官です。それらは、肥満、脂肪肝疾患、糖尿病などのさまざまな代謝性疾患に関連しています。肝細胞では、LDのサイズと数は脂肪肝疾患の兆候です。さらに、酸化ストレス反応、細胞オートファジー、およびアポトーシスは、LDのサイズと数の変化を伴うことがよくあります。その結果、LDの寸法と量は、LD生合成のメカニズムに関する現在の研究の基礎となっています。ここでは、脂肪酸誘導性ウシ肝細胞において、オイルレッドOを用いてLDを染色する方法と、LDのサイズと数を調べる方法について説明します。LDのサイズ分布を統計的に分析します。小さなLDが大きなLDに融合する過程は、生細胞イメージングシステムによっても観察されます。今回の研究は、異なる生理学的条件下でのLDのサイズ変化傾向を直接観察する方法を提供する。
Introduction
肝細胞における脂肪滴(LD)の蓄積は、肝線維症および肝細胞癌に進行する可能性のある非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)の典型的な特徴です。脂肪肝疾患の最も初期の症状は脂肪症であり、肝細胞の細胞質におけるLD蓄積を特徴とすることが見出されている1。肝脂肪症は、常にLDの数の増加および/またはサイズの拡大に関連しています2。LDは、中性脂肪(TG)を核とした小胞体(ER)から生成されると考えられており、タンパク質やリン脂質に囲まれています3。TG貯蔵を担う細胞内オルガネラとして、LDは、そのサイズ、数、脂質組成、タンパク質、および他のオルガネラとの相互作用に関して異なる特徴を示し、これらはすべて細胞エネルギー恒常性に影響を与えます4。TGレベルはLDのサイズと正の相関があり、細胞内TG含有量が高いほど、より大きなLDを形成する可能性があります5。LDは、TGの局所合成、ERへの脂質の取り込み、および複数のLDの融合によってサイズが増加します6。大きなLDを含む細胞(脂肪細胞、肝細胞など)は、LD融合によって脂質貯蔵を効率的に増加させる特殊なメカニズムを持っています。LDの動的な変化は、細胞のさまざまなエネルギー代謝状態を反映しています。健常細胞と異常細胞における様々な肝LDの観察と解析を可能にする方法論を開発することが重要です。
LDの主な非蛍光色素はスーダンブラックBとオイルレッドOであり、スーダンブラックBは中性脂質、リン脂質、ステロイドを染色します7。オイルレッドOは、主に骨格筋、心筋細胞、肝臓組織、脂肪細胞などのLDの染色に使用され8、マウスおよびヒトの肝脂肪症を定量的に検出するための標準ツールと考えられています9。LDの動的変化は、主に蛍光染色によって行われる。ナイルレッドおよびBODIPYは、いずれも一般的に使用される蛍光脂質色素10、11である。ナイルレッドと比較して、BODIPYはより強い組織透過性を有し、LDs12とよりよく結合する。BODIPY標識LDは、生細胞の染色および他の細胞小器官との共局在に使用することができる13。
脂肪肝疾患の発生率は、反芻動物の方が単胃動物よりも有意に高い14。移行期間中、乳牛は負のエネルギー収支の状態を経験します3。ウシ肝細胞では、大量の非エステル化脂肪酸(パルミチン酸、オレイン酸、リノール酸など)がTGに合成され、肝機能異常を引き起こし、乳製品の品質や生産効率を大幅に低下させます15。本研究は、LDのサイズと数を解析し、LD融合ダイナミクスを監視するためのプロトコルを提供することを目的としています。我々は、肝細胞16 に異なる濃度のリノール酸(LA)を添加してLD形成モデルを構築し、LDをオイルレッドOで染色することにより、プロセス中のLDのサイズと数の変化を観察しました。さらに、LDの急速な融合の過程は、BODIPY 493/503による染色によっても観察された。
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Protocol
すべての手順は、河南農業大学(中国河南省)の動物管理委員会の倫理基準に従って承認され、実行されました。
1. ウシ肝細胞培養
- 初代肝細胞細胞17 を解凍し、400 x g を室温で4分間遠心分離します。
注:初代肝細胞細胞は、以前に発表されたレポート17に従って培養および維持されました。 - 凍結保存液をピペットで廃棄し、10%ウシ胎児血清(FBS)とダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)を含む1 mLの培地で懸濁します。次に、細胞計数チャンバーを使用してミリリットルあたりの細胞数を計算し、上記の細胞懸濁液の濃度を計算し、細胞濃度を1 x 107 細胞/ mLに調整します。
- 上記の培地を3 mL入れた60 mm細胞培養皿に細胞懸濁液を加えます。細胞を培養し、37°Cおよび5%CO2 で24時間インキュベートします。
- 細胞が80%まで成長したら、培地を廃棄し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)ですすぎ、750 μLの0.25%トリプシンを加えて細胞を消化します。細胞を37°Cで3分間インキュベートした後、同量の10%FBSで中和します。細胞懸濁液を回収し、200 x g で室温で4分間遠心分離します。
2.オイルレッドO染色
- 10%FBSおよびDMEMを含む800 μLの培養液を、ガラスカバーガラスを含む24ウェル細胞培養プレートの各ウェルに加えます。50 μLの細胞懸濁液(ステップ1.3で得られた)を取り、それを950 μLのPBSに加えて混合します。細胞計数チャンバーを使用してミリリットルあたりの細胞数を計算し、次に上記の細胞懸濁液の濃度を計算します。最後に、各ウェルで細胞濃度を4 x 104/mLに調整し、37°C、5%CO2 で24時間インキュベートします。
- 24時間後、培養液を捨て、PBSで洗浄する。1 mg/mLのウシ血清アルブミン(BSA)を含む800 μLのDMEM誘導培地で懸濁します。
- 合計100 μLのLA( 材料表参照)を900 μLの無水エタノールに溶解し、標準溶液(100 mmol/L)を調製します。0 μmol/L、100 μmol/L、150 μmol/L、および200 μmol/L LAのグラジエントを24ウェルプレートに追加します。各治療を4回繰り返します。37°C、5%CO2 で24時間インキュベートします。
- 培養液を取り出し、細胞をPBSで3回洗浄します。400 μLの4%パラホルムアルデヒドで20分間固定します。固定液を捨て、PBSで3回洗浄します。
- 細胞を60%イソプロピルアルコールで5分間インキュベートし、その後廃棄します。新たに調製したオイルレッドO作業溶液( 材料表を参照)(オイルレッドO:水の3:2の比率)を20〜30分間加え、染色液を廃棄します。余分な色素溶液がなくなるまで、細胞をPBSで2〜5回洗浄します。
- 300 μLのヘマトキシリン染色溶液(ヘマトキシリン:水比1:10)を加え、核を1〜2分間再染色します。色素溶液を捨て、細胞をPBSで2〜5回洗浄します。24ウェルプレートからガラスカバースリップを取り出し、10 μLの錠剤シーラント( 材料表を参照)をスライドに滴下した後、顕微鏡スライド(細胞を下向きにする側)に置きます。
- 封止後、光学顕微鏡のオイルレンズの下で細胞のLDを観察し、画像化します( 材料表を参照)。cellSensソフトウェアでLDの直径を測定し、LDの数とサイズを分析します。
3. LDのサイズと数の測定
- 画像のキャプチャ:コンピューターと顕微鏡スイッチを連続してオンにし、スライドをローディングプラットフォームに置き、画像分析ソフトウェア( 材料表を参照)を開き、コンピューターを接続して画像を表示します。
- 低電力で画像を見つけ、イメージングスライドに適切な量の杉油を滴下します。観察係数を100倍に調整し、自動露出を設定し、適切な視野を調整して画像をキャプチャします。イメージングのために、各グループに対して3つの染色細胞スライドを選択します。
- 直径測定:画像ごとに60個のLDをランダムに選択して直径を測定します。各画像の測定後、画像を保存し、測定結果を表に出力して、LDの平均サイズと分布比を後で分析します。
- 量測定:染色および撮影されたスライドごとに3つの画像を選択し、各画像の数量測定用に3つのセルをランダムに選択します。セル周辺のLD数をカウントして分析し、セル内のLDの平均数を計算します。
4. LD核融合の動的観測
- 手順1.1〜1.3で説明した細胞培養手順に従います。細胞が80%に成長したら、培地を捨ててPBSですすぎ、750μLのトリプシンで3分間消化します。次に、培地750 μLを添加し、200 x g で室温で4分間遠心分離し、上清を廃棄します。
- 細胞を1 mLの培養液に懸濁し、カウントし、35 mmディッシュで細胞濃度を5 x 105 細胞/mLに調整します。37°C、5%CO2 で24時間培養します。
- 細胞が80%まで増殖したら、培地をDMEM + 150 μmol/L LAに24時間交換し、37°C、5%CO2 のインキュベーターで培養を続け、LDを蓄積させます。
- 24時間後、培養液を取り出す。接着細胞をPBSで洗浄し、10 μg/mL BODIPY 493/503中性蛍光プローブ( 材料表参照)とともに暗所で30分間インキュベートします。インキュベーション後、培養皿内の細胞をPBSで3回洗浄し、DMEM + 150 μmol/L LAを添加します。
注:10 μg/mL BODIPY染色中および染色後の光曝露は避けてください。1 mg/mLのボディーをPBSで希釈しました(1:100)。 - 培養皿を生細胞ステーションの顕微鏡の溝に置き( 材料表を参照)、LDの動的変化を観察します。 開始シーケンスに従って生細胞ワークステーションの電源をオンにし、光を避けます。
- 電源、透過光源、顕微鏡電源、水銀ランプ蛍光光源、電荷結合素子(CCD)カメラ電源、コンピューターホスト電源、CO2バルブ、およびCO2インキュベーターをオンにします。
- ローディングプラットフォームの溝に蒸留水を追加し、通気孔を越えないようにします。
- コンピュータの電源を入れ、「NISエレメント」を実行します。まず、4倍対物レンズで適切な視野を見つけてから、40倍対物レンズに連続して調整します。E100を選択して顕微鏡でサンプルを観察し、L100を選択してコンピューターでサンプルをプレビューして撮影します。
注意: E100とL100は、生細胞ワークステーションの顕微鏡調整ボタンであり( 材料表を参照)、それぞれ接眼レンズとコンピューター画面を表します。 - 蛍光チャネル(例:Ph-40x、フルオレセインイソチオシアネート[FITC]、シャッター)や実験の予想撮影時間などのパラメータを設計します。2枚毎の撮影間隔を5分、合計撮影時間を6時間に含めて、撮影時間を 時間単位で設定します。
注意: 長時間の撮影では、パーフェクトフォーカスシステム(PFS)のフォーカス安定化機能を使用する必要があります。このためには、最初に視野と焦点距離を調整し、次にコンピューター画面で PFS をクリックして、最後にファインフォーカススパイラルを調整します。 - シングルチャンネルまたはオールの異なるチャンネルモードを選択し、別の視野を選択し、 プレビューをクリックし、視野を調整し、これらのパラメーターを設定し、[ 実行開始 ]をクリックして撮影を開始します。最初に5分間テストショットを撮ります。操作が正常になってから時間がかかる場合があります。
- 撮影後、[ファイル]>[ 名前を付けて保存]>[ファイルの種類>avi形式 ]を選択して、データを「avi」形式のビデオにエクスポートします。「.nd2」画像形式を使用して、データプログラムを保存し、写真をエクスポートします。
- マシンの電源を切るには、逆の順序で電源を切ります。
5.統計と結果分析
- 一元配置分散分析を使用してデータを分析します。結果を標準誤差の平均として報告±。
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Representative Results
細胞LDの染色を 図1に示す。赤い点は細胞LDを反映し、青い点は核を反映しています。LAの治療では、各写真のLDのサイズと数が異なることがわかります。
LA投与量の増加に伴い、LDの平均直径と数はLA濃度に応じて有意に増加する傾向を示しました(図2)。 図2Aに示されるように、細胞当たりのLDの数は、LAの異なる濃度と負の相関があった。細胞あたりのLD数の中央値は、100 μmol/L LA処理群で136でしたが、150 μmol/Lおよび200 μmol/L LA処理群でそれぞれ118および105に減少しました。対照群のLDの平均直径は0.72 μm、100 μmol/L LA処理群では1.38 μm、150 μmol/L LA処理群では1.51 μm、200 μmol/L LA処理群では1.64 μmでした(図2B)。
本研究では、直径<1μmのLDを小、直径>4μmのLDを大と定義した。LDの分布比率もLA濃度によって変化することがわかった, 図3に示すように;小さなLDの割合は減少し、大きなLDの割合は増加しました。小径LDの割合は100 μmol/L LAで43.33%,150 μmol/L LAで36.43%,200 μmol/L LAで29.8%であった。大径LDでは、200 μmol/L LAで6.11%、150 μmol/L LAで3.15%、100 μmol/L LAで1.48%と最も高い割合が高かった。200 μmol/L LA群では明らかに超大型LD(直径>5 μm)が観測され、100 μmol/L LA群(5.93%)や150 μmol/L LA群(4.82%)よりも高い約6.30%を占めた。その結果、LAの濃度が高いとLDのサイズが大きくなり、LDの数が減少することが示されました。一方、大きなLDの割合は増加し、小さなLDの割合は減少しました。
大きなLDは一般に小さなLDの融合によって形成され、ライブセルイメージングによるLD融合が観察され、これを証明しました(図4)。細胞を150 μmol/L LAで24時間処理し、BODIPYで染色しました。37°Cおよび5%CO2での通常の細胞増殖条件下で、細胞を生細胞ワークステーションで6時間連続的に観察した。画像は5分ごとにキャプチャされました。 図4に示すように、最初の15分間は、明らかに小さなLDがまだありました。その後、LDは20分からゆっくりと融合し始め、35分でより大きなLDに完全に融合しました。
図1:脂肪滴。 肝細胞細胞を異なる濃度のLAで培養し、オイルレッドOで染色した。赤色の点はオイルレッドで染色されたLDsを反射し、青紫色の点はヘマトキシリンで核を反射した。3枚のスライドガラスを、各処理における染色および画像化のために選択した。スケールバー = 10 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:LDの数とサイズ。 肝細胞細胞を0〜200 μmol/L LAの濃度勾配で培養し、オイルレッドOで染色した。 (A)細胞あたりのLDの平均数。27細胞中のLDの数を各群でカウントした。(B)細胞内のLDの平均直径。60個のLDのサイズを各グループでカウントしました。*p < 0.05;**p < 0.01;p < 0.001;p < 0.0001. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:LD比率。 異なる濃度のLAで培養した肝細胞細胞をオイルレッドOで染色し、異なるサイズのLDの割合比を計算した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:LD融合。 肝細胞細胞を150 μmol/L LAで培養し、BODIPY 493/503プローブでインキュベートしました。40倍の倍率の画像で6時間連続観察した後、蛍光および明視野下のLDを写真撮影した。画像は5分ごとにキャプチャされました。フュージョンは赤いボックスでマークされました。スケールバー = 20 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
病理学的状態に応じて、肝LDはその大きさおよび数において途方もない変化を受ける。LDは肝細胞細胞に広く存在し、肝臓の健康と病気に重要な役割を果たします18。LDの量とサイズは、LDの生合成に関する現在の研究の基礎です19。細胞および組織のLDのサイズと数は、エネルギーを貯蔵および放出する能力を反映しています。LDの動的変化は、脂質代謝活性の安定性を維持する20,21。LDの異常な蓄積は様々な病的状態で起こり、代謝性疾患の指標となり得る22,23。このプロトコルは、脂肪酸誘導肝細胞モデルにおけるLDのサイズと量を測定し、LDの融合をより効率的かつ直感的に観察するための正確な方法を提供します。
LDのサイズと動的変化を研究することは、脂質代謝障害に関連する疾患の発生と効果的な介入を理解するために非常に重要です。この実験では、重要なステップはLDのサイズと量の測定と分析でした。まず、異なる濃度のLAを使用して、肝細胞におけるLD蓄積を誘導しました。オレイン酸およびパルミチン酸などの他の脂肪酸もまた、肝細胞細胞におけるLD蓄積を引き起こすために使用され得る24、25。異なる濃度のLAによる治療の後、LDのサイズが用量依存的に増加したことがわかった。これらの結果から,オイルレッドO染色はLDsの直径を正確に測定していることが示された。また、LAの濃度が高いと、大型LDの割合が増加する可能性があることがわかり、小型LD同士が急速に融合していることが示唆されました。急速融合はLDの動的な変化の1つです。LDの急速な融合は、数分または数十秒以内に起こることがあり、主にその表面リン脂質およびタンパク質22,26によって媒介される。本研究では、生細胞ワークステーションによるBODIPY 493/503標識を使用して、LD融合が20分から35分まで明確に観察されました。画像間の撮影間隔は数秒から数分で設定でき、合計撮影時間は1時間から数日に設定できるため、異なるセルのLDの動的な変化を観察するのに便利です。
LDのサイズの染色分析に関しては、オイルレッドO染色は蛍光染色よりも便利で安価であり、LDの見かけのサイズを測定するためにより広く使用されています9。光に対して処理する必要はありません。さらに、機器要件を達成することは難しくなく、通常の光学顕微鏡の油レンズを写真観察に使用できます。この方法を使用すると、研究者は画像のいくつかのグループを選択して、LDのサイズと量をランダムに測定できます。操作が簡単で便利で、サンプルサイズを大きくして誤差を減らすことができます。さらに、測定および分析されたLDサイズに従って、異なるLDサイズの分布比を直接観察することができます。オイルレッドO染色後の上記の方法により統計解析を行うことができ、この方法は、脂質蓄積の影響を受ける広範囲の細胞を含む他の細胞にも適用することができる。初期の染色段階では、オイルレッドOは染色後の洗浄が容易ではなく、かなりの染料マガジンの残留物があることがわかりました。後の段階では、染料をろ過し、連続試験を通じて適切な染色時間を選択しました。染色後、洗浄時間を増やすと、上記の問題を回避できます。
BODIPY 493/503蛍光色素は、LD可視化のための最も一般的なプローブの1つです27。本研究では、LDグリーンをBODIPYで標識し、その過程を生細胞ワークステーションで観察することにより、LD融合を行った。ナイルレッドも中性脂質に一般的に使用される蛍光色素ですが、その広い励起バンド(450-560 nm)、非特異的染色、組織透過性の低さ、およびその他の欠点は、LD染色の結果にある程度影響を与える可能性があります。ナイル赤色蛍光染色と比較して、BODIPY 493/503の励起バンドはより狭く(460-490 nm)、さまざまな蛍光色素と共標識することができました11。第二に、BODIPYは植物色素の干渉を効果的に回避します28。最後に、BODIPYは組織の透過性が強く、環境極性に対する感度が低く、クエンチが容易ではありません12。そのため、LDの蛍光染色に広く使用されています。ただし、LD融合の分析には一定の制限があります。生細胞の連続観察画像を得るためには、レンズを動かすことができないため、視野内で局所的なLD融合しか観察できず、細胞全体のLD融合効率をより正確に分析することはできません。
結論として、本研究はLDの形態とサイズ分析のための簡便で再現性のある方法を提供し、細胞脂質代謝を研究する際のLD分析に広く適用することができます。この研究はまた、LD融合のプロセスを証明し、将来のLDのさらなる研究の基礎を築きました。
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Disclosures
著者は、利益相反がないことを宣言します。
Acknowledgments
本研究は、中国国家自然科学基金会(U1904116)の共同支援を受けて行われました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin | Gibco | 25200072 | reagent |
| 4% paraformaldehyde | Solarbio | P1110 | reagent |
| BODIPY 493/503 | invitrogen | 2295015 | reagent |
| Cedar oil | Solarbio | C7140 | reagent |
| cell counting chamber | equipment | ||
| cell culture dish | Corning | 353002 | material |
| cell sens software | Olympus IX73 | software | |
| Centrifuge | Eppendorf | equipment | |
| DMEM | HyClone | SH30022.01 | reagent |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 2492319 | reagent |
| hematoxylin | DingGuo | AR0712 | reagent |
| Image view | image analysis sodtware | ||
| linoleic acid | Solarbio | SL8520 | reagent |
| Live Cell Station | Nikon A1 HD25 | equipment | |
| NIS-Elements | Nikon | software | |
| oil red O | Solarbio | G1260 | reagent |
| optical microscope | Olympus IX73 | equipment | |
| Penicillin & Streptomycin 100× | NCM Biotech | CLOOC5 | reagent |
| Phosphate Buffered Saline | HyClone | SH30258.01 | reagent |
| Pipette | Eppendorf | equipment | |
| Sealing agent | Solarbio | S2150 | reagent |
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