Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

التحضير وتلطيخ التألق المناعي للحزم وخلايا الألياف المفردة من قشرة ونواة عدسة العين

Published: June 9, 2023 doi: 10.3791/65638
Automatic Translation
1, 1
1School of Optometry and Vision Science Program, Indiana University

Summary

يصف هذا البروتوكول طرقا لإعداد خلايا ألياف عدسة العين المحيطية والناضجة والنووية للتلطيخ المناعي لدراسة التداخل المعقد من خلية إلى أخرى وبنية الغشاء.

Abstract

العدسة عبارة عن عضو شفاف وبيضاوي الشكل في الحجرة الأمامية للعين يتغير شكله لتركيز الضوء بدقة على شبكية العين لتشكيل صورة واضحة. يتكون الجزء الأكبر من هذا النسيج من خلايا ليفية متخصصة ومتمايزة لها مقطع عرضي سداسي وتمتد من القطب الأمامي إلى القطب الخلفي للعدسة. هذه الخلايا الطويلة والنحيفة تعارض بشدة الخلايا المجاورة ولها تداخلات معقدة على طول الخلية. الهياكل المتشابكة المتخصصة مطلوبة للخصائص الميكانيكية الحيوية العادية للعدسة وقد تم وصفها على نطاق واسع باستخدام تقنيات المجهر الإلكتروني. يوضح هذا البروتوكول الطريقة الأولى للحفاظ على وتلوين المفرد وكذلك حزم خلايا ألياف عدسة الماوس للسماح بالتوطين التفصيلي للبروتينات داخل هذه الخلايا ذات الشكل المركب. توضح البيانات التمثيلية تلطيخ خلايا الألياف الطرفية والتمايزية والناضجة والنووية في جميع مناطق العدسة. يمكن استخدام هذه الطريقة على خلايا الألياف المعزولة من عدسات الأنواع الأخرى.

Introduction

العدسة عبارة عن نسيج شفاف وبيضاوي الشكل في الحجرة الأمامية للعين يتكون من نوعين من الخلايا ، الخلايا الظهارية والليفية 1 (الشكل 1). هناك طبقة أحادية من الخلايا الظهارية التي تغطي نصف الكرة الأمامي للعدسة. تتمايز الخلايا الليفية عن الخلايا الطلائية، وتشكل الجزء الأكبر من العدسة. تخضع خلايا الألياف عالية التخصص لبرمجة الاستطالة والتمايز والنضج ، والتي تتميز بتغيرات واضحة في مورفولوجيا غشاء الخلية من محيط العدسة إلى مركز العدسة2،3،4،5،6،7،8،9،10،11،12، المعروف أيضا باسم نواة العدسة. تعتمد وظيفة العدسة في التركيز الدقيق للضوء القادم من مسافات مختلفة على شبكية العين على خصائصها الميكانيكية الحيوية ، بما في ذلك الصلابة والمرونة13،14،15،16،17،18،19. تم افتراض التداخلات المعقدة لألياف العدسة20,21 وثبت مؤخرا أنها مهمة لصلابةالعدسة 22,23.

Figure 1
الشكل 1: مخططات تشريح العدسة وصور المجهر الإلكتروني الماسح التمثيلي (SEM) من ألياف العدسة. يظهر الرسم الكاريكاتوري منظرا طوليا (من الأمام إلى الخلف من الأعلى إلى الأسفل) للطبقة الأحادية الأمامية للخلايا الظهارية (مظللة باللون الأزرق الفاتح) وكتلة كبيرة من خلايا ألياف العدسة (بيضاء). يعرف مركز العدسة (المظلل باللون الوردي) باسم النواة ويتكون من خلايا ليفية مضغوطة للغاية. على اليمين ، يكشف رسم كاريكاتوري مقطع عرضي عن شكل الخلية السداسية الممدودة لألياف العدسة المعبأة في نمط قرص العسل. الخلايا الليفية لها جانبان عريضان وأربعة جوانب قصيرة. تظهر صور SEM التمثيلية على طول الجزء السفلي التداخل الغشائي المعقد بين خلايا ألياف العدسة على أعماق مختلفة من العدسة. من اليمين ، تحتوي ألياف العدسة المشكلة حديثا في محيط العدسة على نتوءات صغيرة على طول الجوانب القصيرة والكرات والمقابس على طول الجانب العريض (الصناديق الحمراء). أثناء النضج ، تطور ألياف العدسة مجالات مجداف كبيرة مزينة بنتوءات صغيرة على طول الجوانب القصيرة (الصناديق الزرقاء). تحتوي خلايا الألياف الناضجة على مجالات مجداف كبيرة موضحة بنتوءات صغيرة. هذه المجالات المتشابكة مهمة للخصائص الميكانيكية الحيوية للعدسة. تحتوي الخلايا الليفية في نواة العدسة على عدد أقل من النتوءات الصغيرة على طول جوانبها القصيرة ولها تداخلات معقدة بين اللسان والأخدود (مربعات أرجوانية). تعرض الجوانب العريضة للخلية مورفولوجيا غشاء كروي. تم تعديل الرسوم المتحركة من22,32 ولم يتم رسمها على نطاق واسع. شريط المقياس = 3 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

تنمو العدسة عن طريق إضافة أغلفة من خلايا الألياف الجديدة المتراكبة فوق الأجيال السابقة من الألياف24,25. الخلايا الليفية لها شكل مقطع عرضي سداسي ممدود مع جانبين عريضين وأربعة جوانب قصيرة. تمتد هذه الخلايا من القطب الأمامي إلى القطب الخلفي للعدسة ، واعتمادا على الأنواع ، يمكن أن يصل طول ألياف العدسة إلى عدة ملليمترات. لدعم بنية هذه الخلايا الممدودة والنحيفة ، تخلق التداخلات المتخصصة على طول الجانبين العريض والقصير هياكل متشابكة للحفاظ على شكل العدسة والخصائص الميكانيكية الحيوية. تم توثيق التغييرات في شكل غشاء الخلية أثناء تمايز الخلايا الليفية ونضجها على نطاق واسع من خلال دراسات المجهر الإلكتروني (EM)2،3،4،5،6،7،8،9،10،20،26،27،28،29. تحتوي الخلايا الليفية المشكلة حديثا على كرات ومآخذ على طول جوانبها العريضة مع نتوءات صغيرة جدا على طول جوانبها القصيرة ، بينما تحتوي الألياف الناضجة على نتوءات ومجاديف متشابكة على طول جوانبها القصيرة. تعرض الألياف النووية تداخلات اللسان والأخدود ومورفولوجيا الغشاء الكروي. لا يعرف سوى القليل عن البروتينات المطلوبة لهذه الأغشية المتشابكة المعقدة. اعتمدت الدراسات السابقة حول توطين البروتين في خلايا الألياف على أقسام أنسجة العدسة ، والتي لا تسمح بتصور واضح لبنية الخلية المعقدة.

ابتكر هذا العمل وأتقن طريقة جديدة لإصلاح خلايا ألياف العدسة المفردة والحزم للحفاظ على التشكل المعقد والسماح بتلطيخ المناعة للبروتينات في غشاء الخلية وداخل السيتوبلازم. تحافظ هذه الطريقة بأمانة على بنية غشاء الخلية ، مقارنة بالبيانات من دراسات EM ، وتسمح بتلطيخ الأجسام المضادة الأولية لبروتينات معينة. لقد سبق لنا أن خضعنا ألياف العدسات القشرية الملطخة بالمناعة والتي تخضع للتمايز والنضج22,23. في هذا البروتوكول ، هناك أيضا طريقة جديدة لتلطيخ خلايا الألياف من نواة العدسة. يفتح هذا البروتوكول الباب لفهم آليات التكوين والتغيرات في تداخل الغشاء أثناء نضوج الخلايا الليفية وضغط نواة العدسة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم الاعتناء بالفئران بناء على بروتوكول حيواني وافقت عليه اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات في جامعة إنديانا بلومنجتون. كانت الفئران المستخدمة لتوليد بيانات تمثيلية هي التحكم (من النوع البري) في خلفية C57BL6 / J ، وأنثى ، وعمر 8-12 أسبوعا. يمكن استخدام كل من ذكور وإناث الفئران في هذه التجربة ، لأنه من غير المرجح أن يؤثر جنس الفئران على نتيجة التجربة.

1. تشريح العدسة وفك الكبسولة

  1. القتل الرحيم للفئران باتباع "دليل رعاية واستخدام المختبر" الصادر عن المعاهد الوطنية للصحة بالإضافة إلى بروتوكولات استخدام الحيوانات المعتمدة من قبل المؤسسة.
    ملاحظة: بالنسبة للدراسة الحالية ، تم القتل الرحيم للفئران بجرعة زائدة من CO2 متبوعة بخلع عنق الرحم وفقا لبروتوكول حيواني معتمد (جامعة إنديانا).
  2. استئصال العينين من الفئران باستخدام ملقط منحني عن طريق الضغط على الأنسجة حول العينين مع جانب واحد من الملقط لإزاحة العين من التجويف. بعد ذلك ، أغلق الملقط الموجود أسفل العين وارفعه لإزالة العين من التجويف. انقل العينين إلى محلول ملحي طازج 1x مخزن بالفوسفات (PBS) في صينية تشريح.
  3. قطع العصب البصري مع مقص دقيق للغاية أقرب ما يمكن إلى مقلة العين. أدخل بعناية ملاقط مستقيمة ذات طرف رفيع في مقلة العين من خلال مخرج العصب البصري في الجزء الخلفي من العين.
  4. أدخل المقص بعناية في نفس موقع الملقط في الخطوة 1.3 وابدأ في قطع شق من الخلف باتجاه تقاطع القرنية الصلبة.
    ملاحظة: عدسات القوارض تحتل ~ 30٪ من عيونهم. سيحدث تلف عرضي إذا تم إدخال الملقط أو المقص في عمق العين.
  5. استمر في القطع على طول تقاطع القرنية الصلبة حتى يتم فصل نصف الوصلة على الأقل.
  6. استخدم الملقط للضغط برفق على القرنية حتى تتمكن العدسة من الخروج من خلال الشق المصنوع بالخطوتين 1.4 و 1.5.
  7. قم بإزالة أي قطع كبيرة من الأنسجة بعناية من العدسة باستخدام ملاقط مستقيمة ذات طرف رفيع. افحص العدسة للعثور على المنطقة الاستوائية.
  8. اخترق العدسة بسطحية باستخدام ملاقط مستقيمة ذات طرف رفيع ، ثم قم بإزالة كبسولة العدسة. ستبقى كتلة خلايا ألياف العدسة سليمة ، وستظل الطبقة الأحادية الطلائية للعدسة متصلة بكبسولة العدسة. تخلص من كبسولة العدسة.

2. تلطيخ خلية الألياف المفردة للعدسة

  1. انقل كتلة خلية ألياف العدسة إلى صفيحة بئر تحتوي على 500 ميكرولتر من محلول بارافورمالدهايد الطازج بنسبة 1٪ (PFA ؛ في 1x PBS) واحتضان العينات عند 4 درجات مئوية طوال الليل مع التقطيع اللطيف (الشكل 2 أ).
    ملاحظة: تم تحسين أحجام الحلول المقدمة لألواح 48 بئرا. إذا تم استخدام لوحة أو أنابيب جيدة بحجم آخر ، فاضبط أحجام المحاليل وفقا لذلك. تم إجراء حلول التثبيت والحجب والغسيل (1x PTX ، 0.1٪ Triton X-100 in 1x PBS) باستخدام 10x PBS وماء مقطر مزدوج (ddH2O) إلى تركيز نهائي قدره 1x PBS.
  2. انقل خلايا ألياف العدسة إلى طبق 60 مم مع 1٪ PFA. استخدم مشرطا حادا لتقسيم كرة الخلايا الليفية إلى نصفين على طول محورها الأمامي الخلفي (الشكل 2 ب). قطع النصفين إلى النصف مرة أخرى على طول نفس المحور لإنتاج أرباع.
    ملاحظة: يمكن التعرف بسهولة على المحور الأمامي الخلفي من خلال اتجاه خلايا الألياف في كتلة الأنسجة.
  3. استخدم ملاقط مستقيمة لإزالة منطقة النواة من أرباع خلايا ألياف العدسة (الشكل 2C).
    ملاحظة: تكون منطقة نواة العدسة صلبة في عدسات القوارض ، وسوف ينفصل مركز العدسة عن الألياف القشرية الأكثر ليونة بسهولة.
  4. بعد التثبيت أرباع منطقة قشرة العدسة في 200 ميكرولتر من 1٪ PFA لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) مع اهتزاز لطيف (300 دورة في الدقيقة على شاكر اللوحة).
  5. اغسل أرباع المناديل مرتين في 750 ميكرولتر من 1x PBS لمدة 5 دقائق لكل منهما مع رج لطيف في RT.
  6. قم بحظر العينات باستخدام 200 ميكرولتر من محلول الحجب (5٪ مصل ، 0.3٪ Triton X-100 ، 1x PBS) لمدة 1 ساعة في RT مع اهتزاز لطيف.
    ملاحظة: بالنسبة للبيانات التمثيلية في هذا البروتوكول ، لم تكن العينات ملطخة بالأجسام المضادة الأولية أو الثانوية. بعد خطوة الحجب ، تم تحضين العينات ب agglutinin جرثومة القمح (WGA ؛ 1: 100) و phalloidin (1: 100) (انظر جدول المواد) لمدة 3 ساعات في RT مع اهتزاز لطيف وحماية من الضوء. تم إثبات تلطيخ الأجسام المضادة الأولية في المنشورات السابقة22,23.
  7. احتضن مع 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولية طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع رج لطيف.
    ملاحظة: يتم تخفيف الأجسام المضادة في محلول مانع. بالمقارنة مع الشرائح ذات أقسام الأنسجة ، هناك المزيد من الخلايا في هذا النوع من التحضير. يجب زيادة تركيزات الأجسام المضادة الأولية لتوفير أجسام مضادة وافرة لتلطيخ المزيد من الخلايا. يوصى بمضاعفة تركيز الأجسام المضادة مما يستخدم في أقسام الأنسجة. الأمر نفسه ينطبق على الأجسام المضادة الثانوية.
  8. اغسل أرباع المناديل ثلاث مرات باستخدام 1x PTX (0.1٪ Triton X-100 ، 1x PBS) لمدة 5 دقائق لكل منها في RT مع اهتزاز لطيف.
  9. احتضان خلايا الألياف ب 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة / الصبغة الثانوية لمدة 3 ساعات في RT مع اهتزاز لطيف. حماية العينات من الضوء خلال هذه الخطوة والخطوات اللاحقة.
    ملاحظة: يمكن إضافة WGA و phaloidin والأصباغ الفلورية الأخرى إلى محلول الأجسام المضادة الثانوي لوضع العلامات المتزامنة على غشاء الخلية أو الهيكل الخلوي أو العضيات الأخرى مع تسمية الجسم المضاد الأساسي أيضا.
  10. اغسل خلايا الألياف أربع مرات باستخدام 1x PTX لمدة 5 دقائق لكل منها في RT مع اهتزاز لطيف.
  11. أضف قطرة واحدة أو 50 ميكرولتر من وسائط التركيب على شريحة مجهر مشحونة زائد قبل نقل أرباع الأنسجة إلى الشريحة.
  12. استخدم الملقط لفصل خلايا الألياف برفق عن بعضها البعض وحاول الحد من تداخل حزم الخلايا.
  13. ضع غطاء #1.5 برفق أعلى العينة في وسائط التركيب. يجب أن تنتشر وسائط التركيب إلى حافة غطاء الغطاء ؛ إذا لم يحدث ذلك، فأضف بعض وسائط التركيب الإضافية إلى حافة قسيمة الغطاء. قم بشفط أي وسائط تثبيت زائدة حول حافة غطاء الغطاء واستخدم طلاء الأظافر لإغلاق حواف غطاء الغطاء على الشريحة.
    ملاحظة: يمكن استخدام أي نوع من وسائط التركيب المصممة للفحص المجهري متحد البؤر لهذه التجارب.

3. تلطيخ خلية الألياف المفردة لنواة العدسة

  1. أكمل التشريح الموضح في القسم 1.
  2. قم بإزالة الألياف القشرية ميكانيكيا من كرة خلايا ألياف العدسة ، تاركا نواة العدسة ، عن طريق نقل كتلة الخلايا الليفية برفق إلى أطراف الأصابع المبللة والقفاز ولف كتلة الأنسجة برفق.
    ملاحظة: في عدسات الماوس ، يعد دحرجة كرة خلايا ألياف العدسة بين أطراف الأصابع القفاز طريقة فعالة لإزالة خلايا الألياف القشرية من نواة العدسة الصلبة28,30. بالنسبة للعدسات التي لا تكون فيها هذه الطريقة الميكانيكية فعالة ، يمكن استخدام تشريح دقيق أو طريقة دوامة29 لإزالة خلايا الألياف القشرية.
  3. انقل نواة العدسة إلى محلول PFA 1٪ طازج في طبق جيد واحتضانها طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع رج لطيف.
  4. انقل العينة إلى طبق 60 مم مع 1٪ PFA واستخدم مشرطا حادا لتقسيم نواة العدسة على طول المحور الأمامي الخلفي. اقطع عينات الأنسجة إلى النصف مرة أخرى لإنتاج أرباع النواة.
  5. اتبع العملية الموضحة في الخطوات 2.4-2.13 للتلطيخ المناعي وتركيب العينة.

Figure 2
الشكل 2: ملخص بياني يوضح بالتفصيل تحضير خلايا ألياف العدسة وتلطيخها المناعي . (أ) تم ترميز هذه اللوحة المكونة من 48 بئرا بالألوان حسب العمود لتوضيح إعداد لوحة العينة للطرق الموصوفة ، مما يسمح بسهولة نقل العينات بين خطوات التلوين المناعي المختلفة عن طريق المناولة اللطيفة باستخدام الملقط. في حين أن البيانات التمثيلية لهذا البروتوكول لا يتم تحضينها بجسم مضاد أولي ، فإن الرسم البياني يتضمن عمودا لحضانة الأجسام المضادة الأولية ، ويمكن إعادة استخدام آبار الغسيل بعد إزالة مخازن الغسيل المستخدمة عن طريق الشفط. (ب) بعد تثبيت كتلة خلية الليفة العدسة، ينقسم النسيج على طول المحور الأمامي الخلفي (خطوط حمراء متقطعة) للحفاظ على التركيب الأصلي للخلايا. بمجرد خفض كتلة الأنسجة إلى النصف ، يتم تدوير العينات وتقسيم النصفين إلى أرباع على طول المحور الأمامي الخلفي (خطوط حمراء متقطعة). (ج) تتم إزالة منطقة نواة العدسة (باللون الوردي) بسهولة باستخدام ملاقط لاستخراج الأنسجة المركزية الكثيفة من خلايا الألياف القشرية (باللون الأزرق). تم إنشاء مخططات الرسوم المتحركة جزئيا باستخدام BioRender.com ولم يتم رسمها على نطاق واسع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يتم تحضير خلايا ألياف العدسة من قشرة العدسة (الألياف المتمايزة والألياف الناضجة) والنواة ، ويتم تلطيخ الخلايا بالقضيب ل F-actin و WGA لغشاء الخلية. يتم ملاحظة وتصوير خليط من حزم الخلايا أو ألياف العدسة المفردة (الشكل 3). من قشرة العدسة ، تم العثور على نوعين من الخلايا (الشكل 3 أ). تكون خلايا الألياف المتمايزة في محيط العدسة مستقيمة، مع نتوءات صغيرة جدا على طول جوانبها القصيرة. عندما تتمايز الخلية ، تصبح خلايا الألياف متموجة مع نتوءات صغيرة متشابكة. علاوة على ذلك ، على طول عملية النضج ، تطور خلايا الألياف مجاذيف كبيرة مزينة بنتوءات صغيرة متشابكة. نواة العدسة مضغوطة للغاية وصلبة في عدسات الماوس ، ويتم عزلها عن طريق الإزالة الميكانيكية لقشرة العدسة الأكثر ليونة قبل تثبيت وتلطيخ ألياف العدسة النووية. من نواة العدسة ، توجد حزم من ألياف العدسة أصغر في القطر ولها هياكل غشائية دقيقة لا يمكن رؤيتها بسهولة على صورة منخفضة التكبير.

في عمليات إعادة البناء ثلاثية الأبعاد عالية التكبير لخلايا ألياف العدسة من مناطق مختلفة من العدسة (الشكل 3B) ، وجد أن F-actin و WGA يتمركزان بشكل كبير في غشاء الخلية في خلايا الألياف المتمايزة والناضجة. يتم إثراء F-actin في النتوءات المتشابكة على طول غشاء الخلية في الألياف المتمايزة والناضجة (الشكل 3B ، رؤوس الأسهم). تطور خلايا الألياف الناضجة مجاذيف متشابكة كبيرة (الشكل 3 ب ، العلامات النجمية). لا يتم تنصيب WGA بشكل كامل مع إشارة F-actin ، خاصة في خلية الألياف الناضجة ، مما يشير إلى أن شبكة الأكتين القشرية لا تدعم جميع الهياكل الأصغر على طول غشاء الخلية. بشكل غير متوقع ، وجد أن شبكة F-actin تقع داخل السيتوبلازم لخلايا الألياف النووية. بينما تمتد إشارة F-actin إلى النتوءات (الشكل 3B ، الأسهم) على طول غشاء خلية الألياف النووية ، لم تعد شبكة الأكتين مخصبة بالقرب من غشاء الخلية أو داخل النتوءات. يفتقر مورفولوجيا خلية الألياف النووية إلى المجاذيف ، بالإضافة إلى انخفاض في تنظيم وتواتر النتوءات.

Figure 3
الشكل 3: صور متحدة البؤر لحزم (تكبير منخفض) وصور مفردة (عالية التكبير) لخلايا ليفية من مناطق مختلفة من العدسة. الخلايا ملطخة ب WGA (أغشية الخلايا ، الخضراء) ، القضيب (F-actin ، الأحمر) ، و DAPI (النوى ، الأزرق). (أ) في هذه المستحضرات، توجد عادة حزم من خلايا الليفي العدسي من مناطق مختلفة. في المستحضرات القشرية ، هناك خلايا ألياف متمايزة وناضجة. هذه الخلايا المختلفة لها أشكال مميزة ، مما يسمح بسهولة التعرف عليها. في العينات المأخوذة من نواة العدسة، توجد حزم الخلايا الليفية وكذلك الألياف المنفصلة. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. (ب) يتم جمع مكدسات Z من خلال خلايا الألياف النووية الفردية المتمايزة والناضجة والنووية ، ويتم استخدام عرض 3D لإعادة بناء الصور المعروضة. تحتوي الألياف المتمايزة والناضجة على العديد من النتوءات الصغيرة على طول جوانبها القصيرة (تحدد رؤوس الأسهم تلك المحددة). يتم إثراء هذه النتوءات الصغيرة ل F-actin. تحتوي الألياف الناضجة أيضا على مجالات مجداف متشابكة كبيرة (علامات نجمية). تحتوي الألياف النووية على جيوب غشائية صغيرة و divots ملطخة بواسطة WGA وتحتفظ ببعض النتوءات على طول جوانبها القصيرة (الأسهم). والمثير للدهشة أن شبكة F-actin موزعة الآن في سيتوبلازم الخلية دون إشارات مخصبة في غشاء الخلية. تمتد شبكة F-actin إلى نتوءات صغيرة. شريط المقياس = 5 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

عند فحص الخلايا الليفية ، من المهم ملاحظة اتجاه الخلايا لتجنب الالتباس حول نوع الخلية التي يتم ملاحظتها. يتم جمع مكدسات Z من خلال الخلايا ، ثم يتم استخدام إعادة بناء 3D للنظر في الإسقاطات 2D المتعامدة في طائرات XY و XZ و YZ. نظرا للاتجاه العشوائي للخلايا في هذا المستحضر ، من الممكن أن يكون لديك خلايا لا تكون مسطحة تماما على الشريحة الزجاجية (الشكل 4). جميع الخلايا في هذه الصورة التمثيلية عبارة عن ألياف عدسة ناضجة، لكن كل خلية لها مظهر مختلف تماما في المستوى XY. يتم توجيه الخلية شبه الملونة باللون الأخضر إلى جانب عريض لأعلى مع مجاذيف ونتوءات مرئية ، بينما تكون الخلية شبه الملونة باللون الوردي مستلقية مع الجانب القصير لأعلى. يمكن تصور ذلك بسهولة أكبر في المستوى XZ ، مما يوضح الاتجاهات العمودية للخليتين الموضحين في المستوى XY. يظهر فحص الطائرة YZ بوضوح مجاذيف الألياف الناضجة الملونة باللون الوردي من مستوى XY.

Figure 4
الشكل 4: إسقاطات ثنائية الأبعاد متعامدة (طائرات XY و XZ و YZ) لمكدسات z ثلاثية البؤر ثلاثية الأبعاد من خلال مجموعة من خلايا ألياف العدسة الناضجة المفردة الملطخة بالقضيب ل F-actin. خليتان بلون زائف باللون الوردي أو الأخضر لتحديد الهوية على كل مستوى. في المستوى XY، تستلقي الخلية الوردية ويكون جانبها القصير متجها لأعلى، بينما تستلقي الخلية الخضراء بشكل مسطح ويكون جانبها العريض متجها لأعلى. في المستوى XZ ، لوحظ أن الخلية الوردية مائلة في الاتجاه ، بينما تكون الخلية الخضراء موازية للشريحة الزجاجية. في مستوى YZ ، لوحظت المجاذيف ونتوءات الخلايا الوردية ، مما يؤكد أن هذه الخلية هي خلية ألياف ناضجة. شريط المقياس = 5 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

نظرا لأن الألياف يبلغ سمكها حوالي 2-4 ميكرومتر 25,31 ، فمن الممكن من خلال مجموعة مداخن z عرض سطح الخلية أو مستوى عبر السيتوبلازم (الشكل 5). يعمل هذا بشكل أفضل على الخلايا الموازية تقريبا مع غطاء الغطاء ، مع توجيه الجانب العريض من الخلية لأعلى. يمكن تقدير سطح الخلية في هذه الخلية الليفية الناضجة من خلال مراقبة إشارة WGA (الشكل 5 أ). يوضح المستوى XZ بوضوح أن هذا المستوى XY يقع على طول الجانب العريض للخلية. تشير نقطة WGA + الصغيرة على طول الغشاء إلى مورفولوجيا سطح الخلية الخشنة. تظهر النتوءات الصغيرة على طول الجانب القصير في الصور منخفضة التعرض إشارة F-actin غنية بشكل كبير. عند التعرض العالي ، حيث تكون إشارة F-actin في النتوءات مشبعة ، يتم ملاحظة شبكة F-actin شبكية دقيقة عبر غشاء الخلية (العلامات النجمية). عندما يتم النظر في مستوى XY من خلال السيتوبلازم من الألياف الناضجة (الشكل 5B) ، لوحظ تلطيخ WGA بشكل رئيسي على طول غشاء الخلية. على غرار ما يظهر على سطح الخلية ، يتم إثراء F-actin في النتوءات على طول الجوانب القصيرة ، مع شبكة F-actin السيتوبلازمية الشبكية المرئية عند التعرض العالي (العلامات النجمية). أظهر عملنا السابق تلطيخ البروتينات الغشائية في طائرات XY عبر سيتوبلازم الخلية22,23 ، ولكن بهذه الطريقة ، من الممكن أيضا توطين البروتينات على طول سطح الخلية الجانبي العريض.

Figure 5
الشكل 5: إسقاطات 2D المتعامدة (طائرات XY و XZ) لمداخن z متحدة البؤر ثلاثية الأبعاد من خلال خلية ليفية ناضجة واحدة ملطخة ب WGA (أخضر) و phalloidin (F-actin ، أحمر). (أ) تظهر النتوءات من سطح الخلية على طول الجانب العريض WGA على طول الغشاء الخلوي، وتشير النقاط الموجودة في WGA إلى أن الغشاء ليس أملسا تماما. يتم إثراء F-actin في النتوءات على طول الجوانب القصيرة ، وتكشف صورة عالية التعرض لتلطيخ F-actin عن شبكة شبكية على طول غشاء الخلية (العلامات النجمية). (ب) يظهر مستوى آخر يمر عبر سيتوبلازم الخلية نفسها WGA على طول الغشاء الخلوي، وهو يؤطر الخلية. يشكل F-actin شبكة شبكية من خلال السيتوبلازم (العلامات النجمية) ويتم تخصيبه بشكل كبير في النتوءات على طول غشاء الخلية. قضبان المقياس = 5 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

بعد ذلك ، تتم مقارنة صور ألياف العدسة من المسح EM (SEM) وتجارب التلطيخ. يتم إجراء تجارب SEM كما هو موضح سابقا29 ، ويتم التقاط الصور بالتتابع من مركز العينة إلى المحيط. أولا ، يتم فحص ألياف العدسة المميزة ذات النتوءات الصغيرة (الشكل 6 ، الأسهم) على طول جوانبها القصيرة والكرة والمقبس (رؤوس الأسهم) على طول جوانبها العريضة. على غرار صورة SEM (الشكل 6A) ، في حزمة من الألياف المتمايزة الموجهة على طول جوانبها القصيرة ، فإن تداخلات الكرة والمقبس عبارة عن نتوءات وأخاديد كبيرة تمتد على طول الجانب العريض من الخلايا (الشكل 6B ، رؤوس الأسهم). تم العثور على مقبس (الشكل 6C ، رؤوس الأسهم) عندما يتم عرض الخلية في إسقاطات 2D المتعامدة XY و XZ في ألياف عدسة متمايزة واحدة. يتم أيضا الحفاظ على النتوءات المتشابكة الصغيرة على طول الجوانب القصيرة بأمانة في خلايا ألياف العدسة الملطخة هذه مقارنة بتلك الموجودة في صورة SEM (الأسهم). بعد ذلك ، يتم التحقيق في مورفولوجيا خلايا الألياف الناضجة (الشكل 7). في صورة SEM والخلية الملطخة ، توجد divots صغيرة على طول الجانب العريض من الخلايا (الشكل 7A ، B ، رؤوس الأسهم). من المفترض أن هذه هي بقايا تداخلات الكرة والمقبس التي تتقلص أثناء عملية النضج. المجاذيف الكبيرة (العلامات النجمية) المزينة بنتوءات صغيرة متشابكة (أسهم) قابلة للمقارنة بين الخلايا الموجودة في SEM والألياف الناضجة الملطخة. تحتوي الخلايا الموجودة في صورة SEM أيضا على أخاديد واضحة حيث يلتحم نتوء متشابك في غشاء الخلية (الشكل 7C ، رؤوس الأسهم). يمكن أيضا رؤية هذه الأخاديد في هذه الخلايا الملطخة ويتم ملؤها بواسطة إشارة WGA (الشكل 7D ، رؤوس الأسهم). يمكن أن تبدو الأخاديد مثل نتوءات تتجه إلى الداخل نحو سيتوبلازم الخلية بدلا من الإسقاط للخارج من غشاء الخلية ، وغالبا ما يكون تلطيخ WGA فقط مرئيا في الأخاديد التي تحتوي على القليل جدا ، إن وجدت ، إشارة تلطيخ F-actin.

Figure 6
الشكل 6: صور المجهر المجهري أحادي البؤر والمجهر البؤري لخلايا الألياف المتمايزة عن قشرة العدسة. خلايا الألياف للفحص المجهري متحد البؤر ملطخة ب WGA (أخضر) و phalloidin (F-actin ، أحمر). (أ) تظهر SEM لحزمة من ألياف العدسة المتمايزة تداخلات كروية ومقبس (رؤوس أسهم) على طول الجانب العريض من الخلايا مع نتوءات صغيرة متشابكة (أسهم) على طول الجوانب القصيرة للخلايا. (ب) تظهر الصور متحدة البؤر لحزمة من الألياف المتمايزة المصورة من الجوانب القصيرة تداخلات كبيرة بين الكرة والمقبس على طول الجوانب العريضة للخلايا (رؤوس الأسهم). (C) تظهر الإسقاطات ثنائية الأبعاد المتعامدة (طائرات XY و XZ) من خلال ألياف عدسة تمايز واحدة تداخلا كرويا ومقبسا (رؤوس أسهم) على طول الجانب العريض ونتوءات صغيرة متشابكة على طول الجانب القصير (الأسهم). قضبان المقياس = 5 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 7
الشكل 7: صور المجهر ثلاثي الصغر والمجهر متحد البؤر لخلايا ليفية ناضجة من قشرة العدسة. خلايا الألياف للفحص المجهري متحد البؤر ملطخة ب WGA (أخضر) و phalloidin (F-actin ، أحمر). (أ) تحتوي صورة SEM على أليافين ناضجتين متشابكتين مع مجاذيف (علامات نجمية) مزينة بنتوءات صغيرة (أسهم) على طول الجوانب القصيرة للخلايا. هناك أيضا مسافات بادئة صغيرة (رؤوس سهام) على طول الجانب العريض من الخلية. من المحتمل أن تكون هذه هي بقايا النتوءات الكروية والمقبسية. شريط المقياس = 5 ميكرومتر. (B) تحتوي الإسقاطات ثنائية الأبعاد المتعامدة (طائرات XY و XZ) من خلال ألياف عدسة ناضجة واحدة على مجاذيف كبيرة متشابكة (علامات نجمية) ونتوءات صغيرة (أسهم) على طول الجوانب القصيرة للخلايا. تظهر حلقات WGA + الصغيرة (رؤوس الأسهم) ، على غرار المسافات البادئة في صورة SEM ، على طول الجانب العريض من الخلية. لا تحتوي هياكل WGA + هذه على تلطيخ F-actin. يتم إثراء F-actin في الغالب في غشاء الخلية في النتوءات الصغيرة وله نمط تلطيخ شبكي ضعيف في السيتوبلازم. شريط المقياس = 5 ميكرومتر. (C) صورة SEM للألياف الناضجة تظهر العديد من الأخاديد في غشاء الخلية (رؤوس الأسهم) ، حيث تستقر النتوءات من الخلايا المجاورة وتتشابك. شريط المقياس = 2 ميكرومتر. (د) زوج من الألياف الناضجة التي تم فصلها للتو تظهر الأخاديد (رؤوس الأسهم) الملطخة بواسطة WGA. لا تحتوي الأخاديد على إثراء تلطيخ F-actin وتبدو مثل نتوءات تمتد إلى الداخل نحو العصارة الخلوية ، بدلا من التمدد للخارج كهيكل متشابك. شريط المقياس = 5 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

أخيرا ، تتم مقارنة ألياف العدسة النووية الملطخة بصور من مستحضرات SEM. تحافظ هذه الطريقة الجديدة لإصلاح ألياف العدسة النووية وتلطيخها بأمانة على مورفولوجيا ألياف العدسة النووية في مناطق مختلفة من العدسة (الشكل 8). تحتوي خلايا الألياف النووية على نتوءات متشابكة نادرة وأكبر على طول جوانبها القصيرة (الأسهم). تحتوي ألياف العدسة النووية الخارجية على نسيج غشاء خلوي خشن ، كما هو موضح في كل من SEM وصور الخلايا الملطخة. عندما تخضع الخلايا لمزيد من الضغط نحو مركز النواة ، تظهر تداخلات اللسان والأخدود على طول غشاء الخلية (العلامات النجمية) ، والألياف النووية الأعمق لها مورفولوجيا غشاء كروي يمكن تقديره على صورة SEM ومع تلطيخ WGA. لم يعد F-actin مخصب في غشاء الخلية ، ولكنه يشكل شبكة تملأ السيتوبلازم وتمتد بشكل ضعيف إلى النتوءات.

Figure 8
الشكل 8: صور المجهر المجهري أحادي البؤر لخلايا ألياف العدسة النووية. خلايا الألياف للفحص المجهري متحد البؤر ملطخة ب WGA (أخضر) و phalloidin (F-actin ، أحمر). (أ) تكشف صور SEM للألياف النووية من الطبقات الخارجية باتجاه مركز العدسة عن نتوءات متشابكة نادرة وأكبر على الجوانب القصيرة للخلايا (الأسهم). غشاء الخلية خشن في هذه الخلايا ، مع تداخل اللسان والأخدود (العلامات النجمية) ومورفولوجيا الغشاء الكروي في الخلايا الأعمق. (ب) إعادة بناء 3D لمداخن z متحدة البؤر من خلال ألياف العدسة النووية المفردة لها ميزات مماثلة مثل صور SEM ، بما في ذلك النتوءات على طول الجوانب القصيرة (الأسهم) ، وتداخل اللسان والأخدود (العلامات النجمية) ، ومورفولوجيا الغشاء الخام الظاهر مع تلطيخ WGA. يشكل F-actin شبكة تملأ سيتوبلازم الخلية وتمتد بشكل ضعيف إلى النتوءات. قضبان المقياس = 5 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وقد أظهر هذا البروتوكول طرق التثبيت والحفظ والمناعة التي تحافظ بأمانة على مورفولوجيا غشاء 3D للحزم أو خلايا ألياف العدسة المفردة من أعماق مختلفة في العدسة. تتم مقارنة ألياف العدسة الملطخة مع مستحضرات SEM التي تستخدم منذ فترة طويلة لدراسة مورفولوجيا خلايا ألياف العدسة. تظهر النتائج هياكل غشائية قابلة للمقارنة بين كلا المستحضرين. يظل EM هو المعيار الذهبي لدراسة مورفولوجيا الخلية ، لكن وضع العلامات المناعية أكثر صعوبة في عينات SEM لتوطين البروتينات33،34،35 ويتطلب تصوير مجهر إلكتروني. ميزة طريقة التلوين المناعي هذه هي أنه يمكن تسمية أهداف متعددة في وقت واحد ، ويتم جمع الصور على مجهر متحد البؤر.

بينما تحافظ الطريقة على مورفولوجيا الخلية المعقدة ، لا يزال SEM مطلوبا لمقارنة التبادلات بين ألياف العدسة الضابطة والمتغيرة بسبب الطفرة الجينية والشيخوخة والعلاجات الصيدلانية وما إلى ذلك. يخلق المستحضر المناعي مزيجا من الخلايا من قشرة العدسة أو النواة التي يتم توزيعها بشكل عشوائي على الشريحة. وبالتالي ، إذا تم تغيير مورفولوجيا الخلايا ، فقد يكون من الصعب تمييز العمق الذي توجد فيه الخلايا في العدسة قبل التفكك للتلطيخ. في هذه الحالات ، قد يكون من الضروري تشريح العدسة إلى مناطق ذات أهمية بعد التثبيت وتلطيخ حزم أصغر من ألياف العدسة للحصول على دقة مكانية أعلى. يجب أيضا مقارنة نتائج التلوين بصور SEM لضمان حفاظ الألياف المناعية على مورفولوجيا الخلايا المتغيرة.

لقد ثبت لأول مرة أنه يمكن أيضا الحفاظ على خلايا الألياف النووية للتلطيخ باستخدام هذه الطريقة التي تم إنشاؤها حديثا. من المهم إزالة قشرة العدسة قبل تثبيت النواة لأن الاختراق المثبت لا يصل إلى نواة العدسة عند تثبيت العدسةبأكملها 27. تصف طريقة هذا البروتوكول لعزل نواة العدسة الإزالة الميكانيكية لألياف العدسة القشرية الأكثر ليونة. هذا ممكن في عدسات القوارض بسبب نواة العدسة الصلبة والمدمجةللغاية 28،30،36. في الأنواع الأخرى ، تكون نواة العدسة أكثر ليونة وقد تتطلب طرقا أخرى لعزل تلك الخلايا للتلطيخ. في السابق ، تم استخدام طريقة دوامة لإزالة خلايا الألياف القشرية من خط فأر بالضربة القاضية مع نواة عدسة أكثر ليونة لا يمكن عزلها بشكل موثوق عن طريق الإزالة الميكانيكية29.

على الرغم من أننا لم نظهر تلطيخا أوليا للأجسام المضادة في هذه البيانات التمثيلية ، فقد أجرينا سابقا نفس النوع من التلوين بالأجسام المضادة الأولية والأجسام المضادة الثانوية المناسبة22,23. في تجربتنا ، فإن العديد من البروتينات الغشائية لها إشارة مثقوبة ، وبالتالي يوصى باستخدام WGA أو F-actin في الألياف القشرية أو WGA في الألياف النووية لتحديد غشاء الخلية بوضوح لتحديد بروتينات غشاء الخلية بشكل أفضل والتعرف على كل مرحلة من مراحل تمايز الخلايا ونضجها. يجب أن يكون تلطيخ WGA أو F-actin في قناة مرئية (أحمر أو أخضر أو أزرق) للسماح للمراقب بالعثور على الخلايا المناسبة للتصوير باستخدام العدسة بسهولة. يمكن أن يساعد هذا النوع من تلطيخ الغشاء أيضا في تحديد أي ضرر يلحق بالخلايا من عملية التثبيت والتلوين والتركيب لاستبعاد الخلايا التالفة ميكانيكيا. في هذا العمل والأعمال السابقة22,23 ، نادرا ما يتم ملاحظة الخلايا التالفة ميكانيكيا.

تتطلب هذه الطريقة فحصا صبورا ومنهجيا للخلايا للتصوير. يمكن أن يكون الخليط العشوائي من الخلايا شاقا للغاية للوهلة الأولى ، ولكن يمكن عادة العثور على الخلايا الموجودة في الاتجاه الأمثل. يمكن تكييف هذه الطريقة مع ألياف العدسة المعزولة عن الأنواع الأخرى. في العدسات الأكبر حجما ، قد يكون من الممكن استخدام تشريح دقيق لفصل الطبقات المختلفة من الخلايا قبل تلطيخ المناعة. باختصار ، ابتكرت هذه الدراسة طريقة قوية وموثوقة للحفاظ على حزم الألياف أو خلايا الألياف المفردة لدراسة مورفولوجيتها المعقدة وتوطين البروتينات في 3D في هذه الخلايا المتخصصة. يفتح هذا البروتوكول الفريد لتلطيخ الألياف النووية مجالا جديدا للدراسة في الألياف المركزية للعدسة الأقل دراسة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من خلال منحة R01 EY032056 (إلى CC) من المعهد الوطني للعيون. يشكر المؤلفون الدكتورة تيريزا فاسيل وكيمبرلي فاندربول في مرفق سكريبس للأبحاث المجهرية الأساسية لمساعدتهم في صور المجهر الإلكتروني.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100% Triton X-100 FisherScientific BP151-500
60mm plate FisherScientific FB0875713A
16% paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710
10X phosphate buffered saline ThermoFisher 70011-044
1X phosphate buffered saline ThermoFisher 14190136
48-well plate CytoOne CC7672-7548
Cover slips (22 x 40 mm) FisherScientific 12-553-467
Curved tweezers World Precision Instruments 501981
Dissection microscope Carl Zeiss Stereo Discovery V8
Fine tip straight tweezers Electron Microscopy Sciences 72707-01
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides FisherScientific 12-550-15
LSM 800 confocal microscope with Airyscan (63X) and Zen 3.5 Software Carl Zeiss
Nail polish
Normal donkey serum Jackson ImmunoResearch 017-000-121
Phalloidin (rhodamine) ThermoFisher R415
Primary antibody
Scalpel Feather Disposable, steril, No. 11 VWR 76241-186
Secondary antibody
Straight forceps World Precision Instruments 11252-40
Thermo Scientific Nunc MicroWell MiniTrays (dissection tray) FisherScientific 12-565-154
Ultra-fine scissors World Precision Instruments 501778
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1200
Wheat germ agglutinin (fluorescein) Vector Laboratories FL-1021-5

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lovicu, F. J., McAvoy, J. W. Growth factor regulation of lens development. Developmental Biology. 280 (1), 1-14 (2005).
  2. Kuszak, J., Alcala, J., Maisel, H. The surface morphology of embryonic and adult chick lens-fiber cells. The American Journal of Anatomy. 159 (4), 395-410 (1980).
  3. Kuszak, J. R. The ultrastructure of epithelial and fiber cells in the crystalline lens. International Review of Cytology. 163, 305-350 (1995).
  4. Kuszak, J. R., Macsai, M. S., Rae, J. L. Stereo scanning electron microscopy of the crystalline lens. Scanning Electron Microscopy. , 1415-1426 (1983).
  5. Lo, W. K., Harding, C. V. Square arrays and their role in ridge formation in human lens fibers. Journal of Ultrastructure Research. 86 (3), 228-245 (1984).
  6. Taylor, V. L., et al. Morphology of the normal human lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 37 (7), 1396-1410 (1996).
  7. Vrensen, G. F. Aging of the human eye lens-a morphological point of view. Comparative Biochemistry and Physiology. Part A, Physiology. 111 (4), 519-532 (1995).
  8. Vrensen, G. F., Duindam, H. J. Maturation of fiber membranes in the human eye lens. Ultrastructural and Raman microspectroscopic observations. Ophthalmic Research. 27, 78-85 (1995).
  9. Willekens, B., Vrensen, G. The three-dimensional organization of lens fibers in the rabbit. A scanning electron microscopic reinvestigation. Albrecht von Graefe's Archive for Clinical and Experimental Opthalmology. 216 (4), 275-289 (1981).
  10. Willekens, B., Vrensen, G. The three-dimensional organization of lens fibers in the rhesus monkey. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 219 (3), 112-120 (1982).
  11. Zhou, C. J., Lo, W. K. Association of clathrin, AP-2 adaptor and actin cytoskeleton with developing interlocking membrane domains of lens fibre cells. Experimental Eye Research. 77 (4), 423-432 (2003).
  12. Kuwabara, T. The maturation of the lens cell: a morphologic study. Experimental Eye Research. 20 (5), 427-443 (1975).
  13. Weeber, H. A., Eckert, G., Pechhold, W., vander Heijde, R. G. Stiffness gradient in the crystalline lens. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 245 (9), 1357-1366 (2007).
  14. Weeber, H. A., et al. Dynamic mechanical properties of human lenses. Experimental Eye Research. 80 (3), 425-434 (2005).
  15. Weeber, H. A., vander Heijde, R. G. On the relationship between lens stiffness and accommodative amplitude. Experimental Eye Research. 85 (5), 602-607 (2007).
  16. Heys, K. R., Cram, S. L., Truscott, R. J. Massive increase in the stiffness of the human lens nucleus with age: the basis for presbyopia. Molecular Vision. 10, 956-963 (2004).
  17. Heys, K. R., Friedrich, M. G., Truscott, R. J. Presbyopia and heat: changes associated with aging of the human lens suggest a functional role for the small heat shock protein, alpha-crystallin, in maintaining lens flexibility. Aging Cell. 6 (6), 807-815 (2007).
  18. Glasser, A., Campbell, M. C. Biometric, optical and physical changes in the isolated human crystalline lens with age in relation to presbyopia. Vision Research. 39 (11), 1991-2015 (1999).
  19. Pierscionek, B. K. Age-related response of human lenses to stretching forces. Experimental Eye Research. 60 (3), 325-332 (1995).
  20. Biswas, S. K., Lee, J. E., Brako, L., Jiang, J. X., Lo, W. K. Gap junctions are selectively associated with interlocking ball-and-sockets but not protrusions in the lens. Molecular Vision. 16, 2328-2341 (2010).
  21. Lo, W. K., et al. Aquaporin-0 targets interlocking domains to control the integrity and transparency of the eye lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (3), 1202-1212 (2014).
  22. Cheng, C., et al. Tropomyosin 3.5 protects the F-actin networks required for tissue biomechanical properties. Journal of Cell Science. 131 (23), (2018).
  23. Cheng, C., et al. Tropomodulin 1 regulation of actin is required for the formation of large paddle protrusions between mature lens fiber cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (10), 4084-4099 (2016).
  24. Kuszak, J. R. The development of lens sutures. Progress in Retinal and Eye Research. 14 (2), 567-591 (1995).
  25. Bassnett, S., Costello, M. J. The cause and consequence of fiber cell compaction in the vertebrate lens. Experimental Eye Research. 156, 50-57 (2017).
  26. Biswas, S., Son, A., Yu, Q., Zhou, R., Lo, W. K. Breakdown of interlocking domains may contribute to formation of membranous globules and lens opacity in ephrin-A5(-/-) mice. Experimental Eye Research. 145, 130-139 (2016).
  27. Blankenship, T., Bradshaw, L., Shibata, B., Fitzgerald, P. Structural specializations emerging late in mouse lens fiber cell differentiation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (7), 3269-3276 (2007).
  28. Cheng, C., et al. Age-related changes in eye lens biomechanics, morphology, refractive index and transparency. Aging. 11 (24), 12497-12531 (2019).
  29. Cheng, C., et al. EphA2 affects development of the eye lens nucleus and the gradient of refractive index. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 63 (1), 2 (2022).
  30. Cheng, C., Gokhin, D. S., Nowak, R. B., Fowler, V. M. Sequential application of glass coverslips to assess the compressive stiffness of the mouse lens: strain and morphometric analyses. Journal of Visualized Experiments. (111), e53986 (2016).
  31. Forrester, J. V., Dick, A. D., McMenamin, P. G., Roberts, F., Pearlman, E. Anatomy of the eye and orbit. The Eye (Fourth Edition). Saunders, W. B. , 1 (2016).
  32. Cheng, C., Nowak, R. B., Fowler, V. M. The lens actin filament cytoskeleton: Diverse structures for complex functions. Experimental Eye Research. 156, 58-71 (2017).
  33. Goldberg, M. W., Fiserova, J. Immunogold labeling for scanning electron microscopy. Methods in Molecular Biology. 1474, 309-325 (2016).
  34. Goldberg, M. W. High-resolution scanning electron microscopy and immuno-gold labeling of the nuclear lamina and nuclear pore complex. Methods in Molecular Biology. 1411, 441-459 (2016).
  35. Hermann, R., Walther, P., Muller, M. Immunogold labeling in scanning electron microscopy. Histochemistry and Cell Biology. 106 (1), 31-39 (1996).
  36. Gokhin, D. S., et al. Tmod1 and CP49 synergize to control the fiber cell geometry, transparency, and mechanical stiffness of the mouse lens. PLoS One. 7 (11), e48734 (2012).

Tags

التحضير ، تلطيخ التألق المناعي ، الحزم ، خلايا الألياف المفردة ، القشرة ، النواة ، عدسة العين ، العضو الشفاف ، الغرفة الأمامية ، شبكية العين ، الصورة الواضحة ، خلايا الألياف المتخصصة ، المقطع العرضي السداسي ، القطب الأمامي ، القطب الخلفي ، التداخل ، الهياكل المتشابكة ، الخواص الميكانيكية الحيوية ، تقنيات الفحص المجهري الإلكتروني ، الحفاظ ، المناعة ، خلايا ألياف عدسة الماوس ، التوطين التفصيلي للبروتينات ، الخلايا ذات الشكل المعقد
التحضير وتلطيخ التألق المناعي للحزم وخلايا الألياف المفردة من قشرة ونواة عدسة العين
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vu, M. P., Cheng, C. Preparation and … More

Vu, M. P., Cheng, C. Preparation and Immunofluorescence Staining of Bundles and Single Fiber Cells from the Cortex and Nucleus of the Eye Lens. J. Vis. Exp. (196), e65638, doi:10.3791/65638 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter