Summary
Detta protokoll beskriver metoder för att förbereda perifera, mogna och nukleära ögonlinsfiberceller för immunofluorescensfärgning för att studera komplexa cell-till-cell-interdigitationer och membranarkitekturen.
Abstract
Linsen är ett genomskinligt och ellipsoid organ i ögats främre kammare som ändrar form för att finfokusera ljuset på näthinnan för att bilda en tydlig bild. Huvuddelen av denna vävnad består av specialiserade, differentierade fiberceller som har ett hexagonalt tvärsnitt och sträcker sig från linsens främre till bakre poler. Dessa långa och smala celler är tätt motsatta granncellerna och har komplexa interdigitationer längs cellens längd. De specialiserade sammankopplade strukturerna krävs för linsens normala biomekaniska egenskaper och har beskrivits utförligt med hjälp av elektronmikroskopitekniker. Detta protokoll demonstrerar den första metoden för att bevara och immunfärga såväl enskilda som buntar av muslinsfiberceller för att möjliggöra detaljerad lokalisering av proteiner i dessa komplext formade celler. Representativa data visar färgning av de perifera, differentierande, mogna och kärnfibercellerna över alla regioner i linsen. Denna metod kan potentiellt användas på fiberceller isolerade från linser av andra arter.
Introduction
Linsen är en klar och äggformad vävnad i ögats främre kammare som består av två celltyper, epitelceller och fiberceller 1 (figur 1). Det finns ett monolager av epitelceller som täcker linsens främre halvklot. Fiberceller skiljer sig från epitelceller och utgör huvuddelen av linsen. De högspecialiserade fibercellerna genomgår en töjnings-, differentierings- och mognadsprogrammering, markerad av distinkta förändringar i cellmembranmorfologi från linsens periferi till linsens centrum 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 , även känd som linskärnan. Linsens funktion att finfokusera ljus som kommer från olika avstånd på näthinnan beror på dess biomekaniska egenskaper, inklusive styvhet och elasticitet 13,14,15,16,17,18,19. De komplexa interdigitationerna av linsfibrer har antagits20,21 och har nyligen visat sig vara viktiga för linsstyvhet22,23.
Figur 1: Linsanatomiska diagram och representativa svepelektronmikroskopibilder (SEM) från linsfibrer. Teckningen visar en längsgående (främre till bakre från topp till botten) vy av det främre monolagret av epitelceller (skuggade i ljusblått) och en bulkmassa av linsfiberceller (vita). Mitten av linsen (skuggad i rosa) är känd som kärnan och består av mycket komprimerade fiberceller. Till höger visar en tecknad serie med tvärsnitt den långsträckta hexagoncellformen hos linsfibrer som är packade i ett bikakemönster. Fiberceller har två bredsidor och fyra kortsidor. Representativa SEM-bilder längs botten visar de komplexa membraninterdigitationerna mellan linsfiberceller på olika djup av linsen. Från höger har nybildade linsfibrer i linsens periferi små utsprång längs kortsidorna och kulor och hylsor längs bredsidan (röda rutor). Under mognaden utvecklar linsfibrerna stora paddeldomäner som är dekorerade med små utsprång längs kortsidorna (blå lådor). Mogna fiberceller har stora paddeldomäner som illustreras av små utsprång. Dessa sammankopplade domäner är viktiga för linsens biomekaniska egenskaper. Fiberceller i linskärnan har färre små utsprång längs kortsidorna och har komplexa interdigitationer med spont och spår (lila rutor). Cellens bredsidor uppvisar en globulär membranmorfologi. Den tecknade serien modifierades från22,32 och ritades inte i skala. Skalstapel = 3 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Linsen växer genom att lägga till skal av nya fiberceller ovanpå tidigare generationer av fibrer24,25. Fiberceller har en långsträckt, sexkantig tvärsnittsform med två bredsidor och fyra kortsidor. Dessa celler sträcker sig från den främre till den bakre polen av linsen, och beroende på art kan linsfibrerna vara flera millimeter långa. För att stödja strukturen hos dessa långsträckta och smala celler skapar specialiserade interdigitationer längs bred- och kortsidorna sammankopplade strukturer för att bibehålla linsens form och biomekaniska egenskaper. Förändringar i cellmembranform under fibercelldifferentiering och mognad har dokumenterats utförligt genom elektronmikroskopistudier(EM) 2,3,4,5,6,7,8,9,10,20,26,27,28,29 . Nybildade fiberceller har kulor och uttag längs sina breda sidor med mycket små utsprång längs kortsidorna, medan mogna fibrer har sammankopplade utskott och paddlar längs kortsidorna. Kärnfibrer uppvisar spont-och-spår-interdigitationer och klotformig membranmorfologi. Lite är känt om de proteiner som krävs för dessa komplexa sammankopplade membran. Tidigare studier av proteinlokalisering i fiberceller har förlitat sig på linsvävnadssnitt, vilket inte tillåter tydlig visualisering av den komplexa cellarkitekturen.
Detta arbete har skapat och fulländat en ny metod för att fixera enstaka och buntar av linsfiberceller för att bevara den komplexa morfologin och för att möjliggöra immunfärgning för proteiner vid cellmembranet och i cytoplasman. Denna metod bevarar troget cellmembranarkitekturen, jämförbar med data från EM-studier, och möjliggör färgning med primära antikroppar för specifika proteiner. Vi har tidigare immunfärgade kortikala linsfibrer som genomgår differentiering och mognad22,23. I detta protokoll finns också en ny metod för att färga fiberceller från linskärnan. Detta protokoll öppnar dörren för att förstå mekanismerna för bildning och förändringar i membraninterdigitationer under fibercellmognad och linskärnkomprimering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Möss har tagits om hand baserat på ett djurprotokoll som godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee vid Indiana University Bloomington. Mössen som användes för att generera representativa data var kontrolldjur (vildtypsdjur) i C57BL6/J-bakgrunden, honor och 8-12 veckor gamla. Både han- och honmöss kan användas för detta experiment, eftersom det är mycket osannolikt att mössens kön påverkar experimentets resultat.
1. Dissektion och dekapsling av linsen
- Avliva möss enligt National Institutes of Healths "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals" samt djuranvändningsprotokoll som godkänts av institutionen.
OBS: För den aktuella studien avlivades möss genom överdosering av CO2 följt av cervikal luxation i enlighet med ett godkänt djurprotokoll (Indiana University). - Kärna ögonen från mössen med böjd pincett genom att trycka ner vävnaden runt ögonen med ena sidan av pincetten för att förskjuta ögat ur ögonhålan. Stäng sedan pincetten under ögat och lyft för att ta bort ögat från ögonhålan. Överför ögonen till färsk 1x fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) i en dissektionsbricka.
- Klipp av synnerven med en ultrafin sax så nära ögongloben som möjligt. För försiktigt in en rak pincett med fin spets i ögongloben genom synnervens utgång vid ögats bakre del.
- Sätt försiktigt in saxen på samma plats som pincetten i steg 1.3 och börja klippa ett snitt från den bakre mot hornhinnan-sklerala korsningen.
OBS: Gnagarlinser upptar ~30 % av ögonen. Oavsiktlig skada uppstår om pincetten eller saxen förs in för djupt i ögat. - Fortsätt att skära längs korsningen mellan hornhinnan och skleral tills minst hälften av korsningen har separerats.
- Använd en pincett för att försiktigt trycka på hornhinnan så att linsen kan komma ut genom snittet som gjordes med steg 1.4 och 1.5.
- Ta försiktigt bort alla stora bitar av vävnad från linsen med en rak pincett med fin spets. Inspektera linsen för att hitta ekvatorialregionen.
- Stick hål i linsen ytligt med en rak pincett med fin spets och ta sedan bort linskapseln. Massan av linsfiberceller kommer att förbli intakt, och linsepitelmonoskiktet kommer att förbli fäst vid linskapseln. Kassera linskapseln.
2. Lins enkelfibercellfärgning
- Överför linsfibercellmassan till en brunnsplatta med 500 μL nygjord 1 % paraformaldehydlösning (PFA; i 1x PBS) och inkubera proverna vid 4 °C över natten med försiktig nutation (Figur 2A).
OBS: Volymerna för de angivna lösningarna är optimerade för 48-hålsplattor. Om brunnsplatta eller rör av annan storlek används, justera volymerna på lösningarna därefter. Fixering, blockering och tvättning (1x PTX, 0,1% Triton X-100 i 1x PBS) lösningar gjordes med 10x PBS och dubbelt destillerat vatten (ddH2O) till en slutlig koncentration av 1x PBS. - Överför linsfibercellerna till en 60 mm skål med 1 % PFA. Använd en vass skalpell för att dela bollen av fiberceller på mitten längs dess främre-bakre axel (Figur 2B). Skär halvorna på mitten igen längs samma axel för att få fjärdedelar.
OBS: Den främre-bakre axeln känns lätt igen på fibercellernas riktning i vävnadsmassan. - Använd en rak pincett för att ta bort kärnområdet från linsfibercellens kvarter (Figur 2C).
OBS: Linskärnområdet är styvt i gnagarlinser, och mitten av linsen kommer lätt att separeras från de mjukare kortikala fibrerna. - Efterfixera fjärdedelarna av linscortex-området i 200 μL 1 % PFA i 15 minuter vid rumstemperatur (RT) med försiktig skakning (300 rpm på en plattskakare).
- Tvätta vävnadsfjärdedelarna två gånger i 750 μl 1x PBS i 5 minuter vardera med lätt skakning vid RT.
- Blockera proverna med 200 μL blockerande lösning (5 % serum, 0,3 % Triton X-100, 1 x PBS) i 1 timme vid RT med lätt skakning.
Anmärkning: För representativa data i detta protokoll färgades proverna inte med primära eller sekundära antikroppar. Efter blockeringssteget inkuberades proverna med vetegroddagglutinin (WGA; 1:100) och falloidin (1:100) (se materialtabell) i 3 timmar vid RT med försiktig skakning och skydd mot ljus. Primär antikroppsfärgning har påvisats i tidigare publikationer22,23. - Inkubera med 100 μl primär antikroppslösning över natten vid 4 °C under lätt omskakning.
OBS: Antikropparna späds i blockerande lösning. Jämfört med objektglas med vävnadssnitt finns det fler celler i denna typ av preparat. Koncentrationerna av primära antikroppar bör ökas för att ge tillräckligt med antikroppar för att färga fler celler. En fördubbling av antikroppskoncentrationen jämfört med vad som används på vävnadssnitt rekommenderas. Detsamma gäller sekundära antikroppar. - Tvätta vävnadsfjärdedelarna tre gånger med 1x PTX (0,1 % Triton X-100, 1x PBS) i 5 minuter vardera vid RT med lätt skakning.
- Inkubera fibercellerna med 100 μL sekundär antikropp/färglösning i 3 timmar vid RT med försiktig skakning. Skydda proverna från ljus under detta och efterföljande steg.
OBS: WGA, falloidin och andra fluorescerande färgämnen kan tillsättas till den sekundära antikroppslösningen för samtidig märkning av cellmembranet, cytoskelettet eller andra organeller samtidigt som den primära antikroppen märks. - Tvätta fibercellerna fyra gånger med 1x PTX i 5 min vardera vid RT med lätt skakning.
- Tillsätt en droppe eller 50 μl monteringsmedia på ett plusladdat objektglas innan vävnadsfjärdedelarna överförs till objektglaset.
- Använd en pincett för att försiktigt separera fibercellerna från varandra och försök att begränsa överlappningen av cellbuntarna.
- Applicera försiktigt ett #1.5 täckglas ovanpå sample i monteringsmedia. Monteringsmediet ska spridas till kanten av täckglaset; Om detta inte inträffar, lägg till lite extra monteringsmedia på kanten av täckglaset. Aspirera bort överflödigt monteringsmedia runt kanten på täckglaset och använd nagellack för att täta kanterna på täckglaset på objektglaset.
OBS: Alla typer av monteringsmedier som är formulerade för konfokalmikroskopi kan användas för dessa experiment.
3. Linskärna enkelfibercellfärgning
- Slutför dissektionen som beskrivs i avsnitt 1.
- Ta bort de kortikala fibrerna mekaniskt från linsfibercellernas kula och lämna linskärnan genom att försiktigt överföra fibercellmassan till våta, handskbeklädda fingertoppar och försiktigt rulla vävnadsmassan.
OBS: I muslinser är rullning av bollen av linsfiberceller mellan handskbeklädda fingertoppar en effektiv metod för att avlägsna de kortikala fibercellerna från den hårda linskärnan 28,30. För linser där denna mekaniska metod inte är effektiv kan noggrann dissektion eller en vortexingmetod29 användas för att avlägsna de kortikala fibercellerna. - Överför linskärnan till nygjord 1 % PFA-lösning i en brunnsplatta och inkubera över natten vid 4 °C med lätt skakning.
- Överför provet till en 60 mm skål med 1 % PFA och använd en vass skalpell för att dela linskärnan längs den främre-bakre axeln. Halvera vävnadsproverna igen för att producera kärnfjärdedelar.
- Följ processen som beskrivs i steg 2.4-2.13 för immunfärgning och sample montering.
Figur 2: Grafisk sammanfattning som beskriver beredning och immunfärgning av linsfiberceller . (A) Denna platta med 48 brunnar har färgkodats med kolonn för att demonstrera en provplatteinställning för de beskrivna metoderna, vilket möjliggör enkel överföring av prover mellan de olika immunfärgningsstegen genom skonsam hantering med pincett. Även om representativa data för detta protokoll inte inkuberas med en primär antikropp, innehåller diagrammet en kolumn för primär antikroppsinkubation, och brunnarna för tvättning kan återanvändas efter att använda tvättbuffertar avlägsnats genom aspiration. (B) Efter fixering av linsfibercellmassan delas vävnaden längs den främre-bakre axeln (röda streckade linjer) för att bevara cellernas ursprungliga struktur. När vävnadsmassan har halverats roteras proverna och halvorna delas upp i fjärdedelar längs den främre-bakre axeln (röda streckade linjer). (C) Att ta bort linskärnområdet (i rosa) görs enkelt med pincett för att gräva ut den täta centrala vävnaden från de kortikala fibercellerna (i blått). Tecknade diagram skapades delvis med hjälp av BioRender.com och ritades inte i skala. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Linsfiberceller framställs från linsbarken (differentierande fibrer och mogna fibrer) och kärnan, och cellerna färgas med falloidin för F-aktin och WGA för cellmembranet. En blandning av knippen av celler eller enstaka linsfibrer (figur 3) observeras och avbildas. Från linsbarken finns två typer av celler (figur 3A). Differentierande fiberceller i linsens periferi är raka, med mycket små utsprång längs kortsidorna. När cellen differentierar blir fibercellerna vågiga med små sammankopplade utsprång. Vidare, längs mognadsprocessen, utvecklar fiberceller stora paddlar dekorerade med små sammankopplade utsprång. Linskärnan är mycket kompakt och styv i muslinser och isoleras genom mekaniskt avlägsnande av den mjukare linsbarken före fixering och färgning av kärnlinsfibrerna. Från linskärnan finns buntar av linsfibrer som är mindre i diameter och har fina membranstrukturer som inte lätt kan ses på en bild med låg förstoring.
I 3D-rekonstruktioner med hög förstoring av linsfiberceller från olika regioner av linsen (Figur 3B) finner man att F-aktin och WGA är starkt samlokaliserade vid cellmembranet i differentierande och mogna fiberceller. F-aktin anrikas i de sammankopplade utskotten längs cellmembranet i differentierande och mogna fibrer (figur 3B, pilspetsar). Mogna fiberceller utvecklar stora sammankopplade paddlar (figur 3B, asterisker). WGA-färgningen är inte helt samlokaliserad med F-aktinsignalen, särskilt i den mogna fibercellen, vilket tyder på att det kortikala aktinnätverket inte stöder alla mindre strukturer längs cellmembranet. Oväntat visar det sig att F-aktinnätverket finns i cytoplasman hos kärnfiberceller. Medan F-aktinsignalen sträcker sig in i utsprången (Figur 3B, pilar) längs kärnfibercellmembranet, är aktinnätverket inte längre anrikat nära cellmembranet eller inom utsprången. Kärnfibercellens morfologi saknar paddlar, förutom en minskning av organisationen och frekvensen av utsprång.
Figur 3: Konfokala bilder av buntar (låg förstoring) och enstaka (hög förstoring) bilder av fiberceller från olika delar av linsen. Cellerna färgas med WGA (cellmembran, gröna), falloidin (F-aktin, röda) och DAPI (kärnor, blå). (A) I dessa preparat finns ofta buntar av linsfiberceller från olika regioner. I de kortikala preparaten finns differentierande och mogna fiberceller. Dessa olika celler har distinkta morfologier, vilket gör det enkelt att identifiera. I proverna från linskärnan finns fibercellsbuntar såväl som dissocierade fibrer. Skalstapel = 50 μm. (B) Z-stackar genom enstaka differentierande, mogna och kärnfiberceller samlas in, och 3D-rendering används för att rekonstruera de bilder som visas. De differentierande och mogna fibrerna har många små utsprång längs sina kortsidor (pilspetsarna markerar utvalda). Dessa små utsprång är berikade för F-aktin. Den mogna fibern har också stora sammankopplade paddeldomäner (asterisker). Kärnfibrerna har små membranfickor och gropar färgade av WGA och behåller några utsprång längs sina kortsidor (pilar). Överraskande nog är F-aktinnätverket nu distribuerat i cellcytoplasman utan anrikade signaler vid cellmembranet. F-aktinnätverket sträcker sig till små utsprång. Skalstapel = 5 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
När fibercellerna undersöks är det viktigt att notera cellernas orientering för att undvika förvirring om vilken typ av cell som observeras. Z-stackar samlas in genom cellerna, och sedan används 3D-rekonstruktion för att titta på de ortogonala 2D-projektionerna i XY-, XZ- och YZ-planen. På grund av cellernas slumpmässiga orientering i detta preparat är det möjligt att ha celler som inte ligger helt plant på glasskivan (figur 4). Alla celler i denna representativa bild är mogna linsfibrer, men varje cell har ett drastiskt annorlunda utseende i XY-planet. Cellen pseudofärgad i grönt är orienterad med bredsidan uppåt med synliga paddlar och utsprång, medan cellen pseudofärgad i rosa ligger med kortsidan uppåt. Detta är lättare att visualisera i XZ-planet, som visar de vinkelräta orienteringarna av de två cellerna som visas i XY-planet. Undersökning av YZ-planet visar tydligt paddlarna av den mogna fibern som är färgad rosa från XY-planet.
Figur 4: Ortogonala 2D-projektioner (XY-, XZ- och YZ-plan) av 3D-konfokala z-stackar genom en grupp av enstaka mogna linsfiberceller färgade med falloidin för F-aktin. Två celler är pseudofärgade i rosa eller grönt för identifiering på varje plan. I XY-planet ligger den rosa cellen med kortsidan uppåt, medan den gröna cellen ligger platt med bredsidan uppåt. I XZ-planet observeras att den rosa cellen lutar i orientering, medan den gröna cellen är parallell med glasglaset. I YZ-planet observeras paddlarna och utsprången av de rosa cellerna, vilket bekräftar att denna cell är en mogen fibercell. Skalstapel = 5 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Eftersom fibrer är ca 2-4 μm i tjocklek25,31 är det möjligt att genom insamling av z-stackar se cellytan eller ett plan genom cytoplasman (figur 5). Detta fungerar bäst på celler som är nästan parallella med täckglaset, med cellens bredsida uppåt. Cellytan i denna mogna fibercell kan uppskattas genom att observera WGA-signalen (Figur 5A). XZ-planet visar tydligt att detta XY-plan ligger längs cellens bredsida. Små WGA+-punkteringar längs membranet tyder på en grov cellytemorfologi. De små utsprången längs kortsidan i lågexponerade bilder visar en kraftigt berikad F-aktinsignal. Vid högre exponering, där F-aktinsignalen i utskotten är mättad, observeras ett fint retikulerat F-aktinnätverk över cellmembranet (asterisker). När ett XY-plan betraktas genom cytoplasman i den mogna fibern (figur 5B), observeras WGA-färgning huvudsakligen längs cellmembranet. I likhet med vad som ses på cellytan är F-aktin anrikat i utskotten längs kortsidorna, med ett retikulerat cytoplasmatiskt F-aktinnätverk synligt vid högre exponering (asterisker). Vårt tidigare arbete har visat färgning för membranproteiner i XY-plan genom cellcytoplasman22,23, men med denna metod är det också möjligt att lokalisera proteiner längs bredsidans cellyta.
Figur 5: Ortogonala 2D-projektioner (XY- och XZ-plan) av 3D-konfokala z-stackar genom en enda mogen fibercell färgad med WGA (grön) och falloidin (F-aktin, röd). (A) Projektioner från cellytan längs bredsidan visar WGA längs cellmembranet, och WGA:s puncta tyder på att membranet inte är helt slätt. F-aktin anrikas i utskotten längs kortsidorna, och en högexponerad bild av F-aktinfärgningen avslöjar ett retikulerat nätverk längs cellmembranet (asterisker). (B) Ett annat plan genom cytoplasman i samma cell visar WGA längs cellmembranet och ramar in cellen. F-aktin bildar ett retikulerat nätverk genom cytoplasman (asterisker) och anrikas kraftigt i utskotten längs cellmembranet. Skalstaplar = 5 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Därefter jämförs bilder av linsfibrer från skannings-EM (SEM) och färgningsexperiment. SEM-experiment utförs som tidigare beskrivits29, och bilder tas sekventiellt från mitten av provet till periferin. Först undersöks differentierande linsfibrer med små utsprång (Figur 6, pilar) längs kortsidorna och en kula och hylsa (pilspetsar) längs deras bredsidor. I likhet med SEM-bilden (Figur 6A), i ett knippe differentierande fibrer orienterade längs sina kortsidor, är kul-och-hylsa-interdigitationerna stora utsprång och spår som sträcker sig längs cellernas bredsida (Figur 6B, pilspetsar). En hylsa hittas (Figur 6C, pilspetsar) när cellen i de ortogonala 2D-projektionerna XY och XZ ses i enstaka differentierande linsfibrer. Små sammankopplade utsprång längs kortsidorna är också troget bevarade i dessa färgade linsfiberceller jämfört med de i SEM-bilden (pilar). Därefter undersöks morfologin hos mogna fiberceller (Figur 7). I SEM-bilden och den färgade cellen finns det små gropar längs cellernas bredsida (Figur 7A,B, pilspetsar). Förmodligen är dessa rester av de kul-och-hylsa-interdigitationer som krymper under mognadsprocessen. De stora paddlarna (asteriskerna) dekorerade med små sammankopplade utsprång (pilar) är jämförbara mellan cellerna i SEM och den färgade mogna fibern. Cellerna i SEM-bilden har också tydliga spår där ett sammankopplat utskott dockar i cellmembranet (Figur 7C, pilspetsar). Dessa spår kan också ses i dessa färgade celler och fylls av WGA-signalen (Figur 7D, pilspetsar). Spåren kan se ut som utsprång som går inåt mot cellcytoplasman istället för att skjuta ut utåt från cellmembranet, och ofta är endast WGA-färgning synlig i spåren som har mycket lite, om någon, F-aktinfärgningssignal.
Figur 6: SEM- och konfokalmikroskopbilder av differentierande fiberceller från linsbarken. Fiberceller för konfokalmikroskopi färgas med WGA (grönt) och falloidin (F-aktin, rött). (A) SEM av ett knippe differentierande linsfibrer visar kul-och-hylsinterdigitationer (pilspetsar) längs cellernas bredsida med små sammankopplade utsprång (pilar) längs cellernas kortsidor. (B) Konfokala bilder av ett knippe differentierande fibrer avbildade från kortsidorna visar stora kul-och-hylsa-interdigitationer längs cellernas bredsidor (pilspetsar). (C) Ortogonala 2D-projektioner (XY- och XZ-plan) genom en enda differentierande linsfiber visar en kul-och-hylsa-interdigitation (pilspetsar) längs bredsidan och små sammankopplade utsprång längs kortsidan (pilar). Skalstaplar = 5 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: SEM- och konfokalmikroskopbilder av mogna fiberceller från linsbarken. Fiberceller för konfokalmikroskopi färgas med WGA (grönt) och falloidin (F-aktin, rött). (A) SEM-bilden har två sammankopplade mogna fibrer med paddlar (asterisker) dekorerade med små utsprång (pilar) längs cellernas kortsidor. Det finns också små fördjupningar (pilspetsar) längs cellens bredsida. Dessa är möjligen de krympande resterna av kul- och hylsutsprång. Skalstapel = 5 μm. (B) Ortogonala 2D-projektioner (XY- och XZ-plan) genom en enda mogen linsfiber har sammankopplade stora paddlar (asterisker) och små utsprång (pilar) längs cellernas kortsidor. Små WGA+-ringar (pilspetsar), som liknar fördjupningarna i SEM-bilden, ses längs cellens bredsida. Dessa WGA+-strukturer har ingen F-aktinfärgning. F-aktin anrikas till största delen vid cellmembranet i de små utskotten och har ett svagt retikulerat färgningsmönster i cytoplasman. Skalstapel = 5 μm. (C) SEM-bild av de mogna fibrerna som visar många spår i cellmembranet (pilspetsar), där utsprång från de intilliggande cellerna vilar och låser sig. Skalstreck = 2 μm. (D) Ett par mogna fibrer som just separerats och som visar spår (pilspetsar) färgade av WGA. Spåren har ingen anrikning av F-aktinfärgning och ser ut som utsprång som sträcker sig inåt mot cytosolen, snarare än sträcker sig utåt som en sammankopplad struktur. Skalstapel = 5 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Slutligen jämförs de färgade kärnlinsfibrerna med bilder från SEM-preparat. Denna nya metod för att fixera och färga kärnlinsfibrer bevarar troget morfologin hos kärnlinsfibrer i olika delar av linsen (figur 8). Kärnfiberceller har sällsynta och större sammankopplade utsprång längs sina kortsidor (pilar). De yttersta kärnlinsfibrerna har en grov cellmembranstruktur, vilket ses i både SEM och de färgade cellbilderna. När cellerna genomgår ytterligare komprimering mot kärnans centrum uppträder tung-och-spår-interdigitationer längs cellmembranet (asterisker), och de innersta kärnfibrerna har en klotformig membranmorfologi som kan uppskattas på SEM-bilden och med WGA-färgning. F-aktin anrikas inte längre vid cellmembranet, utan bildar ett nätverk som fyller cytoplasman och sträcker sig svagt in i utskotten.
Figur 8: SEM- och konfokalmikroskopbilder av kärnlinsfiberceller. Fiberceller för konfokalmikroskopi färgas med WGA (grönt) och falloidin (F-aktin, rött). (A) SEM-bilder av kärnfibrer från de yttersta lagren mot linsens centrum avslöjar sällsynta och större sammankopplade utsprång på cellernas kortsidor (pilar). Cellmembranet är grovt i dessa celler, med spont-och-spår-interdigitationer (asterisker) och klotformig membranmorfologi i de innersta cellerna. (B) 3D-rekonstruktioner av konfokala z-stackar genom enstaka kärnlinsfibrer har jämförbara egenskaper som SEM-bilderna, inklusive utsprång längs kortsidorna (pilar), spont-och-spår-interdigitationer (asterisker) och den grova membranmorfologi som är uppenbar med WGA-färgning. F-aktin bildar ett nätverk som fyller cellcytoplasman och svagt sträcker sig in i utskotten. Skalstaplar = 5 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll har demonstrerat fixerings-, konserverings- och immunfärgningsmetoder som troget bevarar 3D-membranmorfologin hos buntar eller singulära linsfiberceller från olika djup i linsen. De färgade linsfibrerna jämförs med SEM-preparat som länge har använts för att studera linsfibercellernas morfologi. Resultaten visar jämförbara membranstrukturer mellan de båda preparaten. EM är fortfarande guldstandarden för att studera cellmorfologi, men immunmärkning är mer utmanande i SEM-prover för lokalisering av proteiner33,34,35 och kräver att ett elektronmikroskop avbildas. Fördelen med denna immunfärgningsmetod är att flera mål kan märkas samtidigt, och bilder samlas in i ett konfokalmikroskop.
Även om metoden bevarar den komplexa cellmorfologin, krävs SEM fortfarande för att jämföra interdigitationer mellan kontroll- och förändrade linsfibrer på grund av genetisk mutation, åldrande, läkemedelsbehandlingar etc. Immunfärgningspreparatet skapar en blandning av celler från linsens cortex eller kärna som är slumpmässigt fördelade på objektglaset. Således, om cellernas morfologi ändras, kan det vara svårare att urskilja på vilket djup cellerna var placerade i linsen före dissociation för färgning. I dessa fall kan det vara nödvändigt att ytterligare dissekera linsen i intressanta områden efter fixering och färgning av mindre buntar av linsfibrer för högre rumslig noggrannhet. Färgningsresultaten bör också jämföras med SEM-bilder för att säkerställa att de immunfärgade fibrerna bevarar morfologin hos de förändrade cellerna.
Det har för första gången visats att kärnfiberceller även kan bevaras för färgning med denna nyskapade metod. Det är viktigt att ta bort linsbarken innan fixering av kärnan eftersom fixativ penetration inte når linskärnan när hela linsenfixeras 27. Detta protokolls metod för att isolera linskärnan beskriver det mekaniska avlägsnandet av mjukare kortikala linsfibrer. Detta är möjligt i gnagarlinser på grund av den mycket hårda och kompakta linskärnan 28,30,36. Hos andra arter är linskärnan mjukare och kan kräva andra metoder för att isolera dessa celler för färgning. Tidigare användes en virvelmetod för att avlägsna kortikala fiberceller från en knockout-muslinje med en mjukare linskärna som inte kunde isoleras på ett tillförlitligt sätt genom mekanisk borttagning29.
Även om vi inte kunde påvisa primär antikroppsfärgning i dessa representativa data, har vi tidigare utfört samma typ av färgning med primära antikroppar och lämpliga sekundära antikroppar22,23. Enligt vår erfarenhet har många av membranproteinerna en punkterad signal, och därför rekommenderas användning av WGA eller F-aktin i kortikala fibrer eller WGA i kärnfibrer för att tydligt avgränsa cellmembranet för att bättre lokalisera cellmembranproteiner och känna igen varje steg av celldifferentiering och mognad. WGA- eller F-aktinfärgningen bör vara i en synlig kanal (röd, grön eller blå) så att observatören enkelt kan hitta lämpliga celler för avbildning med hjälp av okularet. Denna typ av membranfärgning kan också hjälpa till att identifiera eventuella skador på cellerna från fixerings-, färgnings- och monteringsprocessen för att utesluta mekaniskt skadade celler. I detta och tidigare arbeten22,23 observeras sällan mekaniskt skadade celler.
Denna metod kräver tålmodig och systematisk undersökning av celler för avbildning. Den slumpmässiga blandningen av celler kan vara ganska skrämmande vid första anblicken, men celler som ligger i optimal orientering kan vanligtvis hittas. Denna metod skulle kunna anpassas för linsfibrer som isolerats från andra arter. I större linser kan det vara möjligt att använda noggrann dissektion för att separera de olika celllagren före immunfärgning. Sammanfattningsvis har denna studie skapat en robust och tillförlitlig metod för att bevara buntar av fibrer eller enstaka fiberceller för att studera deras komplexa morfologi och lokalisera proteiner i 3D i dessa specialiserade celler. Detta unika protokoll för kärnfiberfärgning öppnar ett nytt studieområde i de mindre väl studerade centrala fibrerna i linsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av anslag R01 EY032056 (till CC) från National Eye Institute. Författarna tackar Dr. Theresa Fassel och Kimberly Vanderpool vid Scripps Research Core Microscopy Facility för deras hjälp med elektronmikroskopbilderna.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% Triton X-100 | FisherScientific | BP151-500 | |
| 60mm plate | FisherScientific | FB0875713A | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 10X phosphate buffered saline | ThermoFisher | 70011-044 | |
| 1X phosphate buffered saline | ThermoFisher | 14190136 | |
| 48-well plate | CytoOne | CC7672-7548 | |
| Cover slips (22 x 40 mm) | FisherScientific | 12-553-467 | |
| Curved tweezers | World Precision Instruments | 501981 | |
| Dissection microscope | Carl Zeiss | Stereo Discovery V8 | |
| Fine tip straight tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72707-01 | |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | FisherScientific | 12-550-15 | |
| LSM 800 confocal microscope with Airyscan (63X) and Zen 3.5 Software | Carl Zeiss | ||
| Nail polish | |||
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Phalloidin (rhodamine) | ThermoFisher | R415 | |
| Primary antibody | |||
| Scalpel Feather Disposable, steril, No. 11 | VWR | 76241-186 | |
| Secondary antibody | |||
| Straight forceps | World Precision Instruments | 11252-40 | |
| Thermo Scientific Nunc MicroWell MiniTrays (dissection tray) | FisherScientific | 12-565-154 | |
| Ultra-fine scissors | World Precision Instruments | 501778 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Wheat germ agglutinin (fluorescein) | Vector Laboratories | FL-1021-5 |
References
- Lovicu, F. J., McAvoy, J. W. Growth factor regulation of lens development. Developmental Biology. 280 (1), 1-14 (2005).
- Kuszak, J., Alcala, J., Maisel, H. The surface morphology of embryonic and adult chick lens-fiber cells. The American Journal of Anatomy. 159 (4), 395-410 (1980).
- Kuszak, J. R. The ultrastructure of epithelial and fiber cells in the crystalline lens. International Review of Cytology. 163, 305-350 (1995).
- Kuszak, J. R., Macsai, M. S., Rae, J. L. Stereo scanning electron microscopy of the crystalline lens. Scanning Electron Microscopy. , 1415-1426 (1983).
- Lo, W. K., Harding, C. V. Square arrays and their role in ridge formation in human lens fibers. Journal of Ultrastructure Research. 86 (3), 228-245 (1984).
- Taylor, V. L., et al.
- Vrensen, G. F. Aging of the human eye lens-a morphological point of view. Comparative Biochemistry and Physiology. Part A, Physiology. 111 (4), 519-532 (1995).
- Vrensen, G. F., Duindam, H. J. Maturation of fiber membranes in the human eye lens. Ultrastructural and Raman microspectroscopic observations. Ophthalmic Research. 27, 78-85 (1995).
- Willekens, B., Vrensen, G. The three-dimensional organization of lens fibers in the rabbit. A scanning electron microscopic reinvestigation. Albrecht von Graefe's Archive for Clinical and Experimental Opthalmology. 216 (4), 275-289 (1981).
- Willekens, B., Vrensen, G. The three-dimensional organization of lens fibers in the rhesus monkey. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 219 (3), 112-120 (1982).
- Zhou, C. J., Lo, W. K. Association of clathrin, AP-2 adaptor and actin cytoskeleton with developing interlocking membrane domains of lens fibre cells. Experimental Eye Research. 77 (4), 423-432 (2003).
- Kuwabara, T. The maturation of the lens cell: a morphologic study. Experimental Eye Research. 20 (5), 427-443 (1975).
- Weeber, H. A., Eckert, G., Pechhold, W., vander Heijde, R. G.
- Weeber, H. A., et al. Dynamic mechanical properties of human lenses. Experimental Eye Research. 80 (3), 425-434 (2005).
- Weeber, H. A., vander Heijde, R. G. On the relationship between lens stiffness and accommodative amplitude. Experimental Eye Research. 85 (5), 602-607 (2007).
- Heys, K. R., Cram, S. L., Truscott, R. J. Massive increase in the stiffness of the human lens nucleus with age: the basis for presbyopia. Molecular Vision. 10, 956-963 (2004).
- Heys, K. R., Friedrich, M. G., Truscott, R. J. Presbyopia and heat: changes associated with aging of the human lens suggest a functional role for the small heat shock protein, alpha-crystallin, in maintaining lens flexibility. Aging Cell. 6 (6), 807-815 (2007).
- Glasser, A., Campbell, M. C. Biometric, optical and physical changes in the isolated human crystalline lens with age in relation to presbyopia. Vision Research. 39 (11), 1991-2015 (1999).
- Pierscionek, B. K. Age-related response of human lenses to stretching forces. Experimental Eye Research. 60 (3), 325-332 (1995).
- Biswas, S. K., Lee, J. E., Brako, L., Jiang, J. X., Lo, W. K. Gap junctions are selectively associated with interlocking ball-and-sockets but not protrusions in the lens. Molecular Vision. 16, 2328-2341 (2010).
- Lo, W. K., et al. Aquaporin-0 targets interlocking domains to control the integrity and transparency of the eye lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (3), 1202-1212 (2014).
- Cheng, C., et al. Tropomyosin 3.5 protects the F-actin networks required for tissue biomechanical properties. Journal of Cell Science. 131 (23), (2018).
- Cheng, C., et al. Tropomodulin 1 regulation of actin is required for the formation of large paddle protrusions between mature lens fiber cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (10), 4084-4099 (2016).
- Kuszak, J. R.
- Bassnett, S., Costello, M. J. The cause and consequence of fiber cell compaction in the vertebrate lens. Experimental Eye Research. 156, 50-57 (2017).
- Biswas, S., Son, A., Yu, Q., Zhou, R., Lo, W. K. Breakdown of interlocking domains may contribute to formation of membranous globules and lens opacity in ephrin-A5(-/-) mice. Experimental Eye Research. 145, 130-139 (2016).
- Blankenship, T., Bradshaw, L., Shibata, B., Fitzgerald, P. Structural specializations emerging late in mouse lens fiber cell differentiation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (7), 3269-3276 (2007).
- Cheng, C., et al. Age-related changes in eye lens biomechanics, morphology, refractive index and transparency. Aging. 11 (24), 12497-12531 (2019).
- Cheng, C., et al. EphA2 affects development of the eye lens nucleus and the gradient of refractive index. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 63 (1), 2 (2022).
- Cheng, C., Gokhin, D. S., Nowak, R. B., Fowler, V. M. Sequential application of glass coverslips to assess the compressive stiffness of the mouse lens: strain and morphometric analyses. Journal of Visualized Experiments. (111), e53986 (2016).
- Forrester, J. V., Dick, A. D., McMenamin, P. G., Roberts, F., Pearlman, E. Anatomy of the eye and orbit. The Eye (Fourth Edition). Saunders, W. B. , 1 (2016).
- Cheng, C., Nowak, R. B., Fowler, V. M. The lens actin filament cytoskeleton: Diverse structures for complex functions. Experimental Eye Research. 156, 58-71 (2017).
- Goldberg, M. W., Fiserova, J. Immunogold labeling for scanning electron microscopy. Methods in Molecular Biology. 1474, 309-325 (2016).
- Goldberg, M. W. High-resolution scanning electron microscopy and immuno-gold labeling of the nuclear lamina and nuclear pore complex. Methods in Molecular Biology. 1411, 441-459 (2016).
- Hermann, R., Walther, P., Muller, M. Immunogold labeling in scanning electron microscopy. Histochemistry and Cell Biology. 106 (1), 31-39 (1996).
- Gokhin, D. S., et al. Tmod1 and CP49 synergize to control the fiber cell geometry, transparency, and mechanical stiffness of the mouse lens. PLoS One. 7 (11), e48734 (2012).
