Summary
O presente protocolo descreve como usar óleo vermelho O para tingir gotículas lipídicas (DLs), calcular o tamanho e o número de DLs em um modelo de hepatócitos gordurosos induzidos por ácidos graxos e usar BODIPY 493/503 para observar o processo de fusão de pequenas LDs em grandes LDs por imagem de células vivas.
Abstract
As gotículas lipídicas (DLs) são organelas que desempenham um papel importante no metabolismo lipídico e no armazenamento neutro de lipídios nas células. Eles estão associados a uma variedade de doenças metabólicas, como obesidade, doença hepática gordurosa e diabetes. Nas células hepáticas, os tamanhos e o número de DLs são sinais de doença hepática gordurosa. Além disso, a reação de estresse oxidativo, a autofagia celular e a apoptose são frequentemente acompanhadas por mudanças nos tamanhos e números de DLs. Como resultado, as dimensões e a quantidade de DLs são a base da pesquisa atual sobre o mecanismo de biogênese da DL. Aqui, em células hepáticas bovinas induzidas por ácidos graxos, descrevemos como usar o óleo vermelho O para corar LDs e investigar os tamanhos e números de LDs. A distribuição de tamanho dos GDs é analisada estatisticamente. O processo de fusão de pequenos LDs em grandes LDs também é observado por um sistema de imagem de células vivas. O presente trabalho fornece uma maneira de observar diretamente a tendência de mudança de tamanho dos DLs sob diferentes condições fisiológicas.
Introduction
O acúmulo de gotículas lipídicas (DL) nos hepatócitos é a característica típica da doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA), que pode evoluir para fibrose hepática e carcinoma hepatocelular. Verificou-se que a manifestação mais precoce da doença hepática gordurosa é a esteatose, caracterizada pelo acúmulo de DL no citoplasma do hepatócito1. A esteatose hepática está invariavelmente associada ao aumento do número e/ou expansão do tamanho dosDLs2. Acredita-se que os LDs sejam gerados a partir do retículo endoplasmático (RE), consistindo de triglicerídeos (TG) como núcleo, e são circundados por proteínas e fosfolipídios3. Como organela subcelular responsável pelo armazenamento de TG, os LDs apresentam características diferentes quanto ao tamanho, número, composição lipídica, proteínas e interação com outras organelas, o que afeta a homeostase energética celular4. O nível de TG correlaciona-se positivamente com o tamanho dos GDs, e um maior conteúdo intracelular de TG poderia formar maiores DLs5. Os LDs aumentam de tamanho através da síntese local de TG, incorporação lipídica no RE e fusão de múltiplos DLs6. As células (adipócitos, hepatócitos, etc.) que contêm grandes DLs têm um mecanismo especial para aumentar eficientemente o armazenamento de lipídios por fusão de DL. As mudanças dinâmicas dos LDs refletem os diferentes estados do metabolismo energético da célula. É crucial desenvolver metodologias que permitam a observação e análise das várias DLs hepáticas em células saudáveis e anormais.
Os principais corantes não fluorescentes para LDs são Sudan Black B e oil red O. Sudan Black B cora lipídios neutros, fosfolipídios e esteroides7. O óleo vermelho O é usado principalmente para coloração de LDs de músculo esquelético, cardiomiócitos, tecido hepático, células adiposas, etc8., sendo considerado uma ferramenta padrão para a detecção quantitativa de esteatose hepática em camundongos e humanos9. A mudança dinâmica dos LDs é realizada principalmente pelo tingimento por fluorescência. O vermelho do Nilo e o BODIPY são corantes lipídicos fluorescentescomumente utilizados 10,11. Comparado com o vermelho do Nilo, o BODIPY tem maior permeabilidade tecidual e liga-se melhor aos DLs12. LDs marcadas com BODIPY podem ser usadas para coloração de células vivas e colocalização com outras organelas13.
A incidência de doença hepática gordurosa é significativamente maior em ruminantes do que em monogástricos14. Durante o período de transição, as vacas leiteiras experimentam um estado de balanço energético negativo3. Grandes quantidades de ácidos graxos não esterificados (ácido palmítico, ácido oleico, ácido linoleico, etc.) são sintetizados em TGs em hepatócitos bovinos, o que leva a anormalidades funcionais hepáticas e reduz sobremaneira a qualidade dos produtos lácteos e a eficiência produtiva15. O presente estudo tem como objetivo fornecer um protocolo para analisar o tamanho e o número de DLs, bem como monitorar a dinâmica de fusão de DL. Construímos um modelo de formação de LD adicionando diferentes concentrações de ácido linoleico (LA) em hepatócitos16 e observamos as mudanças no tamanho e no número de LDs durante o processo pela coloração de LDs com óleo vermelho O. Além disso, o processo de fusão rápida dos LDs também foi observado pela coloração com BODIPY 493/503.
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Protocol
Todos os procedimentos foram aprovados e realizados de acordo com os padrões éticos do Comitê de Cuidados com Animais da Universidade Agrícola de Henan (Província de Henan, China).
1. Cultura de células de hepatócitos bovinos
- Descongelar as células primárias do hepatócito17 e centrifugar 400 x g por 4 min à temperatura ambiente.
NOTA: As células primárias dos hepatócitos foram cultivadas e mantidas seguindo um relato previamente publicado17. - Eliminar a solução de armazenamento congelado com pipeta e suspendê-la com 1 mL de meio contendo 10% de soro fetal bovino (SFB) e meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM). Em seguida, use uma câmara de contagem de células para calcular o número de células por mililitro e, em seguida, calcular a concentração da suspensão celular acima e ajustar a concentração celular para 1 x 107 células/mL.
- Adicionar a suspensão celular numa placa de cultura celular de 60 mm contendo 3 ml do meio acima. Cultivar as células e incubá-las a 37 °C e 5% CO2 por 24 h.
- Quando as células crescerem até 80%, descarte o meio e enxágue com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e, em seguida, adicione 750 μL de tripsina a 0,25% para digerir as células. Incubar as células a 37 °C durante 3 minutos e, em seguida, neutralizá-las com a mesma quantidade de FBS a 10%. Recolher a suspensão celular para centrifugar a 200 x g durante 4 minutos à temperatura ambiente.
2. Coloração de óleo vermelho O
- Adicionar 800 μL de meio de cultura contendo 10% de FBS e DMEM em cada poço da placa de cultura celular de 24 poços contendo lamínulas de vidro. Tomar 50 μL da suspensão celular (obtida no passo 1.3) e adicioná-la a 950 μL de PBS para misturar. Use uma câmara de contagem de células para calcular o número de células por mililitro e, em seguida, calcular a concentração da suspensão de células acima. Finalmente, ajustar a concentração celular para 4 x 104/mL em cada poço e incubar a 37 °C e 5% CO2 por 24 h.
- Após 24 h, descartar o meio de cultura e lavar com PBS. Suspender com 800 μL de meio de indução DMEM contendo 1 mg/mL de albumina de soro bovino (BSA).
- Dissolver um total de 100 μL de AL (ver Tabela de Materiais) em 900 μL de etanol anidro e preparar uma solução-padrão (100 mmol/L). Adicione um gradiente de 0 μmol/L, 100 μmol/L, 150 μmol/L e 200 μmol/L LA na placa de 24 poços. Repita cada tratamento quatro vezes. Incubar a 37 °C e 5% CO2 durante 24 h.
- Retire o meio de cultura e lave as células com PBS três vezes. Fixar com 400 μL de paraformaldeído a 4% por 20 min. Descarte a solução fixadora e lave-a com PBS três vezes.
- Incubar as células com álcool isopropílico a 60% por 5 min e descartá-las. Adicione a solução de trabalho vermelha O de óleo recém-preparada (consulte a Tabela de Materiais) (proporção 3:2 de óleo vermelho O:água) por 20-30 min e descarte a solução corante. Lave as células com PBS duas a cinco vezes até que não haja excesso de solução de corante.
- Adicionar 300 μL de solução corante de hematoxilina (relação hematoxilina:água de 1:10) e re-corar o núcleo por 1-2 min. Descarte a solução corante e lave as células com PBS de duas a cinco vezes. Retire as lamínulas de vidro da placa de 24 poços e coloque-as em lâminas microscópicas (o lado com as células viradas para baixo) depois de cair 10 μL de selante de comprimido (ver Tabela de Materiais) na lâmina.
- Após a selagem, observe e obtenha imagens dos LDs das células sob a lente de óleo do microscópio óptico (ver Tabela de Materiais). Meça o diâmetro dos LDs pelo software cellSens e analise o número e o tamanho dos LDs.
3. Medição do tamanho e número de DLs
- Capturar imagens: Ligue o interruptor do computador e do microscópio sucessivamente, coloque a lâmina na plataforma de carregamento, abra o software de análise de imagem (consulte Tabela de Materiais) e conecte o computador para visualizar a imagem.
- Encontre as imagens em baixa potência e pinge uma quantidade apropriada de óleo de cedro na lâmina de imagem. Ajuste o fator de observação para 100x, defina a exposição automática e capture as imagens ajustando o campo de visão apropriado. Selecione três lâminas de células coradas para cada grupo para geração de imagens.
- Medição de diâmetro: Selecione aleatoriamente 60 LDs para cada imagem para medir os diâmetros. Após a medição de cada imagem, salve as imagens e envie os resultados da medição em uma tabela para a análise subsequente do tamanho médio e da razão de distribuição dos LDs.
- Medição de quantidade: Selecione três imagens para cada lâmina corada e fotografada e selecione aleatoriamente três células para medição de quantidade em cada imagem. Conte e analise o número de LDs ao redor da célula e calcule o número médio de LDs na célula.
4. Observação dinâmica da fusão de DL
- Siga as etapas de cultura de células conforme mencionado nas etapas 1.1-1.3. Quando as células crescerem até 80%, descarte o meio e enxágue com PBS, depois digeri-las com 750 μL de tripsina por 3 min. Em seguida, adicionar 750 μL do meio, centrifugar a 200 x g por 4 min à temperatura ambiente e descartar o sobrenadante.
- Suspender as células em 1 mL de meio de cultura, contar e ajustar a concentração celular para 5 x 105 células/mL em uma placa de 35 mm. Cultura a 37 °C e 5% CO2 por 24 h.
- Quando as células tiverem crescido até 80%, trocar o meio para DMEM + 150 μmol/L LA por 24 h e continuar a cultura em estufa a 37 °C e 5% CO2 para acumular os LDs.
- Após 24 h, retirar o meio de cultura. Lavar as células aderentes com PBS e incubá-las com sonda fluorescente neutra BODIPY 493/503 de 10 μg/mL (ver Tabela de Materiais) no escuro por 30 min. Após a incubação, lavar as células na placa de cultura com PBS três vezes e adicionar DMEM + 150 μmol/L LA.
NOTA: Evitar exposição à luz durante e após a coloração de 10 μg/mL de BODIPY; 1 mg/mL de BODIPY foi diluído com PBS (1:100). - Coloque a placa de cultura no sulco do microscópio da estação de células vivas (ver Tabela de Materiais) para observar as mudanças dinâmicas dos LDs. Ligue a energia da estação de trabalho de células vivas de acordo com a sequência de partida e evite a luz.
- Ligue a energia, a fonte de luz de transmissão, a fonte de alimentação do microscópio, a fonte de luz fluorescente da lâmpada de mercúrio, a fonte de alimentação da câmera do dispositivo acoplado à carga (CCD), a fonte de alimentação do host do computador, a válvula de CO 2 e a incubadora de CO2.
- Adicione água destilada ao sulco da plataforma de carga, garantindo que não ultrapasse a saída de ar.
- Ligue o computador e execute "NIS-Elements". Primeiro, encontre o campo de visão apropriado na lente objetiva 4x e, em seguida, ajuste-o para a lente objetiva 40x sucessivamente. Selecione E100 para observar a amostra no microscópio e L100 para visualizar e fotografar a amostra no computador.
NOTA: E100 e L100 são botões de ajuste do microscópio na estação de trabalho da célula viva (ver Tabela de Materiais), representando a ocular e a tela do computador, respectivamente. - Projete os parâmetros como canal de fluorescência (por exemplo, Ph-40x, isotiocianato de fluoresceína [FITC], obturador) e tempo de filmagem esperado para o experimento. Defina o tempo de filmagem no tempo, incluindo o tempo de intervalo de disparo de 5 min entre cada duas imagens e um tempo total de filmagem de 6 h.
NOTA: A filmagem de longa duração precisa usar a função de estabilização de foco do sistema de foco perfeito (PFS). Para isso, primeiro ajuste o campo de visão e o comprimento do foco, depois clique em PFS na tela do computador e, finalmente, ajuste a espiral de foco fino. - Selecione diferentes modos de canal, canal único ou todos, selecione um campo de visão diferente, clique em visualizar, ajuste o campo de visão, defina esses parâmetros e clique em iniciar execução para começar a filmar. Faça um teste por 5 minutos primeiro; Pode levar muito tempo depois que a operação é normal.
- Depois que a gravação for executada, escolha Arquivo > Salvar como > Salvar tipo > formato avi para exportar os dados para um vídeo no formato 'avi'. Use o formato de imagem '.nd2' para salvar o programa de dados e exportar as fotos.
- Para desligar a máquina, desligue-a na ordem inversa.
5. Estatística e análise dos resultados
- Analise os dados usando ANOVA unidirecional. Relate os resultados como média ± erro padrão.
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Representative Results
A coloração dos LDs celulares é mostrada na Figura 1. Os pontos vermelhos refletem os LDs das células, e os pontos azuis refletem os núcleos. Pode-se observar que o tamanho e o número de DLs em cada quadro são diferentes no tratamento do AL.
Com o aumento da dosagem de AL, o diâmetro médio e o número de DLs apresentaram tendência de aumento significativo, dependendo da concentração de AE (Figura 2). Como mostrado na Figura 2A, o número de DLs por célula correlacionou-se negativamente com diferentes concentrações de AL. A mediana do número de DL por célula foi de 136 para o grupo tratado com 100 μmol/L de AL, diminuindo para 118 e 105 para os grupos tratados com 150 μmol/L e 200 μmol/L de AL, respectivamente. O diâmetro médio das DLs no grupo controle foi de 0,72 μm, sendo 1,38 μm para o grupo tratado com 100 μmol/L AL, 1,51 μm para o grupo tratado com 150 μmol/L AL e 1,64 μm para o grupo tratado com 200 μmol/L AL (Figura 2B).
Neste estudo, LDs com diâmetro <1 μm foram definidos como pequenos, e DLs com diâmetro >4 μm foram definidos como grandes. Verificou-se que as proporções de distribuição dos DLs também se alteraram com a concentração de AL, como mostra a Figura 3; a proporção de pequenos DLs diminuiu, e a proporção de grandes DLs aumentou. A proporção de DLs de pequeno diâmetro foi de 43,33% a 100 μmol/L LA, 36,43% a 150 μmol/L LA, e 29,8% a 200 μmol/L LA. Para os DLs de grande diâmetro, a maior proporção foi de 6,11% em 200 μmol/L LA, depois 3,15% e 1,48% em 150 e 100 μmol/L LA, respectivamente. No grupo 200 μmol/L AL, foram obviamente observadas LDs supergrandes (diâmetro >5 μm), correspondendo a cerca de 6,30%, superiores aos grupos 100 μmol/L LA (5,93%) e 150 μmol/L LA (4,82%). Os resultados indicaram que uma alta concentração de AL aumentou o tamanho dos DLs e diminuiu o número de DLs. Enquanto isso, a proporção de grandes DLs aumentou, e a proporção de pequenos DLs diminuiu.
Grandes DLs foram geralmente formados através da fusão de pequenos LDs. A fusão de LD através de imagens de células vivas foi observada para provar isso (Figura 4). As células foram tratadas com 150 μmol/L de AL por 24 h e coradas com BODIPY. Sob a condição normal de crescimento celular a 37 °C e 5% CO2, as células foram observadas continuamente por 6 h com uma estação de trabalho de células vivas. As imagens foram capturadas a cada 5 min. Como mostrado na Figura 4, nos primeiros 15 min, ainda havia DLs obviamente menores. Então, os GDs lentamente começaram a se fundir a partir de 20 min, e foram completamente fundidos em LDs maiores por 35 min.
Figura 1: Gotículas lipídicas. Células de hepatócitos cultivadas em diferentes concentrações de AL e coradas com óleo vermelho O. Os pontos vermelhos refletiam LDs corados com óleo vermelho, e os pontos azul-púrpura refletiam o núcleo com hematoxilina. Três lâminas de vidro foram selecionadas para coloração e imagem em cada tratamento. Barra de escala = 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Número e tamanho dos LDs. Células de hepatócitos cultivadas em um gradiente de concentração de 0 a 200 μmol/L LA e coradas com óleo vermelho O. (A) Número médio de DLs por célula. O número de DLs em 27 células foi contado em cada grupo. (B) O diâmetro médio dos LDs em uma célula. O tamanho de 60 DLs foi contado em cada grupo. *p < 0,05; **p < 0,01; p < 0,001; p < 0,0001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Proporção de DL. Células de hepatócitos cultivadas em diferentes concentrações de AL e coradas com óleo vermelho O. A razão de proporção de DLs de diferentes tamanhos foi calculada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Fusão LD. As células dos hepatócitos foram cultivadas com 150 μmol/L de AL e incubadas com a sonda BODIPY 493/503. Após observação contínua por 6 h sob aumento de 40x, os LDs sob fluorescência e campos claros foram fotografados. As imagens foram capturadas a cada 5 min. A fusão foi marcada com caixas vermelhas. Barra de escala = 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Dependendo dos estados patológicos, os LDs hepáticos sofrem tremendas mudanças em seu tamanho e número. Os DLs estão amplamente presentes nas células dos hepatócitos e desempenham um papel fundamental na saúde e doençahepática18. A quantidade e o tamanho dos DLs são a base da pesquisa atual sobre a biogênese dos DLs19. O tamanho e o número de LDs para células e tecidos refletem sua capacidade de armazenar e liberar energia. As alterações dinâmicas dos GDs mantêm a estabilidade das atividades metabólicas lipídicas20,21. O acúmulo anormal de DLs ocorre em várias condições patológicas e pode ser um indicador de doença metabólica22,23. Este protocolo fornece um método preciso para medir o tamanho e a quantidade de DLs em um modelo de células de hepatócitos induzidas por ácidos graxos e observar a fusão de DLs de forma mais eficiente e intuitiva.
Estudar o tamanho e as alterações dinâmicas dos TAs é de grande importância para a compreensão da ocorrência de doenças relacionadas aos distúrbios do metabolismo lipídico e intervenção efetiva. Neste experimento, as etapas principais foram a mensuração e análise do tamanho e quantidade de DLs. Primeiro, diferentes concentrações de AL foram usadas para induzir o acúmulo de DL nos hepatócitos. Outros ácidos graxos, como oleato e palmitato, também poderiam ser utilizados para causar acúmulo de DL nas células dos hepatócitos24,25. Após o tratamento com diferentes concentrações de AL, verificou-se que o tamanho das DLs foi aumentado de forma dose-dependente. Estes resultados indicaram que a coloração O vermelho do óleo mediu com precisão o diâmetro das DLs. Verificou-se também que uma alta concentração de AL poderia aumentar a proporção de DLs de grande porte, sugerindo que LDs pequenas se fundiram entre si rapidamente. A fusão rápida é uma das alterações dinâmicas nos DLs; A fusão rápida da DL pode ocorrer em poucos minutos ou até dezenas de segundos, sendo mediada principalmente por seus fosfolipídios de superfície e proteínas22,26. No presente estudo, a fusão de DL foi claramente observada de 20 min a 35 min usando a marcação BODIPY 493/503 por uma estação de trabalho de células vivas. O intervalo de filmagem entre as imagens pode ser configurado em alguns segundos a minutos, e o tempo total de filmagem pode ser ajustado de 1 hora a vários dias, o que proporciona conveniência para observar as mudanças dinâmicas dos GDs em diferentes células.
Em termos da análise da coloração do tamanho dos LDs, a coloração vermelho óleo O é mais conveniente e barata do que a coloração fluorescente, sendo mais amplamente utilizada para medir o tamanho aparente dos DLs9. Não precisa ser tratado contra a luz. Além disso, os requisitos do equipamento não são difíceis de alcançar, e a lente de óleo de um microscópio óptico comum pode ser usada para observação fotográfica. Usando esse método, os pesquisadores podem selecionar vários grupos de imagens para medir aleatoriamente o tamanho e a quantidade de LDs; É simples e conveniente de operar, e pode aumentar o tamanho da amostra e reduzir o erro. Além disso, de acordo com o tamanho de DL medido e analisado, a razão de distribuição dos diferentes tamanhos de DL pode ser observada diretamente. A análise estatística pode ser realizada pelo método acima após a coloração vermelho O do óleo, e este método também pode ser aplicado a outras células, incluindo uma ampla gama de células afetadas pelo acúmulo de lipídios. Na fase inicial de tingimento, verificou-se que o óleo vermelho O não era fácil de limpar após o tingimento, e havia resíduos substanciais de jazil de corante. Na etapa posterior, o corante foi filtrado e o tempo de tingimento adequado foi selecionado através de testes contínuos. Após o tingimento, aumentar os tempos de limpeza poderia evitar o problema acima.
O corante fluorescente BODIPY 493/503 é uma das sondas mais comuns para visualização de DL27. Neste estudo, a fusão da DL foi realizada marcando-se a DL verde com BODIPY e observando-se o processo com uma estação de trabalho de células vivas. O vermelho do Nilo também é um corante fluorescente comumente usado para lipídios neutros, mas sua ampla banda de excitação (450-560 nm), coloração inespecífica, baixa permeabilidade tecidual e outras deficiências podem afetar os resultados da coloração LD até certo ponto. Em comparação com a coloração de fluorescência vermelha do Nilo, a banda de excitação de BODIPY 493/503 foi mais estreita (460-490 nm), e pode ser co-marcada com vários corantes fluorescentes11. Em segundo lugar, o BODIPY evita efetivamente a interferência de pigmentos vegetais28. Finalmente, BODIPY tem forte permeabilidade tecidual, baixa sensibilidade à polaridade ambiental e não é fácil de extinguir12; portanto, é amplamente utilizado na coloração por fluorescência de DLs. No entanto, a análise da fusão da DL tem algumas limitações. A fim de obter uma imagem de observação contínua de células vivas, a lente não pode ser movida, de modo que apenas uma fusão LD local pode ser observada na visão, e a eficiência da fusão LD de toda a célula não pode ser analisada com mais precisão.
Em conclusão, este estudo fornece um método simples e reprodutível para análise da morfologia e tamanho da DL, que pode ser amplamente aplicado à análise da DL no estudo do metabolismo lipídico celular. Este trabalho também comprovou o processo de fusão de DL, lançando as bases para um estudo mais aprofundado de LDs no futuro.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada conjuntamente pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (U1904116).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin | Gibco | 25200072 | reagent |
| 4% paraformaldehyde | Solarbio | P1110 | reagent |
| BODIPY 493/503 | invitrogen | 2295015 | reagent |
| Cedar oil | Solarbio | C7140 | reagent |
| cell counting chamber | equipment | ||
| cell culture dish | Corning | 353002 | material |
| cell sens software | Olympus IX73 | software | |
| Centrifuge | Eppendorf | equipment | |
| DMEM | HyClone | SH30022.01 | reagent |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 2492319 | reagent |
| hematoxylin | DingGuo | AR0712 | reagent |
| Image view | image analysis sodtware | ||
| linoleic acid | Solarbio | SL8520 | reagent |
| Live Cell Station | Nikon A1 HD25 | equipment | |
| NIS-Elements | Nikon | software | |
| oil red O | Solarbio | G1260 | reagent |
| optical microscope | Olympus IX73 | equipment | |
| Penicillin & Streptomycin 100× | NCM Biotech | CLOOC5 | reagent |
| Phosphate Buffered Saline | HyClone | SH30258.01 | reagent |
| Pipette | Eppendorf | equipment | |
| Sealing agent | Solarbio | S2150 | reagent |
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