Summary
Denne protokol beskriver metoder til fremstilling af perifere, modne og nukleare øjenlinsefiberceller til immunofluorescensfarvning for at studere komplekse celle-til-celle-interdigitationer og membranarkitekturen.
Abstract
Linsen er et gennemsigtigt og ellipsoid organ i øjets forreste kammer, der ændrer form for at finfokusere lys på nethinden for at danne et klart billede. Hovedparten af dette væv består af specialiserede, differentierede fiberceller, der har et sekskantet tværsnit og strækker sig fra de forreste til de bageste poler af linsen. Disse lange og tynde celler er tæt imod naboceller og har komplekse interdigitationer langs cellens længde. De specialiserede sammenlåsende strukturer er nødvendige for linsens normale biomekaniske egenskaber og er blevet grundigt beskrevet ved hjælp af elektronmikroskopiteknikker. Denne protokol demonstrerer den første metode til at bevare og immunbelette ental samt bundter af muselinsefiberceller for at muliggøre detaljeret lokalisering af proteiner i disse komplekst formede celler. De repræsentative data viser farvning af de perifere, differentierende, modne og nukleare fiberceller på tværs af alle områder af linsen. Denne metode kan potentielt anvendes på fiberceller isoleret fra linser af andre arter.
Introduction
Linsen er et klart og ovoid væv i øjets forreste kammer, der består af to celletyper, epitel- og fiberceller 1 (figur 1). Der er et monolag af epitelceller, der dækker linsens forreste halvkugle. Fiberceller er differentieret fra epitelceller og udgør hovedparten af linsen. De højt specialiserede fiberceller gennemgår en forlængelse, differentiering og modningsprogrammering, præget af forskellige ændringer i cellemembranmorfologi fra linseperiferien til linsecentret 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 , også kendt som linsekernen. Linsens funktion til finfokuslys, der kommer fra forskellige afstande på nethinden, afhænger af dets biomekaniske egenskaber, herunder stivhed og elasticitet 13,14,15,16,17,18,19. De komplekse interdigitationer af linsefibre er blevet antaget 20,21 og for nylig vist sig at være vigtige for linsestivhed 22,23.
Figur 1: Linseanatomidiagrammer og repræsentative scanningelektronmikroskopibilleder (SEM) fra linsefibre. Tegneserien viser et langsgående (forreste til bageste fra top til bund) billede af det forreste monolag af epitelceller (skraveret i lyseblå) og en bulkmasse af linsefiberceller (hvid). Midten af linsen (skraveret i pink) er kendt som kernen og består af stærkt komprimerede fiberceller. Til højre afslører en tegneserie med tværsnit den aflange sekskantcelleform af linsefibre, der er pakket ind i et bikagemønster. Fiberceller har to brede sider og fire korte sider. Repræsentative SEM-billeder langs bunden viser de komplekse membraninterdigitationer mellem linsefiberceller i forskellige dybder af linsen. Fra højre har nydannede linsefibre i linseperiferien små fremspring langs de korte sider og kugler langs bredsiden (røde bokse). Under modning udvikler linsefibre store padledomæner, der er dekoreret med små fremspring langs de korte sider (blå kasser). Modne fiberceller besidder store padledomæner illustreret med små fremspring. Disse sammenkoblede domæner er vigtige for objektivets biomekaniske egenskaber. Fiberceller i linsekernen har færre små fremspring langs deres korte sider og har komplekse tunge-og-rille interdigitationer (lilla kasser). De brede sider af cellen viser en kugleformet membranmorfologi. Tegneserien blev ændret fra22,32 og ikke tegnet i skala. Skalabjælke = 3 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Linsen vokser ved at tilføje skaller af nye fiberceller overlejret oven på tidligere generationer af fibre24,25. Fiberceller har en langstrakt, sekskantet tværsnitsform med to brede sider og fire korte sider. Disse celler strækker sig fra linsens forreste til bageste pol, og afhængigt af arten kan linsefibrene være flere millimeter lange. For at understøtte strukturen af disse aflange og tynde celler skaber specialiserede interdigitationer langs de brede og korte sider sammenlåsende strukturer for at opretholde linseformen og biomekaniske egenskaber. Ændringer i cellemembranform under fibercelledifferentiering og modning er blevet grundigt dokumenteret ved elektronmikroskopi (EM) undersøgelser 2,3,4,5,6,7,8,9,10,20,26,27,28,29 . Nydannede fiberceller har kugler og stikkontakter langs deres brede sider med meget små fremspring langs deres korte sider, mens modne fibre har sammenlåsende fremspring og padler langs deres korte sider. Nukleare fibre viser tunge-og-rille interdigitationer og kugleformet membranmorfologi. Lidt er kendt om de proteiner, der kræves til disse komplekse sammenlåsende membraner. Tidligere undersøgelser af proteinlokalisering i fiberceller har været afhængige af linsevævssektioner, som ikke tillader klar visualisering af den komplekse cellearkitektur.
Dette arbejde har skabt og perfektioneret en ny metode til at fiksere enkelt- og bundter af linsefiberceller for at bevare den komplekse morfologi og tillade immunfarvning for proteiner ved cellemembranen og i cytoplasmaet. Denne metode bevarer trofast cellemembranarkitektur, der kan sammenlignes med data fra EM-undersøgelser, og tillader farvning med primære antistoffer til specifikke proteiner. Vi har tidligere immunfarvede kortikale linsefibre, der gennemgår differentiering og modning22,23. I denne protokol er der også en ny metode til at plette fiberceller fra linsekernen. Denne protokol åbner døren til forståelse af mekanismerne for dannelse og ændringer i membraninterdigitationer under fibercellemodning og linsekernekomprimering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Mus er blevet passet baseret på en dyreprotokol, der er godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved Indiana University Bloomington. Musene, der blev brugt til at generere repræsentative data, var kontroldyr (vildtype) i C57BL6/J-baggrunden, hunner og 8-12 uger gamle. Både han- og hunmus kan bruges til dette eksperiment, da musenes køn meget usandsynligt vil påvirke eksperimentets resultat.
1. Linsedissektion og afkapsling
- Aflive mus efter National Institutes of Health's "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals" samt dyrebrugsprotokoller godkendt af institutionen.
BEMÆRK: For denne undersøgelse blev mus aflivet af CO2 overdosis efterfulgt af cervikal dislokation i overensstemmelse med en godkendt dyreprotokol (Indiana University). - Enucleate øjnene fra musene ved hjælp af buede tang ved at trykke vævet omkring øjnene med den ene side af tangen for at forskyde øjet ud af stikkontakten. Luk derefter tangen under øjet og løft for at fjerne øjet fra stikkontakten. Overfør øjnene til frisk 1x fosfatbufret saltvand (PBS) i en dissektionsbakke.
- Skær synsnerven med ultrafin saks så tæt som muligt på øjeæblet. Indsæt forsigtigt en lige pincet i øjeæblet gennem synsnervens udgang bagerst i øjet.
- Indsæt forsigtigt en saks på samme sted som pincetten i trin 1.3, og begynd at klippe et snit fra den bageste mod hornhinde-skleralkrydset.
BEMÆRK: Gnaverlinser optager ~ 30% af deres øjne. Utilsigtet skade vil opstå, hvis pincetten eller saksen indsættes for dybt i øjet. - Fortsæt med at skære langs hornhinde-scleral-krydset, indtil mindst halvdelen af krydset er adskilt.
- Brug pincet til forsigtigt at skubbe hornhinden på, så linsen kan komme ud gennem snittet lavet med trin 1.4 og 1.5.
- Fjern forsigtigt store stykker væv fra linsen med en lige pincet med fin spids. Undersøg linsen for at finde ækvatorialområdet.
- Gennembor linsen lavt med en lige pincet med fin spids, og fjern derefter linsekapslen. Massen af linsefiberceller forbliver intakt, og linseepitelmonolaget forbliver fastgjort til linsekapslen. Kassér linsekapslen.
2. Linse enkelt fibercellefarvning
- Overfør linsefibercellemassen til en brøndplade med 500 μL frisklavet 1% paraformaldehyd (PFA; i 1x PBS) opløsning og inkuber prøverne ved 4 °C natten over med forsigtig nutation (figur 2A).
BEMÆRK: Volumenerne for de givne løsninger er optimeret til 48-brønds plader. Hvis der anvendes en eller flere brøndplader af en anden størrelse, skal opløsningernes volumen justeres i overensstemmelse hermed. Fastgørelse, blokering og vask (1x PTX, 0,1% Triton X-100 i 1x PBS) opløsninger blev fremstillet med 10x PBS og dobbeltdestilleret vand (ddH2O) til en endelig koncentration på 1x PBS. - Overfør linsefibercellerne til en 60 mm skål med 1% PFA. Brug en skarp skalpel til at opdele kuglen af fiberceller i halvdelen langs dens forreste bageste akse (figur 2B). Skær halvdelene i halve igen langs samme akse for at producere kvartaler.
BEMÆRK: Den forreste bageste akse genkendes let af fibercellernes retning i vævsmassen. - Brug lige pincet til at fjerne kerneområdet fra linsefibercellekvartererne (figur 2C).
BEMÆRK: Linskerneområdet er stift i gnaverlinser, og midten af linsen adskilles let fra de blødere kortikale fibre. - Efterfiksering af kvartene i linsecortexområdet i 200 μL 1% PFA i 15 minutter ved stuetemperatur (RT) med let omrystning (300 omdr./min. på en pladeryster).
- Tissuekvartene vaskes to gange i 750 μL 1x PBS i hver 5 minutter med forsigtig omrystning ved RT.
- Bloker prøverne med 200 μL blokerende opløsning (5% serum, 0,3% Triton X-100, 1x PBS) i 1 time ved RT med forsigtig omrystning.
BEMÆRK: For de repræsentative data i denne protokol blev prøverne ikke farvet med primære eller sekundære antistoffer. Efter blokeringstrinnet blev prøverne inkuberet med hvedekimagglutinin (WGA; 1:100) og phalloidin (1:100) (se materialetabel) i 3 timer ved RT med let omrystning og beskyttelse mod lys. Primær antistoffarvning er blevet påvist i tidligere publikationer22,23. - Der inkuberes med 100 μL primær antistofopløsning natten over ved 4 °C under forsigtig omrystning.
BEMÆRK: Antistofferne fortyndes i blokerende opløsning. Sammenlignet med dias med vævssektioner er der flere celler i denne type præparat. Primære antistofkoncentrationer bør øges for at give rigelige antistoffer til at plette flere celler. Det anbefales at fordoble antistofkoncentrationen fra det, der anvendes på vævssektioner. Det samme gælder sekundære antistoffer. - Vask vævskvartene tre gange med 1x PTX (0,1% Triton X-100, 1x PBS) i 5 minutter hver ved RT med forsigtig omrystning.
- Inkuber fibercellerne med 100 μL sekundært antistof / farveopløsning i 3 timer ved RT med forsigtig omrystning. Beskyt prøverne mod lys under dette og efterfølgende trin.
BEMÆRK: WGA, phalloidin og andre fluorescerende farvestoffer kan tilsættes til den sekundære antistofopløsning til samtidig mærkning af cellemembranen, cytoskelettet eller andre organeller, samtidig med at det primære antistof mærkes. - Vask fibercellerne fire gange med 1x PTX i 5 minutter hver ved RT med let omrystning.
- Tilsæt en dråbe eller 50 μL monteringsmedier på et plusladet mikroskopglas, før vævskvartene overføres til diaset.
- Brug pincet til forsigtigt at adskille fibercellerne fra hinanden og forsøge at begrænse overlapning af cellebundterne.
- Påfør forsigtigt en #1.5 coverslip oven på prøven i monteringsmediet. Monteringsmediet skal spredes til kanten af dæksedlen; Hvis dette ikke sker, skal du tilføje nogle ekstra monteringsmedier til kanten af dæksedlen. Sug eventuelle overskydende monteringsmedier væk rundt om kanten af dækslen, og brug neglelak til at forsegle kanterne på dækselen på diaset.
BEMÆRK: Enhver type monteringsmedium, der er formuleret til konfokal mikroskopi, kan bruges til disse eksperimenter.
3. Linsekerne enkelt fibercellefarvning
- Udfyld dissektionen beskrevet i afsnit 1.
- Fjern de kortikale fibre mekanisk fra linsefibercellernes kugle, forlader linsekernen ved forsigtigt at overføre fibercellemassen til våde, handskede fingerspidser og forsigtigt rulle vævsmassen.
BEMÆRK: I muselinser er rulning af kuglen af linsefiberceller mellem handskede fingerspidser en effektiv metode til fjernelse af de kortikale fiberceller fra den hårde linsekerne28,30. For linser, hvor denne mekaniske metode ikke er effektiv, kan omhyggelig dissektion eller en hvirvelmetode29 anvendes til at fjerne de kortikale fiberceller. - Linsekernen overføres til frisklavet 1 % PFA-opløsning i en brøndplade og inkuberes natten over ved 4 °C under forsigtig omrystning.
- Overfør prøven til en 60 mm skål med 1% PFA, og brug en skarp skalpel til at opdele linsekernen langs den forreste bageste akse. Halver vævsprøverne igen for at producere kernekvarterer.
- Følg processen beskrevet i trin 2.4-2.13 for immunfarvning og prøvemontering.
Figur 2: Grafisk resumé, der beskriver forberedelse og immunfarvning af linsefiberceller . (A) Denne 48-brønds plade er blevet farvekodet efter kolonne for at demonstrere en prøvepladeopsætning til de beskrevne metoder, hvilket muliggør let overførsel af prøver mellem de forskellige immunfarvningstrin ved skånsom håndtering ved hjælp af pincet. Mens de repræsentative data for denne protokol ikke inkuberes med et primært antistof, indeholder diagrammet en kolonne til primær antistofinkubation, og hullerne til vask kan genbruges efter fjernelse af brugte vaskebuffere ved aspiration. (B) Efter fiksering af linsefibercellemassen opdeles vævet langs den forreste bageste akse (røde stiplede linjer) for at bevare cellernes oprindelige struktur. Når vævsmassen er halveret, roteres prøverne, og halvdelene opdeles i kvarte langs den forreste og bageste akse (røde stiplede linjer). (C) Fjernelse af linsekerneområdet (i pink) gøres let ved hjælp af pincet til at grave det tætte centrale væv ud af de kortikale fiberceller (i blåt). Tegneseriediagrammer blev delvist oprettet ved hjælp af BioRender.com og ikke tegnet i skala. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Linsfiberceller fremstilles ud fra linsecortex (differentierende fibre og modne fibre) og kernen, og cellerne farves med phalloidin til F-actin og WGA til cellemembranen. En blanding af bundter af celler eller enkeltlinsefibre (figur 3) observeres og afbildes. Fra linsebarken findes to typer celler (figur 3A). Differentierende fiberceller i linseperiferien er lige, med meget små fremspring langs deres korte sider. Når cellen differentierer, bliver fibercellerne bølget med små sammenlåsende fremspring. Endvidere udvikler fiberceller langs modningsprocessen store padler dekoreret med små sammenlåsende fremspring. Linskernen er meget kompakt og stiv i muselinser og isoleres via mekanisk fjernelse af den blødere linsecortex før fiksering og farvning af kernelinsefibrene. Fra linsekernen findes bundter af linsefibre, der er mindre i diameter og har fine membranstrukturer, der ikke let kan ses på et billede med lav forstørrelse.
I 3D-rekonstruktioner med høj forstørrelse af linsefiberceller fra forskellige områder af linsen (figur 3B) konstateres det, at F-actin og WGA er stærkt colokaliserede ved cellemembranen i differentierende og modne fiberceller. F-actin er beriget i de sammenlåsende fremspring langs cellemembranen i differentierende og modne fibre (figur 3B, pilespidser). Modne fiberceller udvikler store sammenlåsende padler (figur 3B, stjerner). WGA-farvningen er ikke fuldstændig colokaliseret med F-actin-signalet, især i den modne fibercelle, hvilket tyder på, at det kortikale actinnetværk ikke understøtter alle de mindre strukturer langs cellemembranen. Uventet konstateres det, at F-actin-netværket er inden for cytoplasmaet af nukleare fiberceller. Mens F-actinsignalet strækker sig ind i fremspringene (figur 3B, pile) langs kernefibercellemembranen, er actinnetværket ikke længere beriget nær cellemembranen eller inden for fremspringene. Morfologien af den nukleare fibercelle mangler padle, ud over et fald i organiseringen og hyppigheden af fremspring.
Figur 3: Konfokale billeder af bundter (lav forstørrelse) og enkelte (høj forstørrelse) billeder af fiberceller fra forskellige områder af linsen. Celler er farvet med WGA (cellemembraner, grøn), phalloidin (F-actin, rød) og DAPI (kerner, blå). (A) I disse præparater findes bundter af linsefiberceller ofte fra forskellige regioner. I de kortikale præparater er der differentierende og modne fiberceller. Disse forskellige celler har forskellige morfologier, hvilket giver mulighed for nem identifikation. I prøverne fra linsekernen findes fibercellebundter såvel som dissocierede fibre. Skalabjælke = 50 μm. (B) Z-stakke gennem enkelt differentierende, modne og nukleare fiberceller opsamles, og 3D-gengivelse bruges til at rekonstruere de viste billeder. De differentierende og modne fibre har mange små fremspring langs deres korte sider (pilespidserne markerer udvalgte). Disse små fremspring er beriget til F-actin. Den modne fiber har også store sammenlåsende padledomæner (stjerner). Kernefibrene har små membranlommer og divots farvet af WGA og bevarer et par fremspring langs deres korte sider (pile). Overraskende nok er F-actin-netværket nu fordelt i cellecytoplasmaet uden berigede signaler ved cellemembranen. F-actin-netværket strækker sig ind i små fremspring. Skalabjælke = 5 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Når fibercellerne undersøges, er det vigtigt at bemærke cellernes orientering for at undgå forvirring om, hvilken type celle der observeres. Z-stakke indsamles gennem cellerne, og derefter bruges 3D-rekonstruktion til at se på de ortogonale 2D-projektioner i XY-, XZ- og YZ-planerne. På grund af den tilfældige orientering af celler i dette præparat er det muligt at have celler, der ikke ligger helt fladt på glasobjektglasset (figur 4). Alle cellerne i dette repræsentative billede er modne linsefibre, men hver celle har et drastisk forskelligt udseende i XY-planet. Cellen pseudofarvet i grønt er orienteret med bred side opad med synlige padler og fremspring, mens cellen pseudofarvet i pink ligger med den korte side opad. Dette visualiseres lettere i XZ-planet, der viser vinkelrette orienteringer af de to celler, der er vist i XY-planet. Undersøgelse af YZ-flyet viser tydeligt padlerne i den modne fiber, der er farvet lyserød fra XY-planet.
Figur 4: Ortogonale 2D-fremskrivninger (XY-, XZ- og YZ-planer) af 3D-konfokale z-stakke gennem en gruppe af enkelt modne linsefiberceller farvet med phalloidin til F-actin. To celler er pseudofarvede i pink eller grøn til identifikation på hvert plan. I XY-planet ligger den lyserøde celle med sin korte side opad, mens den grønne celle ligger fladt med sin brede side opad. I XZ-planet observeres det, at den lyserøde celle vippes i orientering, mens den grønne celle er parallel med glasbilledet. I YZ-planet observeres padlerne og fremspringene af de lyserøde celler, hvilket bekræfter, at denne celle er en moden fibercelle. Skalabjælke = 5 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Da fibre er ca. 2-4 μm i tykkelse25,31, er det muligt gennem indsamling af z-stakke at se celleoverfladen eller et plan gennem cytoplasmaet (figur 5). Dette fungerer bedst på celler, der er næsten parallelle med dæksedlen, med den brede side af cellen opad. Celleoverfladen i denne modne fibercelle kan værdsættes ved at observere WGA-signalet (figur 5A). XZ-planet viser tydeligt, at dette XY-plan er langs den brede side af cellen. Lille WGA + puncta langs membranen antyder en grov celleoverflademorfologi. De små fremspring langs den korte side i billeder med lav eksponering viser et stærkt beriget F-actinsignal. Ved højere eksponering, hvor F-actinsignalet i fremspringene er mættet, observeres et fint retikuleret F-actinnetværk over cellemembranen (stjerner). Når et XY-plan betragtes gennem cytoplasmaet af den modne fiber (figur 5B), observeres WGA-farvning hovedsageligt langs cellemembranen. I lighed med det, der ses på celleoverfladen, er F-actin beriget i fremspringene langs de korte sider med et retikuleret cytoplasmatisk F-actinnetværk synligt ved højere eksponering (stjerner). Vores tidligere arbejde har vist farvning af membranproteiner i XY-planer gennem cellecytoplasma22,23, men med denne metode er det også muligt at lokalisere proteiner langs den brede sidecelleoverflade.
Figur 5: Ortogonale 2D-fremskrivninger (XY- og XZ-planer) af 3D-konfokale z-stakke gennem en enkelt moden fibercelle farvet med WGA (grøn) og phalloidin (F-actin, rød). (A) Fremspring fra celleoverfladen langs den brede side viser WGA langs cellemembranen, og WGA's punktering tyder på, at membranen ikke er helt glat. F-actin er beriget i fremspringene langs de korte sider, og et billede med høj eksponering af F-actinfarvningen afslører et retikuleret netværk langs cellemembranen (stjerner). (B) Et andet plan gennem cytoplasmaet i den samme celle viser WGA langs cellemembranen og indrammer cellen. F-actin danner et retikuleret netværk gennem cytoplasmaet (stjerner) og er stærkt beriget i fremspringene langs cellemembranen. Skalabjælker = 5 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Dernæst sammenlignes billeder af linsefibre fra scannings-EM (SEM) og farvningseksperimenter. SEM-eksperimenter udføres som tidligere beskrevet29, og billeder tages sekventielt fra midten af prøven til periferien. Først undersøges differentierende linsefibre med små fremspring (figur 6, pile) langs deres korte sider og en kugle-og-sokkel (pilespidser) langs deres brede sider. I lighed med SEM-billedet (figur 6A), i et bundt af differentierende fibre orienteret langs deres korte sider, er kugle-og-socket-interdigitationerne store fremspring og riller, der strækker sig langs den brede side af cellerne (figur 6B, pilespidser). En sokkel findes (figur 6C, pilespidser), når cellen i XY og XZ ortogonale 2D-projektioner ses i enkeltdifferentierende linsefibre. Små sammenlåsende fremspring langs kortsiderne er også trofast bevaret i disse farvede linsefiberceller sammenlignet med dem i SEM-billedet (pile). Dernæst undersøges morfologien af modne fiberceller (figur 7). I SEM-billedet og den farvede celle er der små divots langs den brede side af cellerne (figur 7A, B, pilespidser). Formentlig er disse resterne af kugle-og-socket-interdigitationerne, der krymper under modningsprocessen. De store padler (stjerner) dekoreret med små sammenlåsende fremspring (pile) er sammenlignelige mellem cellerne i SEM og den farvede modne fiber. Cellerne i SEM-billedet har også tydelige riller, hvor et sammenlåsende fremspring docker i cellemembranen (figur 7C, pilespidser). Disse riller kan også ses i disse farvede celler og udfyldes af WGA-signalet (figur 7D, pilespidser). Rillerne kan se ud som fremspring, der går indad mod cellecytoplasmaet i stedet for at projicere udad fra cellemembranen, og ofte er kun WGA-farvning synlig i rillerne, der har meget lidt, hvis nogen, F-actinfarvningssignal.
Figur 6: SEM og konfokale mikroskopbilleder af differentierende fiberceller fra linsebarken. Fiberceller til konfokal mikroskopi farves med WGA (grøn) og phalloidin (F-actin, rød). (A) SEM af et bundt differentierende linsefibre viser kugle-og-socket interdigitationer (pilespidser) langs den brede side af cellerne med små sammenlåsende fremspring (pile) langs cellernes korte sider. (B) Konfokale billeder af et bundt differentierende fibre afbildet fra de korte sider viser store kugle-og-sokkel interdigitationer langs cellernes brede sider (pilespidser). (C) Ortogonale 2D-projektioner (XY- og XZ-planer) gennem en enkelt differentierende linsefiber viser en kugle-og-fatning-interdigitation (pilespidser) langs den brede side og små sammenlåsende fremspring langs den korte side (pile). Skalabjælker = 5 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: SEM og konfokale mikroskopbilleder af modne fiberceller fra linsebarken. Fiberceller til konfokal mikroskopi farves med WGA (grøn) og phalloidin (F-actin, rød). (A) SEM-billedet har to sammenlåsende modne fibre med padler (stjerner) dekoreret med små fremspring (pile) langs cellernes korte sider. Der er også små fordybninger (pilespidser) langs den brede side af cellen. Disse er muligvis de krympende rester af kugle-og-socket fremspring. Skalabjælke = 5 μm. (B) Ortogonale 2D-fremspring (XY- og XZ-planer) gennem en enkelt moden linsefiber har sammenlåsende store padler (stjerner) og små fremspring (pile) langs cellernes korte sider. Små WGA+ ringe (pilespidser), der ligner fordybningerne i SEM-billedet, ses langs den brede side af cellen. Disse WGA + strukturer har ikke F-actinfarvning. F-actin er for det meste beriget ved cellemembranen i de små fremspring og har et svagt retikuleret farvningsmønster i cytoplasmaet. Skalabjælke = 5 μm. (C) SEM-billede af de modne fibre, der viser mange riller i cellemembranen (pilespidser), hvor fremspring fra nabocellerne hviler og låser sammen. Skalabjælke = 2 μm. (D) Et par modne fibre, der lige er adskilt, viser riller (pilespidser) farvet af WGA. Rillerne har ikke berigelse af F-actinfarvning og ligner fremspring, der strækker sig indad mod cytosolen, snarere end at strække sig udad som en sammenlåsende struktur. Skalabjælke = 5 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Endelig sammenlignes de farvede nukleare linsefibre med billeder fra SEM-præparater. Denne nye metode til at fiksere og plette nukleare linsefibre bevarer trofast morfologien af nukleare linsefibre i forskellige områder af linsen (figur 8). Nukleare fiberceller har sjældne og større sammenlåsende fremspring langs deres korte sider (pile). De yderste kernelinsefibre har en ru cellemembranstruktur, som det ses i både SEM og de farvede cellebilleder. Når cellerne gennemgår yderligere komprimering mod midten af kernen, vises tunge-og-rille-interdigitationer langs cellemembranen (stjerner), og de inderste nukleare fibre har en kugleformet membranmorfologi, der kan værdsættes på SEM-billedet og med WGA-farvning. F-actin beriges ikke længere ved cellemembranen, men danner et netværk, der fylder cytoplasmaet og strækker sig svagt ind i fremspringene.
Figur 8: SEM og konfokale mikroskopbilleder af nukleare linsefiberceller. Fiberceller til konfokal mikroskopi farves med WGA (grøn) og phalloidin (F-actin, rød). (A) SEM-billeder af nukleare fibre fra de yderste lag mod linsecentret afslører sjældne og større sammenlåsende fremspring på cellernes korte sider (pile). Cellemembranen er ru i disse celler med tunge-og-rille-interdigitationer (stjerner) og kugleformet membranmorfologi i de inderste celler. (B) 3D-rekonstruktioner af konfokale z-stakke gennem enkeltnukleare linsefibre har sammenlignelige træk som SEM-billederne, herunder fremspring langs de korte sider (pile), tunge-og-rille-interdigitationer (stjerner) og den ru membranmorfologi, der er tydelig med WGA-farvning. F-actin danner et netværk, der fylder cellecytoplasmaet og strækker sig svagt ind i fremspringene. Skalabjælker = 5 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol har demonstreret fikserings-, konserverings- og immunfarvningsmetoderne, der trofast bevarer 3D-membranmorfologien af bundter eller entallinsefiberceller fra forskellige dybder i linsen. De farvede linsefibre sammenlignes med SEM-præparater, der længe har været brugt til at studere linsefibercellemorfologi. Resultaterne viser sammenlignelige membranstrukturer mellem begge præparater. EM forbliver guldstandarden for at studere cellemorfologi, men immunmærkning er mere udfordrende i SEM-prøver til lokalisering af proteiner33,34,35 og kræver, at et elektronmikroskop afbildes. Denne immunfarvningsmetodes fordel er, at flere mål kan mærkes på én gang, og billeder indsamles på et konfokalmikroskop.
Mens metoden bevarer den komplekse cellemorfologi, er SEM stadig forpligtet til at sammenligne interdigitationer mellem kontrol og ændrede linsefibre på grund af genetisk mutation, aldring, farmaceutiske behandlinger osv. Immunfarvningspræparatet skaber en blanding af celler fra linsebarken eller kernen, der fordeles tilfældigt på diaset. Således, hvis cellernes morfologi ændres, kan det være vanskeligere at skelne dybden, hvor celler var placeret i linsen før dissociation til farvning. I disse tilfælde kan det være nødvendigt yderligere at dissekere linsen i områder af interesse efter fiksering og farvning af mindre bundter af linsefibre for højere rumlig nøjagtighed. Farvningsresultaterne skal også sammenlignes med SEM-billeder for at sikre, at de immunfarvede fibre bevarer morfologien af de ændrede celler.
Det er for første gang blevet vist, at nukleare fiberceller også kan bevares til farvning ved hjælp af denne nyoprettede metode. Det er vigtigt at fjerne linsecortex før fiksering af kernen, fordi fiksativ penetration ikke når linsekernen, når hele linsenfastgøres 27. Denne protokols metode til at isolere linsekernen beskriver den mekaniske fjernelse af blødere kortikale linsefibre. Dette er muligt i gnaverlinser på grund af den meget hårde og kompakte linsekerne 28,30,36. I andre arter er linsekernen blødere og kan kræve andre metoder til at isolere disse celler til farvning. Tidligere blev en hvirvelstrømsmetode brugt til at fjerne kortikale fiberceller fra en knockout-muselinje med en blødere linsekerne, der ikke pålideligt kunne isoleres ved mekanisk fjernelse29.
Selvom vi ikke påviste primær antistoffarvning i disse repræsentative data, har vi tidligere udført den samme type farvning med primære antistoffer og passende sekundære antistoffer22,23. Det er vores erfaring, at mange af membranproteinerne har et punktsignal, og derfor anbefales brugen af WGA eller F-actin i kortikale fibre eller WGA i kernefibre for klart at afgrænse cellemembranen for bedre at lokalisere cellemembranproteiner og genkende hvert trin i celledifferentiering og modning. WGA- eller F-actinfarvningen skal være i en synlig kanal (rød, grøn eller blå) for at give observatøren mulighed for let at finde de passende celler til billeddannelse ved hjælp af okularet. Denne type membranfarvning kan også hjælpe med at identificere eventuelle skader på cellerne fra fikserings-, farvnings- og monteringsprocessen for at udelukke mekanisk beskadigede celler. I dette og tidligere værker22,23 observeres sjældent mekanisk beskadigede celler.
Denne metode kræver tålmodig og systematisk undersøgelse af celler til billeddannelse. Den tilfældige blanding af celler kan være ret skræmmende ved første øjekast, men celler, der ligger i den optimale retning, kan normalt findes. Denne metode kan tilpasses linsefibre isoleret fra andre arter. I større linser kan det være muligt at bruge omhyggelig dissektion til at adskille de forskellige lag af celler før immunfarvning. Sammenfattende har denne undersøgelse skabt en robust og pålidelig metode til at bevare bundter af fibre eller enkeltfiberceller for at studere deres komplekse morfologi og lokalisere proteiner i 3D i disse specialiserede celler. Denne unikke protokol til nuklear fiberfarvning åbner et nyt studieområde i linsens mindre velundersøgte centrale fibre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud R01 EY032056 (til CC) fra National Eye Institute. Forfatterne takker Dr. Theresa Fassel og Kimberly Vanderpool ved Scripps Research Core Microscopy Facility for deres hjælp med elektronmikroskopbillederne.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% Triton X-100 | FisherScientific | BP151-500 | |
| 60mm plate | FisherScientific | FB0875713A | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 10X phosphate buffered saline | ThermoFisher | 70011-044 | |
| 1X phosphate buffered saline | ThermoFisher | 14190136 | |
| 48-well plate | CytoOne | CC7672-7548 | |
| Cover slips (22 x 40 mm) | FisherScientific | 12-553-467 | |
| Curved tweezers | World Precision Instruments | 501981 | |
| Dissection microscope | Carl Zeiss | Stereo Discovery V8 | |
| Fine tip straight tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72707-01 | |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | FisherScientific | 12-550-15 | |
| LSM 800 confocal microscope with Airyscan (63X) and Zen 3.5 Software | Carl Zeiss | ||
| Nail polish | |||
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Phalloidin (rhodamine) | ThermoFisher | R415 | |
| Primary antibody | |||
| Scalpel Feather Disposable, steril, No. 11 | VWR | 76241-186 | |
| Secondary antibody | |||
| Straight forceps | World Precision Instruments | 11252-40 | |
| Thermo Scientific Nunc MicroWell MiniTrays (dissection tray) | FisherScientific | 12-565-154 | |
| Ultra-fine scissors | World Precision Instruments | 501778 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Wheat germ agglutinin (fluorescein) | Vector Laboratories | FL-1021-5 |
References
- Lovicu, F. J., McAvoy, J. W. Growth factor regulation of lens development. Developmental Biology. 280 (1), 1-14 (2005).
- Kuszak, J., Alcala, J., Maisel, H. The surface morphology of embryonic and adult chick lens-fiber cells. The American Journal of Anatomy. 159 (4), 395-410 (1980).
- Kuszak, J. R. The ultrastructure of epithelial and fiber cells in the crystalline lens. International Review of Cytology. 163, 305-350 (1995).
- Kuszak, J. R., Macsai, M. S., Rae, J. L. Stereo scanning electron microscopy of the crystalline lens. Scanning Electron Microscopy. , 1415-1426 (1983).
- Lo, W. K., Harding, C. V. Square arrays and their role in ridge formation in human lens fibers. Journal of Ultrastructure Research. 86 (3), 228-245 (1984).
- Taylor, V. L., et al.
- Vrensen, G. F. Aging of the human eye lens-a morphological point of view. Comparative Biochemistry and Physiology. Part A, Physiology. 111 (4), 519-532 (1995).
- Vrensen, G. F., Duindam, H. J. Maturation of fiber membranes in the human eye lens. Ultrastructural and Raman microspectroscopic observations. Ophthalmic Research. 27, 78-85 (1995).
- Willekens, B., Vrensen, G. The three-dimensional organization of lens fibers in the rabbit. A scanning electron microscopic reinvestigation. Albrecht von Graefe's Archive for Clinical and Experimental Opthalmology. 216 (4), 275-289 (1981).
- Willekens, B., Vrensen, G. The three-dimensional organization of lens fibers in the rhesus monkey. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 219 (3), 112-120 (1982).
- Zhou, C. J., Lo, W. K. Association of clathrin, AP-2 adaptor and actin cytoskeleton with developing interlocking membrane domains of lens fibre cells. Experimental Eye Research. 77 (4), 423-432 (2003).
- Kuwabara, T. The maturation of the lens cell: a morphologic study. Experimental Eye Research. 20 (5), 427-443 (1975).
- Weeber, H. A., Eckert, G., Pechhold, W., vander Heijde, R. G.
- Weeber, H. A., et al. Dynamic mechanical properties of human lenses. Experimental Eye Research. 80 (3), 425-434 (2005).
- Weeber, H. A., vander Heijde, R. G. On the relationship between lens stiffness and accommodative amplitude. Experimental Eye Research. 85 (5), 602-607 (2007).
- Heys, K. R., Cram, S. L., Truscott, R. J. Massive increase in the stiffness of the human lens nucleus with age: the basis for presbyopia. Molecular Vision. 10, 956-963 (2004).
- Heys, K. R., Friedrich, M. G., Truscott, R. J. Presbyopia and heat: changes associated with aging of the human lens suggest a functional role for the small heat shock protein, alpha-crystallin, in maintaining lens flexibility. Aging Cell. 6 (6), 807-815 (2007).
- Glasser, A., Campbell, M. C. Biometric, optical and physical changes in the isolated human crystalline lens with age in relation to presbyopia. Vision Research. 39 (11), 1991-2015 (1999).
- Pierscionek, B. K. Age-related response of human lenses to stretching forces. Experimental Eye Research. 60 (3), 325-332 (1995).
- Biswas, S. K., Lee, J. E., Brako, L., Jiang, J. X., Lo, W. K. Gap junctions are selectively associated with interlocking ball-and-sockets but not protrusions in the lens. Molecular Vision. 16, 2328-2341 (2010).
- Lo, W. K., et al. Aquaporin-0 targets interlocking domains to control the integrity and transparency of the eye lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (3), 1202-1212 (2014).
- Cheng, C., et al. Tropomyosin 3.5 protects the F-actin networks required for tissue biomechanical properties. Journal of Cell Science. 131 (23), (2018).
- Cheng, C., et al. Tropomodulin 1 regulation of actin is required for the formation of large paddle protrusions between mature lens fiber cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (10), 4084-4099 (2016).
- Kuszak, J. R.
- Bassnett, S., Costello, M. J. The cause and consequence of fiber cell compaction in the vertebrate lens. Experimental Eye Research. 156, 50-57 (2017).
- Biswas, S., Son, A., Yu, Q., Zhou, R., Lo, W. K. Breakdown of interlocking domains may contribute to formation of membranous globules and lens opacity in ephrin-A5(-/-) mice. Experimental Eye Research. 145, 130-139 (2016).
- Blankenship, T., Bradshaw, L., Shibata, B., Fitzgerald, P. Structural specializations emerging late in mouse lens fiber cell differentiation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (7), 3269-3276 (2007).
- Cheng, C., et al. Age-related changes in eye lens biomechanics, morphology, refractive index and transparency. Aging. 11 (24), 12497-12531 (2019).
- Cheng, C., et al. EphA2 affects development of the eye lens nucleus and the gradient of refractive index. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 63 (1), 2 (2022).
- Cheng, C., Gokhin, D. S., Nowak, R. B., Fowler, V. M. Sequential application of glass coverslips to assess the compressive stiffness of the mouse lens: strain and morphometric analyses. Journal of Visualized Experiments. (111), e53986 (2016).
- Forrester, J. V., Dick, A. D., McMenamin, P. G., Roberts, F., Pearlman, E. Anatomy of the eye and orbit. The Eye (Fourth Edition). Saunders, W. B. , 1 (2016).
- Cheng, C., Nowak, R. B., Fowler, V. M. The lens actin filament cytoskeleton: Diverse structures for complex functions. Experimental Eye Research. 156, 58-71 (2017).
- Goldberg, M. W., Fiserova, J. Immunogold labeling for scanning electron microscopy. Methods in Molecular Biology. 1474, 309-325 (2016).
- Goldberg, M. W. High-resolution scanning electron microscopy and immuno-gold labeling of the nuclear lamina and nuclear pore complex. Methods in Molecular Biology. 1411, 441-459 (2016).
- Hermann, R., Walther, P., Muller, M. Immunogold labeling in scanning electron microscopy. Histochemistry and Cell Biology. 106 (1), 31-39 (1996).
- Gokhin, D. S., et al. Tmod1 and CP49 synergize to control the fiber cell geometry, transparency, and mechanical stiffness of the mouse lens. PLoS One. 7 (11), e48734 (2012).
