Summary
본 프로토콜은 오일 레드 O를 사용하여 지질 방울(LD)을 염색하고, 지방산 유도 지방 간세포 모델에서 LD의 크기와 수를 계산하고, BODIPY 493/503을 사용하여 작은 LD가 큰 LD로 융합되는 과정을 관찰하는 방법을 설명합니다.
Abstract
지질 방울(LD)은 세포의 지질 대사와 중성 지질 저장에 중요한 역할을 하는 세포 소기관입니다. 그들은 비만, 지방간 질환 및 당뇨병과 같은 다양한 대사 질환과 관련이 있습니다. 간세포에서 LD의 크기와 수는 지방간 질환의 징후입니다. 또한, 산화 스트레스 반응, 세포 자가포식 및 세포자멸사는 종종 LD의 크기와 수의 변화를 동반합니다. 결과적으로, LD의 크기와 양은 LD 생물 발생의 메커니즘에 관한 현재 연구의 기초입니다. 여기에서는 지방산 유발 소 간 세포에서 오일 레드 O를 사용하여 LD를 염색하고 LD의 크기와 수를 조사하는 방법을 설명합니다. LD의 크기 분포는 통계적으로 분석됩니다. 작은 LD가 큰 LD로 융합되는 과정은 라이브 셀 이미징 시스템에서도 관찰됩니다. 현재의 연구는 다양한 생리적 조건에서 LD의 크기 변화 추세를 직접 관찰할 수 있는 방법을 제공합니다.
Introduction
간세포에 지질 액적(LD) 축적은 간 섬유증 및 간세포 암종으로 진행될 수 있는 비알코올성 지방간 질환(NAFLD)의 전형적인 특징입니다. 지방간 질환의 가장 초기 증상은 간세포1의 세포질에 LD가 축적되는 것을 특징으로하는 지방증이라는 것이 밝혀졌습니다. 간 지방증은 항상 LD의 수 증가 및/또는 크기 증가와 관련이 있다2. LD는 중성지방(TG)을 핵심으로 하는 소포체(ER)에서 생성되는 것으로 생각되며, 단백질과 인지질로 둘러싸여 있다3. LD는 TG 저장을 담당하는 세포내 소기관으로서 크기, 수, 지질 조성, 단백질 및 다른 소기관과의 상호 작용과 관련하여 다양한 특징을 나타내며, 이 모든 것이 세포 에너지 항상성에 영향을 미칩니다4. TG 수준은 LD의 크기와 양의 상관관계가 있으며, 세포 내 TG 함량이 높을수록 더 큰 LD를 형성할 수 있다5. LD는 TG의 국소 합성, ER에서의 지질 혼입 및 다중 LD의 융합을 통해 크기가 증가한다6. 큰 LD를 포함하는 세포(지방세포, 간세포 등)는 LD 융합에 의해 효율적으로 지질 저장을 증가시키는 특별한 메커니즘을 가지고 있습니다. LD의 동적 변화는 세포의 다양한 에너지 대사 상태를 반영합니다. 건강한 세포와 비정상 세포에서 다양한 간 LD를 관찰하고 분석할 수 있는 방법론을 개발하는 것이 중요합니다.
LD의 주요 비형광 염료는 수단 블랙 B와 오일 레드 O입니다. 수단 블랙 B는 중성 지질, 인지질 및 스테로이드를 염색합니다7. 오일 레드 O는 주로 골격근, 심근 세포, 간 조직, 지방 세포 등의 LD를 염색하는 데 사용됩니다8., 생쥐와 인간의 간 지방증을 정량적으로 검출하기위한 표준 도구로 간주됩니다9. LD의 동적 변화는 주로 형광 염색에 의해 수행됩니다. 나일 레드와 BODIPY는 모두 일반적으로 사용되는 형광 지질 염료10,11입니다. 나일 레드와 비교하여 BODIPY는 조직 투과성이 더 강하고 LD와 더 잘 결합합니다12. BODIPY로 표지된 LD는 살아있는 세포를 염색하고 다른 세포 기관과 공동국소화하는 데 사용할 수 있다13.
지방간 질환의 발병률은 반추 동물에서 단위 동물보다 유의하게 높다14. 전환 기간 동안 젖소는 부정적인 에너지 균형 상태를 경험합니다3. 다량의 비에스테르화 지방산(팔미트산, 올레산, 리놀레산 등)이 소 간세포에서 TG로 합성되어 간 기능 이상을 유발하고 유제품의 품질과 생산 효율성을 크게 저하시킨다15. 본 연구는 LD의 크기와 수를 분석하고 LD 융합 역학을 모니터링하는 프로토콜을 제공하는 것을 목표로 합니다. 우리는 간세포(16 )에 서로 다른 농도의 리놀레산(LA)을 첨가하여 LD 형성 모델을 구성하고, LD를 오일 레드 O로 염색하여 공정 중 LD의 크기와 수의 변화를 관찰했습니다. 또한, LD의 빠른 융합 과정은 BODIPY 493/503으로 염색하여 관찰되었습니다.
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Protocol
모든 절차는 허난농업대학교(중국 허난성) 동물관리위원회의 윤리적 기준에 따라 승인되고 수행되었습니다.
1. 소 간세포 배양
- 1차 간세포17 을 해동하고 실온에서 4분 동안 400 x g 의 원심분리를 실시한다.
참고: 일차 간세포 세포는 이전에 발표된 보고서17에 따라 배양 및 유지되었다. - 냉동 보관 용액을 피펫으로 버리고 10% 소 태아 혈청(FBS)과 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)이 포함된 배지 1mL로 현탁합니다. 다음으로, 세포 계수 챔버를 사용하여 밀리리터당 세포 수를 계산한 다음 위의 세포 현탁액의 농도를 계산하고 세포 농도를 1 x 107 cells/mL로 조정합니다.
- 상기 배지 3 mL가 들어 있는 60 mm 세포 배양 접시에 세포 현탁액을 넣는다. 세포를 배양하고, 37°C 및 5%CO2 에서 24시간 동안 인큐베이션한다.
- 세포가 80%까지 성장하면 배지를 버리고 인산염 완충 식염수(PBS)로 헹군 다음 750μL의 0.25% 트립신을 첨가하여 세포를 소화합니다. 세포를 37°C에서 3분 동안 배양한 다음, 동량의 10% FBS로 중화시킨다. 세포 현탁액을 수집하여 실온에서 4분 동안 200 x g 에서 원심분리한다.
2. 오일 레드 O 염색
- 10% FBS 및 DMEM을 포함하는 배양 배지 800μL를 유리 커버슬립이 포함된 24웰 세포 배양 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 50 μL의 세포 현탁액(1.3단계에서 얻음)을 취하여 950 μL의 PBS에 첨가하여 혼합합니다. 세포 계수 챔버를 사용하여 밀리리터당 세포 수를 계산한 다음 위의 세포 현탁액의 농도를 계산합니다. 마지막으로, 각 웰에서 세포 농도를 4 x 104/mL로 조정하고 37°C 및 5%CO2 에서 24시간 동안 배양합니다.
- 24시간 후, 배양액을 버리고 PBS로 세척한다. 1mg/mL 소혈청알부민(BSA)이 포함된 DMEM 유도 배지 800μL로 현탁합니다.
- 총 100 μL의 LA ( 재료 표 참조)를 900 μL의 무수 에탄올에 녹이고 표준 용액 (100 mmol / L)을 준비합니다. 0 μmol/L, 100 μmol/L, 150 μmol/L 및 200 μmol/L LA의 그래디언트를 24웰 플레이트에 추가합니다. 각 치료를 네 번 반복하십시오. 37°C 및 5%CO2 에서 24시간 동안 배양합니다.
- 배양액을 제거하고 PBS로 세포를 3회 세척한다. 400μL의 4% 파라포름알데히드로 20분 동안 고정합니다. 정착액을 버리고 PBS로 세 번 세척하십시오.
- 60% 이소프로필 알코올로 세포를 5분 동안 배양한 다음 버립니다. 갓 준비한 오일 레드 O 작업 용액( 재료 표 참조)(오일 레드 O:물의 3:2 비율)을 20-30분 동안 추가하고 염색 용액을 버립니다. 과량의 염료 용액이 없을 때까지 PBS로 세포를 2 내지 5회 세척한다.
- 300 μL의 헤마톡실린 염색 용액(헤마톡실린:물 비율 1:10)을 넣고 1-2분 동안 핵을 다시 염색합니다. 염료 용액을 버리고 PBS로 세포를 2-5회 세척한다. 24웰 플레이트에서 유리 커버슬립을 꺼내 10μL의 정제 실란트( 재료 표 참조)를 슬라이드에 떨어뜨린 후 현미경 슬라이드(세포가 아래를 향하도록 한 면)에 놓습니다.
- 밀봉 후 광학 현미경의 오일 렌즈로 세포의 LD를 관찰하고 이미지화합니다( 재료 표 참조). cellSens 소프트웨어로 LD의 직경을 측정하고 LD의 수와 크기를 분석합니다.
3. LD의 크기 및 수 측정
- 이미지 캡처: 컴퓨터와 현미경 스위치를 연속적으로 켜고 슬라이드를 로딩 플랫폼에 놓고 이미지 분석 소프트웨어( 재료 표 참조)를 열고 컴퓨터를 연결하여 이미지를 봅니다.
- 저전력에서 이미지를 찾고 이미징 슬라이드에 적절한 양의 삼나무 오일을 떨어 뜨립니다. 관찰 계수를 100x로 조정하고, 자동 노출을 설정하고, 적절한 화각을 조정하여 이미지를 캡처합니다. 이미징을 위해 각 그룹에 대해 3개의 염색된 세포 슬라이드를 선택합니다.
- 직경 측정: 각 이미지에 대해 60LD를 무작위로 선택하여 직경을 측정합니다. 각 이미지를 측정한 후 이미지를 저장하고 측정 결과를 표로 출력하여 LD의 평균 크기 및 분포 비율을 분석합니다.
- 수량 측정: 염색 및 촬영된 각 슬라이드에 대해 3개의 이미지를 선택하고 각 사진에서 수량 측정을 위해 3개의 셀을 무작위로 선택합니다. 셀 주변의 LD 수를 계산 및 분석하고 셀의 평균 LD 수를 계산합니다.
4. LD 융합의 동적 관찰
- 1.1-1.3단계에서 설명한 대로 세포 배양 단계를 따릅니다. 세포가 80%까지 성장하면 배지를 버리고 PBS로 헹구고 750μL의 트립신으로 3분 동안 분해합니다. 다음으로, 배지 750 μL를 첨가하고, 실온에서 4분 동안 200 x g 에서 원심분리하고, 상청액을 버린다.
- 1mL의 배양 배지에 세포를 현탁하고, 계수하고, 35mm 접시에서 세포 농도를 5 x 105 cells/mL로 조정합니다. 37°C 및 5%CO2 에서 24시간 동안 배양한다.
- 세포가 80%로 성장하면 배지를 24시간 동안 DMEM + 150μmol/L LA로 변경하고 37°C 및 5%CO2 의 인큐베이터에서 배양을 계속하여 LD를 축적합니다.
- 24시간 후, 배양액을 제거한다. 부착 세포를 PBS로 세척하고 10μg/mL BODIPY 493/503 중성 형광 프로브( 재료 표 참조)와 함께 어두운 곳에서 30분 동안 배양합니다. 배양 후 배양 접시에 있는 세포를 PBS로 3회 세척하고 DMEM + 150 μmol/L LA를 첨가한다.
참고: 10μg/mL BODIPY 염색 중 및 후에 빛 노출을 피하십시오. 1mg/mL BODIPY를 PBS(1:100)로 희석했습니다. - 살아있는 세포 스테이션의 현미경 홈에 배양 접시를 놓고( 재료 표 참조) LD의 동적 변화를 관찰합니다. 시작 순서에 따라 살아있는 세포 워크스테이션의 전원을 켜고 빛을 피하십시오.
- 전원, 투과 광원, 현미경 전원, 수은등 형광등, CCD(전하 결합 소자) 카메라 전원, 컴퓨터 호스트 전원, CO2 밸브 및CO2 인큐베이터를 켭니다.
- 로딩 플랫폼의 홈에 증류수를 추가하여 통풍구를 넘지 않도록 합니다.
- 컴퓨터를 켜고 "NIS-Elements"를 실행합니다. 먼저 4x 대물 렌즈에서 적절한 시야를 찾은 다음 40x 대물 렌즈로 연속적으로 조정합니다. 현미경으로 샘플을 관찰하려면 E100을 선택하고 컴퓨터에서 샘플을 미리 보고 사진을 찍으려면 L100을 선택합니다.
알림: E100 및 L100은 각각 접안렌즈와 컴퓨터 화면을 나타내는 Living Cell 워크스테이션의 현미경 조정 버튼( 재료 표 참조)입니다. - 형광 채널(예: Ph-40x, 플루오레세인 이소티오시아네이트[FITC], 셔터) 및 실험을 위한 예상 촬영 시간과 같은 매개변수를 설계합니다. 두 이미지 사이의 촬영 간격 시간을 5분으로 설정하고 총 촬영 시간을 6시간으로 설정합니다.
참고: 장시간 촬영하려면 PFS(Perfect Focus System) 초점 안정화 기능을 사용해야 합니다. 이를 위해 먼저 시야와 초점 거리를 조정한 다음 컴퓨터 화면에서 PFS 를 클릭하고 마지막으로 미세 초점 나선을 조정합니다. - 다른 채널 모드, 단일 채널 또는 모두를 선택하고, 다른 시야를 선택하고, 미리보기를 클릭하고, 시야를 조정하고, 이러한 매개변수를 설정하고, 실행 시작을 클릭하여 촬영을 시작합니다. 먼저 5분 동안 테스트 샷을 합니다. 수술이 정상이 된 후 시간이 오래 걸릴 수 있습니다.
- 촬영이 끝나면 파일 > 다른 이름으로 저장 > 저장 유형 > avi 형식을 선택하여 데이터를 'avi' 형식의 비디오로 내보냅니다. '.nd2' 이미지 형식을 사용하여 데이터 프로그램을 저장하고 사진을 내보냅니다.
- 기기의 전원을 끄려면 역순으로 끄십시오.
5. 통계 및 결과 분석
- 일원 분산 분석을 사용하여 데이터를 분석합니다. 결과를 평균 ± 표준 오차로 보고합니다.
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Representative Results
세포 LD의 염색은 도 1에 나타내었다. 빨간색 점은 세포 LD를 나타내고 파란색 점은 핵을 나타냅니다. 각 사진의 LD의 크기와 수는 LA의 처리에 따라 다르다는 것을 알 수 있습니다.
LA 투여량의 증가에 따라, LD의 평균 직경 및 수는 LA 농도에 따라 유의하게 증가하는 경향을 보였다(도 2). 도 2A에 나타낸 바와 같이, 세포당 LD의 수는 LA의 상이한 농도와 음의 상관관계가 있었다. 세포당 중앙값 LD 수는 100 μmol/L LA 처리군의 경우 136이었고, 150 μmol/L 및 200 μmol/L LA 처리군의 경우 각각 118 및 105로 감소했습니다. 대조군의 LD의 평균 직경은 0.72 μm, 100 μmol/L LA 처리군의 경우 1.38 μm, 150 μmol/L LA 처리군의 경우 1.51 μm, 200 μmol/L LA 처리군의 경우 1.64 μm였다(그림 2B).
본 연구에서는 직경이 <1μm인 LD를 작게, 직경이 >4μm인 LD를 큰 LD로 정의하였다. LD의 분포 비율도 그림 3과 같이 LA 농도에 따라 변하는 것으로 나타났습니다. 작은 LD의 비율이 감소하고 큰 LD의 비율이 증가했습니다. 소구경 LD의 비율은 100 μmol/L LA에서 43.33%, 150 μmol/L LA에서 36.43%, 200 μmol/L LA에서 29.8%였다. 대구경 LD의 경우 가장 높은 비율은 200μmol/L LA에서 6.11%였으며, 150 및 100μmol/L LA에서 각각 3.15% 및 1.48%였습니다. 200μmol/L LA 그룹에서는 초대형 LD(직경 >5μm)가 분명히 관찰되어 약 6.30%를 차지하여 100μmol/L LA(5.93%) 및 150μmol/L LA(4.82%) 그룹보다 높았다. 그 결과 LA의 농도가 높을수록 LD의 크기가 증가하고 LD의 수가 감소하는 것으로 나타났습니다. 한편, 큰 LD의 비율은 증가했고, 작은 LD의 비율은 감소했다.
큰 LD는 일반적으로 작은 LD의 융합을 통해 형성되었다. 이를 증명하기 위해 생세포 이미징을 통한 LD 융합이 관찰되었다(그림 4). 세포를 24시간 동안 150μmol/L LA로 처리하고 BODIPY로 염색했습니다. 정상 세포 성장 조건 하에서 37°C 및 5%CO2에서, 세포를 라이브 셀 워크스테이션으로 6시간 동안 연속적으로 관찰하였다. 이미지는 5분마다 캡처되었습니다. 그림 4에서 볼 수 있듯이 처음 15분 동안 여전히 더 작은 LD가 있었습니다. 그런 다음 LD는 20분부터 천천히 융합되기 시작했고 35분에는 더 큰 LD로 완전히 융합되었습니다.
그림 1: 지질 비말. 간세포 세포를 상이한 농도의 LA에서 배양하고 오일 레드 O로 염색하였다. 빨간색 점은 오일 레드로 염색 된 LD를 반사하고 청자색 점은 헤마 톡 실린으로 핵을 반사합니다. 각 처리에서 염색 및 이미징을 위해 3개의 유리 슬라이드를 선택했습니다. 스케일 바 = 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: LD의 수와 크기. 간세포 세포는 0 내지 200 μmol/L LA의 농도 구배에서 배양되고 오일 레드 O로 염색되었다. (A) 세포당 평균 LD의 수. 27개 세포에서 LD의 수를 각 그룹에서 계수하였다. (B) 세포에서 LD의 평균 직경. 각 그룹에서 60LD의 크기를 계산했습니다. *p < 0.05; **p < 0.01; p < 0.001; p < 0.0001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: LD 비율. 상이한 농도의 LA에서 배양된 간세포 세포를 오일 레드 O로 염색하여 상이한 크기의 LD의 비율 비율을 계산하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: LD 융합. 간세포 세포를 150 μmol/L LA로 배양하고 BODIPY 493/503 프로브와 함께 배양했습니다. 40x 배율 이미지 하에서 6시간 동안 연속 관찰한 후, 형광 및 명시야 하의 LD를 촬영하였다. 이미지는 5분마다 캡처되었습니다. Fusion은 빨간색 상자로 표시되었습니다. 스케일 바 = 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
병리학 적 상태에 따라 간 LD는 크기와 수에 엄청난 변화를 겪습니다. LD는 간세포 세포에 널리 존재하며 간 건강과 질병에 중요한 역할을 한다18. LD의 양과 크기는 LD의 생물 발생에 대한 현재 연구의 기초입니다19. 세포와 조직의 LD의 크기와 수는 에너지를 저장하고 방출하는 능력을 반영합니다. LD의 동적 변화는 지질 대사 활동의 안정성을 유지합니다20,21. LD의 비정상적인 축적은 다양한 병리학 적 상태에서 발생하며 대사 질환의 지표가 될 수 있습니다22,23. 이 프로토콜은 지방산 유도 간세포 모델에서 LD의 크기와 양을 측정하고 LD의 융합을 보다 효율적이고 직관적으로 관찰하는 정확한 방법을 제공합니다.
LD의 크기와 동적 변화를 연구하는 것은 지질 대사 장애 및 효과적인 개입과 관련된 질병의 발생을 이해하는 데 매우 중요합니다. 이 실험에서 핵심 단계는 LD의 크기와 양을 측정하고 분석하는 것이었습니다. 먼저, 간세포에서 LD 축적을 유도하기 위해 상이한 농도의 LA를 사용하였다. 올레에이트 및 팔미테이트와 같은 다른 지방산도 간세포 세포에서 LD 축적을 유발하는 데 사용될 수 있습니다24,25. 상이한 농도의 LA로 처리한 후, LDs의 크기가 용량 의존적으로 증가한 것으로 나타났다. 이러한 결과는 오일 레드 O 염색이 LDs의 직경을 정확하게 측정했음을 나타낸다. 또한 LA의 농도가 높을수록 대형 LD의 비율이 증가할 수 있는 것으로 나타났으며, 이는 작은 LD가 서로 빠르게 융합됨을 시사합니다. 급속 융합은 LD의 동적 변화 중 하나입니다. LD 급속 융합은 몇 분 또는 수십 초 내에 발생할 수 있으며 주로 표면 인지질과 단백질22,26에 의해 매개됩니다. 본 연구에서, LD 융합은 살아있는 세포 워크스테이션에 의한 BODIPY 493/503 표지를 사용하여 20분에서 35분 사이에 명확하게 관찰되었다. 이미지 사이의 촬영 간격은 몇 초에서 몇 분까지 설정할 수 있으며 총 촬영 시간은 1시간에서 며칠까지 설정할 수 있어 서로 다른 셀에서 LD의 동적 변화를 편리하게 관찰할 수 있습니다.
LD의 크기에 대한 염색 분석의 관점에서, 오일 레드 O 염색은 형광 염색보다 더 편리하고 저렴하며,LDs9의 겉보기 크기를 측정하는 데 더 널리 사용된다. 빛에 대해 처리 할 필요가 없습니다. 또한 장비 요구 사항을 달성하기 어렵지 않으며 일반 광학 현미경의 오일 렌즈를 사용하여 사진 관찰을 할 수 있습니다. 이 방법을 사용하여 연구원은 여러 이미지 그룹을 선택하여 LD의 크기와 양을 무작위로 측정할 수 있습니다. 작동이 간단하고 편리하며 샘플 크기를 늘리고 오류를 줄일 수 있습니다. 또한, 측정 및 분석된 LD 크기에 따라 다양한 LD 크기의 분포 비율을 직접 관찰할 수 있습니다. 통계 분석은 오일 레드 O 염색 후 위의 방법으로 수행할 수 있으며, 이 방법은 지질 축적에 영향을 받는 광범위한 세포를 포함한 다른 세포에도 적용할 수 있습니다. 초기 염색 단계에서는 오일 레드 O가 염색 후 세척이 쉽지 않고 염료 매거진 잔류 물이 상당하다는 것이 밝혀졌습니다. 후기 단계에서는 염료를 여과하고 연속 테스트를 통해 적절한 염색 시간을 선택했습니다. 염색 후 청소 시간을 늘리면 위의 문제를 피할 수 있습니다.
BODIPY 493/503 형광 염료는 LD 시각화를 위한 가장 일반적인 프로브중 하나입니다 27. 이 연구에서는 LD 녹색을 BODIPY로 표지하고 살아있는 세포 워크스테이션으로 과정을 관찰하여 LD 융합을 수행했습니다. 나일 레드는 또한 중성 지질에 일반적으로 사용되는 형광 염료이지만 넓은 여기 대역 (450-560 nm), 비특이적 염색, 열악한 조직 투과성 및 기타 단점이 LD 염색 결과에 어느 정도 영향을 미칠 수 있습니다. 나일 적색 형광 염색과 비교했을 때, BODIPY 493/503의 여기 밴드는 더 좁았으며(460-490 nm), 다양한 형광 염료11로 공동 표지될 수 있었다. 둘째, BODIPY는 식물 안료28의 간섭을 효과적으로 피한다. 마지막으로, BODIPY는 조직 투과성이 강하고 환경 극성에 대한 민감도가 낮으며 담금질이 쉽지 않습니다12; 따라서 LD의 형광 염색에 널리 사용됩니다. 그러나, LD 융합의 분석에는 일정한 한계가 있다. 살아있는 세포의 지속적인 관찰 이미지를 얻기 위해 수정체를 움직일 수 없으므로 비전에서 국소 LD 융합 만 관찰 할 수 있으며 전체 세포의 LD 융합 효율을보다 정확하게 분석 할 수 없습니다.
결론적으로, 본 연구는 LD 형태 및 크기 분석을 위한 간단하고 재현 가능한 방법을 제공하며, 이는 세포 지질 대사 연구에서 LD 분석에 널리 적용될 수 있습니다. 이 연구는 또한 LD 융합 과정을 입증하여 향후 LD에 대한 추가 연구의 토대를 마련했습니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (U1904116)이 공동으로 지원했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin | Gibco | 25200072 | reagent |
| 4% paraformaldehyde | Solarbio | P1110 | reagent |
| BODIPY 493/503 | invitrogen | 2295015 | reagent |
| Cedar oil | Solarbio | C7140 | reagent |
| cell counting chamber | equipment | ||
| cell culture dish | Corning | 353002 | material |
| cell sens software | Olympus IX73 | software | |
| Centrifuge | Eppendorf | equipment | |
| DMEM | HyClone | SH30022.01 | reagent |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 2492319 | reagent |
| hematoxylin | DingGuo | AR0712 | reagent |
| Image view | image analysis sodtware | ||
| linoleic acid | Solarbio | SL8520 | reagent |
| Live Cell Station | Nikon A1 HD25 | equipment | |
| NIS-Elements | Nikon | software | |
| oil red O | Solarbio | G1260 | reagent |
| optical microscope | Olympus IX73 | equipment | |
| Penicillin & Streptomycin 100× | NCM Biotech | CLOOC5 | reagent |
| Phosphate Buffered Saline | HyClone | SH30258.01 | reagent |
| Pipette | Eppendorf | equipment | |
| Sealing agent | Solarbio | S2150 | reagent |
References
- Fujimoto, T., Parton, R. G. Not just fat: the structure and function of the lipid droplet. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (3), 004838 (2011).
- Grasselli, E., et al. Models of non-alcoholic fatty liver disease and potential translational value: The effects of 3,5-L-diiodothyronine. Annals of Hepatology. 16 (5), 707-719 (2017).
- Herdt, T. H. Ruminant adaptation to negative energy balance: Influences on the etiology of ketosis and fatty liver. Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice. 16 (2), 215-230 (2000).
- Pino-de la Fuente, F., et al. Exercise regulation of hepatic lipid droplet metabolism. Life Sciences. 298, 120522 (2022).
- O'Connor, D., Byrne, A., Berselli, G. B., Long, C., Keyes, T. E. Mega-stokes pyrene ceramide conjugates for STED imaging of lipid droplets in live cells. Analyst. 144 (5), 1608-1621 (2019).
- Gao, G., et al. Control of lipid droplet fusion and growth by CIDE family proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA). Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (10), 1197-1204 (2017).
- Tütüncü Konyar, S. Dynamic changes in insoluble polysaccharides and neutral lipids in the developing anthers of an endangered plant species, Pancratium maritimum. Plant Systematics and Evolution. 304, 397-414 (2018).
- Spangenburg, E. E., Pratt, S. J. P., Wohlers, L. M., Lovering, R. M. Use of BODIPY (493/503) to visualize intramuscular lipid droplets in skeletal muscle. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 598358 (2011).
- Mehlem, A., Hagberg, C. E., Muhl, L., Eriksson, U., Falkevall, A. Imaging of neutral lipids by oil red O for analyzing the metabolic status in health and disease. Nature Protocols. 8 (6), 1149-1154 (2013).
- Diaz, G., Melis, M., Batetta, B., Angius, F., Falchi, A. M. Hydrophobic characterization of intracellular lipids in situ by Nile Red red/yellow emission ratio. Micron. 39 (7), 819-824 (2008).
- Duan, X., et al. The synthesis of polarity-sensitive fluorescent dyes based on the BODIPY chromophore. Dyes and Pigments. 89 (3), 217-222 (2011).
- Rumin, J., et al. The use of fluorescent Nile red and BODIPY for lipid measurement in microalgae. Biotechnology for Biofuels. 8, 42 (2015).
- Fam, T. K., Klymchenko, A. S., Collot, M. Recent advances in fluorescent probes for lipid droplets. Materials. 11 (9), 1768 (2018).
- Raboisson, D., Mounié, M., Maigné, É Diseases, reproductive performance, and changes in milk production associated with subclinical ketosis in dairy cows: A meta-analysis and review. Journal of Dairy Science. 97 (12), 7547-7563 (2014).
- Ospina, P. A., Nydam, D. V., Stokol, T., Overton, T. R. Associations of elevated nonesterified fatty acids and β-hydroxybutyrate concentrations with early lactation reproductive performance and milk production in transition dairy cattle in the northeastern United States. Journal of Dairy Science. 93 (4), 1596-1603 (2010).
- Campos-Espinosa, A., Guzmán, C. A model of experimental steatosis in vitro: hepatocyte cell culture in lipid overload-conditioned medium. Journal of Visualized Experiments. (171), e62543 (2021).
- Liu, L., et al. Effects of nonesterified fatty acids on the synthesis and assembly of very low density lipoprotein in bovine hepatocytes in vitro. Journal of Dairy Science. 97 (3), 1328-1335 (2014).
- Wang, L., Liu, J. Y., Miao, Z. J., Pan, Q. W., Cao, W. L. Lipid droplets and their interactions with other organelles in liver diseases. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 133, 105937 (2021).
- Sanjabi, B., et al. Lipid droplets hypertrophy: a crucial determining factor in insulin regulation by adipocytes. Scientific Reports. 5, 8816 (2015).
- Saponaro, C., Gaggini, M., Carli, F., Gastaldelli, A. The subtle balance between lipolysis and lipogenesis: a critical point in metabolic homeostasis. Nutrients. 7 (11), 9453-9474 (2015).
- Yang, A., Mottillo, E. P. Adipocyte lipolysis: from molecular mechanisms of regulation to disease and therapeutics. Biochemical Journal. 477 (5), 985-1008 (2020).
- Gluchowski, N. L., Becuwe, M., Walther, T. C., Farese, R. V. Lipid droplets and liver disease: from basic biology to clinical implications. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 14 (6), 343-355 (2017).
- Meex, R. C. R., Schrauwen, P., Hesselink, M. K. C. Modulation of myocellular fat stores: lipid droplet dynamics in health and disease. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 297 (4), 913-924 (2009).
- Sarnyai, F., et al. Effect of cis-and trans-monounsaturated fatty acids on palmitate toxicity and on palmitate-induced accumulation of ceramides and diglycerides. International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), 2626 (2020).
- Ricchi, M., et al. Differential effect of oleic and palmitic acid on lipid accumulation and apoptosis in cultured hepatocytes. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 24 (5), 830-840 (2009).
- Fei, W., et al. A role for phosphatidic acid in the formation of "supersized" lipid droplets. PLoS Genetics. 7 (7), e1002201 (2011).
- Kowada, T., Maeda, H., Kikuchi, K. BODIPY-based probes for the fluorescence imaging of biomolecules in living cells. Chemical Society Reviews. 44 (14), 4953-4972 (2015).
- Wang, J., et al. Application of the fluorescent dye BODIPY in the study of lipid dynamics of the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. Molecules. 23 (7), 1594 (2018).
