Summary
Ce protocole décrit des méthodes pour préparer les cellules périphériques, matures et nucléaires de la fibre du cristallin de l’œil pour la coloration par immunofluorescence afin d’étudier les interdigitations complexes de cellule à cellule et l’architecture de la membrane.
Abstract
Le cristallin est un organe transparent et ellipsoïde situé dans la chambre antérieure de l’œil qui change de forme pour focaliser finement la lumière sur la rétine afin de former une image claire. La majeure partie de ce tissu est constituée de cellules fibreuses spécialisées et différenciées qui ont une section transversale hexagonale et s’étendent des pôles antérieur aux pôles postérieurs du cristallin. Ces cellules longues et maigres sont étroitement opposées aux cellules voisines et ont des interdigitations complexes sur toute la longueur de la cellule. Les structures d’emboîtement spécialisées sont nécessaires pour les propriétés biomécaniques normales de la lentille et ont été largement décrites à l’aide de techniques de microscopie électronique. Ce protocole démontre la première méthode permettant de préserver et d’immunocolorer des cellules de fibres de lentilles de souris afin de permettre la localisation détaillée des protéines au sein de ces cellules de forme complexe. Les données représentatives montrent une coloration des cellules périphériques, différenciantes, matures et des fibres nucléaires dans toutes les régions du cristallin. Cette méthode peut potentiellement être utilisée sur des cellules fibreuses isolées de lentilles d’autres espèces.
Introduction
Le cristallin est un tissu clair et ovoïde situé dans la chambre antérieure de l’œil, composé de deux types de cellules, les cellules épithéliales et les cellules fibreuses 1 (Figure 1). Il existe une monocouche de cellules épithéliales qui recouvre l’hémisphère antérieur du cristallin. Les cellules fibreuses sont différenciées des cellules épithéliales et constituent la majeure partie du cristallin. Les cellules fibreuses hautement spécialisées subissent une programmation d’allongement, de différenciation et de maturation, marquée par des changements distincts dans la morphologie de la membrane cellulaire de la périphérie du cristallinau centre du cristallin 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 , également connu sous le nom de noyau de lentille. La fonction de focalisation fine de la lentille provenant de différentes distances sur la rétine dépend de ses propriétés biomécaniques, notamment sa rigidité et son élasticité 13,14,15,16,17,18,19. Les interdigitations complexes des fibres du cristallin ont été supposées 20,21 et se sont récemment révélées importantes pour la rigidité du cristallin 22,23.
Figure 1 : Diagrammes d’anatomie du cristallin et images représentatives de la microscopie électronique à balayage (MEB) à partir des fibres du cristallin. La caricature montre une vue longitudinale (antérieure à postérieure de haut en bas) de la monocouche antérieure de cellules épithéliales (ombrée en bleu clair) et d’une masse massive de cellules de fibres de cristallin (blanche). Le centre du cristallin (en rose) est connu sous le nom de noyau et comprend des cellules fibreuses très compactes. Sur la droite, un dessin animé en coupe transversale révèle la forme allongée des cellules hexagonales des fibres de lentille qui sont emballées dans un motif en nid d’abeille. Les cellules fibreuses ont deux côtés larges et quatre côtés courts. Des images MEB représentatives le long de la partie inférieure montrent les interdigitations complexes de la membrane entre les cellules de fibre de lentille à différentes profondeurs de la lentille. À partir de la droite, les fibres de lentille nouvellement formées à la périphérie de la lentille présentent de petites protubérances le long des côtés courts et des boules et des douilles le long du côté large (cases rouges). Au cours de la maturation, les fibres du cristallin développent de grands domaines de pagaie qui sont décorés de petites protubérances le long des côtés courts (boîtes bleues). Les cellules fibreuses matures possèdent de grands domaines de pagaie illustrés par de petites protubérances. Ces domaines imbriqués sont importants pour les propriétés biomécaniques des lentilles. Les cellules fibreuses du noyau du cristallin ont moins de petites protubérances le long de leurs côtés courts et ont des interdigitations complexes en rainure et languette (boîtes violettes). Les côtés larges de la cellule présentent une morphologie de membrane globulaire. Le dessin animé a été modifié à partir de22,32 et n’a pas été dessiné à l’échelle. Barre d’échelle = 3 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
La lentille se développe en ajoutant des coquilles de nouvelles cellules fibreuses superposées aux générations précédentes de fibres24,25. Les cellules fibreuses ont une forme de section transversale hexagonale allongée avec deux côtés larges et quatre côtés courts. Ces cellules s’étendent du pôle antérieur au pôle postérieur du cristallin, et selon les espèces, les fibres du cristallin peuvent mesurer plusieurs millimètres de long. Pour soutenir la structure de ces cellules allongées et maigres, des interdigitations spécialisées le long des côtés larges et courts créent des structures imbriquées pour maintenir la forme du cristallin et les propriétés biomécaniques. Les changements dans la forme de la membrane cellulaire au cours de la différenciation et de la maturation des cellules fibreuses ont été largement documentés par des études de microscopie électronique (EM) 2,3,4,5,6,7,8,9,10,20,26,27,28,29 . Les cellules fibreuses nouvellement formées ont des rotules et des douilles le long de leurs côtés larges avec de très petites protubérances le long de leurs côtés courts, tandis que les fibres matures ont des protubérances imbriquées et des palettes le long de leurs côtés courts. Les fibres nucléaires présentent des interdigitations à rainure et languette et une morphologie de membrane globulaire. On sait peu de choses sur les protéines nécessaires à ces membranes complexes qui s’emboîtent. Des études antérieures sur la localisation des protéines dans les cellules fibreuses se sont appuyées sur des coupes de tissu de lentille, qui ne permettent pas une visualisation claire de l’architecture cellulaire complexe.
Ces travaux ont permis de créer et de perfectionner une nouvelle méthode pour fixer les cellules individuelles et les faisceaux de fibres de cristallin afin de préserver la morphologie complexe et de permettre l’immunomarquage des protéines au niveau de la membrane cellulaire et du cytoplasme. Cette méthode préserve fidèlement l’architecture de la membrane cellulaire, comparable aux données des études EM, et permet la coloration avec des anticorps primaires pour des protéines spécifiques. Nous avons précédemment immunocoloré des fibres de cristallin cortical en cours de différenciation et de maturation22,23. Dans ce protocole, il existe également une nouvelle méthode pour colorer les cellules fibreuses du noyau du cristallin. Ce protocole ouvre la porte à la compréhension des mécanismes de formation et de modification des interdigitations membranaires au cours de la maturation des cellules fibreuses et du compactage du noyau du cristallin.
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Protocol
Les souris ont été soignées sur la base d’un protocole animalier approuvé par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de l’Indiana à Bloomington. Les souris utilisées pour générer des données représentatives étaient des animaux témoins (de type sauvage) dans le fond C57BL6/J, des femelles et âgées de 8 à 12 semaines. Les souris mâles et femelles peuvent être utilisées pour cette expérience, car il est très peu probable que le sexe des souris affecte le résultat de l’expérience.
1. Dissection et décapsulation du cristallin
- Euthanasier les souris en suivant le « Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire » des National Institutes of Health ainsi que les protocoles d’utilisation des animaux approuvés par l’établissement.
NOTE : Pour la présente étude, les souris ont été euthanasiées par surdose de CO2 suivie d’une luxation cervicale conformément à un protocole animal approuvé (Université de l’Indiana). - Énucléez les yeux des souris à l’aide d’une pince incurvée en appuyant sur le tissu autour des yeux avec un côté de la pince pour déplacer l’œil hors de l’orbite. Ensuite, fermez la pince sous l’œil et soulevez-la pour retirer l’œil de l’orbite. Transférez les yeux dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) fraîche 1x dans un plateau de dissection.
- Coupez le nerf optique avec des ciseaux ultra-fins le plus près possible du globe oculaire. Insérez délicatement une pince à épiler droite à pointe fine dans le globe oculaire par la sortie du nerf optique à la postérieur de l’œil.
- Insérez soigneusement les ciseaux au même endroit que la pince à épiler à l’étape 1.3 et commencez à couper une incision du postérieur vers la jonction cornéen-sclérale.
REMARQUE : Les lentilles de rongeurs occupent ~30% de leurs yeux. Des dommages accidentels se produiront si la pince à épiler ou les ciseaux sont insérés trop profondément dans l’œil. - Continuez à couper le long de la jonction cornéen-sclérale jusqu’à ce qu’au moins la moitié de la jonction soit séparée.
- À l’aide d’une pince à épiler, appuyez doucement sur la cornée afin que la lentille puisse sortir par l’incision pratiquée aux étapes 1.4 et 1.5.
- Retirez délicatement tous les gros morceaux de tissu de la lentille à l’aide d’une pince à épiler droite à pointe fine. Inspectez la lentille pour trouver la région équatoriale.
- Percez superficiellement la lentille à l’aide d’une pince à épiler droite à pointe fine, puis retirez la capsule de la lentille. La masse des cellules de fibre du cristallin restera intacte et la monocouche épithéliale du cristallin restera attachée à la capsule du cristallin. Jetez la capsule de lentille.
2. Coloration des cellules à fibre unique de lentille
- Transférez la masse cellulaire de la fibre de lentille dans une plaque de puits avec 500 μL de solution de paraformaldéhyde (PFA) à 1 % fraîchement préparée et incubez les échantillons à 4 °C pendant la nuit avec une nutation douce (Figure 2A).
REMARQUE : Les volumes des solutions données sont optimisés pour les plaques à 48 puits. Si vous utilisez une plaque ou des tubes d’une autre taille, ajustez les volumes des solutions en conséquence. Des solutions de fixation, de blocage et de lavage (1x PTX, 0,1% Triton X-100 dans 1x PBS) ont été réalisées avec 10x PBS et de l’eau doublement distillée (ddH2O) jusqu’à une concentration finale de 1x PBS. - Transférez les cellules en fibre de lentille dans une parabole de 60 mm avec 1 % de PFA. À l’aide d’un scalpel bien aiguisé, divisez la boule de cellules fibreuses en deux le long de son axe antéro-postérieur (figure 2B). Coupez à nouveau les moitiés en deux le long du même axe pour obtenir des quartiers.
REMARQUE : L’axe antéro-postérieur est facilement reconnaissable par la direction des cellules fibreuses dans la masse tissulaire. - Utilisez une pince à épiler droite pour retirer la région du noyau des quartiers de cellules de la fibre du cristallin (Figure 2C).
REMARQUE : La région du noyau du cristallin est rigide dans les lentilles de rongeurs, et le centre du cristallin se séparera facilement des fibres corticales plus molles. - Post-fixer les quarts de la région du cortex du cristallin dans 200 μL de PFA à 1 % pendant 15 min à température ambiante (RT) en agitant doucement (300 tr/min sur un agitateur à plaque).
- Lavez les quartiers de mouchoirs deux fois dans 750 μL de 1x PBS pendant 5 minutes chacun en agitant doucement à RT.
- Bloquer les échantillons à l’aide de 200 μL de solution bloquante (sérum à 5 %, Triton X-100 à 0,3 %, 1 PBS) pendant 1 h à RT en agitant doucement.
REMARQUE : Pour les données représentatives de ce protocole, les échantillons n’ont pas été colorés avec des anticorps primaires ou secondaires. Après l’étape de blocage, les échantillons ont été incubés avec de l’agglutinine de germe de blé (WGA ; 1 :100) et de la phalloïdine (1 :100) (voir tableau des matériaux) pendant 3 h à RT avec une légère agitation et une protection contre la lumière. La coloration primaire des anticorps a été démontrée dans des publications antérieures22,23. - Incuber avec 100 μL de solution primaire d’anticorps pendant une nuit à 4 °C en agitant doucement.
REMARQUE : Les anticorps sont dilués dans une solution bloquante. Par rapport aux lames avec des coupes de tissus, il y a plus de cellules dans ce type de préparation. Les concentrations d’anticorps primaires doivent être augmentées pour fournir suffisamment d’anticorps pour colorer plus de cellules. Il est recommandé de doubler la concentration d’anticorps par rapport à ce qui est utilisé sur les coupes de tissus. Il en va de même pour les anticorps secondaires. - Lavez les quartiers de tissu trois fois avec 1x PTX (0,1% Triton X-100, 1x PBS) pendant 5 min chacun à RT en agitant doucement.
- Incuber les cellules fibreuses avec 100 μL de solution secondaire d’anticorps/colorant pendant 3 h à RT en agitant doucement. Protégez les échantillons de la lumière pendant cette étape et les suivantes.
REMARQUE : Le WGA, la phalloïdine et d’autres colorants fluorescents peuvent être ajoutés à la solution d’anticorps secondaire pour le marquage simultané de la membrane cellulaire, du cytosquelette ou d’autres organites tout en marquant l’anticorps primaire. - Lavez les cellules fibreuses quatre fois avec 1x PTX pendant 5 minutes chacune à RT en secouant doucement.
- Ajouter une goutte ou 50 μL de support de montage sur une lame de microscope chargée plus avant de transférer les quartiers de tissu sur la lame.
- Utilisez une pince à épiler pour séparer délicatement les cellules fibreuses les unes des autres et essayez de limiter le chevauchement des faisceaux de cellules.
- Appliquez délicatement une lamelle #1.5 sur le dessus de l’échantillon dans le support de montage. Le support de montage doit s’étendre jusqu’au bord de la lamelle ; Si ce n’est pas le cas, ajoutez un support de montage supplémentaire sur le bord de la lamelle. Aspirez tout excès de support de montage autour du bord de la lamelle et utilisez du vernis à ongles pour sceller les bords de la lamelle sur la lamelle.
REMARQUE : Tout type de milieu de montage formulé pour la microscopie confocale peut être utilisé pour ces expériences.
3. Coloration des cellules à fibre unique du noyau de lentille
- Complétez la dissection décrite à la section 1.
- Retirez mécaniquement les fibres corticales de la boule des cellules de la fibre du cristallin, en quittant le noyau du cristallin, en transférant doucement la masse cellulaire de la fibre au bout des doigts mouillés et gantés et en roulant doucement la masse tissulaire.
REMARQUE : Dans les lentilles de souris, faire rouler la boule de cellules de fibres de cristallin entre le bout des doigts gantés est une méthode efficace pour éliminer les cellules de fibres corticales du noyau dur du cristallin28,30. Pour les lentilles où cette méthode mécanique n’est pas efficace, une dissection minutieuse ou une méthode de vortex29 peut être utilisée pour enlever les cellules de la fibre corticale. - Transférez le noyau de la lentille dans une solution de PFA à 1 % fraîchement préparée dans une plaque à puits et incubez toute la nuit à 4 °C en agitant doucement.
- Transférez l’échantillon dans une boîte de 60 mm avec 1 % de PFA et utilisez un scalpel tranchant pour diviser le noyau du cristallin le long de l’axe antéro-postérieur. Coupez à nouveau les échantillons de tissus en deux pour obtenir des quartiers de noyau.
- Suivez le processus décrit aux étapes 2.4 à 2.13 pour l’immunomarquage et le montage de l’échantillon.
Figure 2 : Résumé graphique détaillant la préparation et l’immunomarquage des cellules de fibres de lentilles. (A) Cette plaque à 48 puits a été codée par couleur par colonne pour illustrer la configuration d’une plaque d’échantillon pour les méthodes décrites, permettant un transfert facile des échantillons entre les différentes étapes d’immunomarquage par manipulation délicate à l’aide d’une pince. Bien que les données représentatives de ce protocole ne soient pas incubées avec un anticorps primaire, le diagramme comprend une colonne pour l’incubation primaire des anticorps, et les puits pour le lavage peuvent être réutilisés après avoir retiré les tampons de lavage usagés par aspiration. (B) Après fixation de la masse cellulaire de la fibre du cristallin, le tissu est divisé le long de l’axe antéro-postérieur (lignes pointillées rouges) pour préserver la structure originale des cellules. Une fois que la masse tissulaire a été réduite de moitié, les échantillons sont tournés et les moitiés divisées en quartiers le long de l’axe antéro-postérieur (lignes pointillées rouges). (C) L’ablation de la région du noyau du cristallin (en rose) se fait facilement à l’aide d’une pince à épiler pour extraire le tissu central dense des cellules de la fibre corticale (en bleu). Les diagrammes de dessins animés ont été partiellement créés à l’aide de BioRender.com et non dessinés à l’échelle. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Representative Results
Les cellules à fibres de cristallin sont préparées à partir du cortex du cristallin (fibres de différenciation et fibres matures) et du noyau, et les cellules sont colorées avec de la phalloïdine pour l’actine F et du WGA pour la membrane cellulaire. Un mélange de faisceaux de cellules ou de fibres d’une seule lentille (Figure 3) est observé et imagé. Dans le cortex du cristallin, on trouve deux types de cellules (Figure 3A). Les cellules fibreuses de différenciation à la périphérie du cristallin sont droites, avec de très petites protubérances le long de leurs côtés courts. Au fur et à mesure que la cellule se différencie, les cellules fibreuses deviennent ondulées avec de petites protubérances imbriquées. De plus, tout au long du processus de maturation, les cellules fibreuses développent de grandes palettes décorées de petites protubérances imbriquées. Le noyau du cristallin est très compact et rigide dans les lentilles de souris, et est isolé par l’ablation mécanique du cortex du cristallin plus mou avant la fixation et la coloration des fibres du cristallin nucléaire. À partir du noyau de la lentille, on trouve des faisceaux de fibres de lentille de plus petit diamètre et ayant de fines structures de membrane qui ne peuvent pas être facilement vues sur une image à faible grossissement.
Dans les reconstructions 3D à fort grossissement de cellules de fibres de cristallin provenant de différentes régions du cristallin (Figure 3B), on constate que la F-actine et le WGA sont fortement colocalisés au niveau de la membrane cellulaire dans les cellules de fibres matures et en différenciation. La F-actine est enrichie dans les protubérances imbriquées le long de la membrane cellulaire dans les fibres matures et en voie de différenciation (Figure 3B, pointes de flèche). Les cellules fibreuses matures développent de grandes palettes imbriquées (figure 3B, astérisques). La coloration WGA n’est pas complètement colocalisée avec le signal F-actine, en particulier dans la cellule fibreuse mature, ce qui suggère que le réseau d’actine cortical ne supporte pas toutes les structures plus petites le long de la membrane cellulaire. De manière inattendue, on découvre que le réseau F-actine se trouve dans le cytoplasme des cellules à fibres nucléaires. Alors que le signal F-actine s’étend dans les protubérances (Figure 3B, flèches) le long de la membrane cellulaire de la fibre nucléaire, le réseau d’actine n’est plus enrichi près de la membrane cellulaire ou à l’intérieur des protubérances. La morphologie de la cellule fibreuse nucléaire manque de palettes, en plus d’une diminution de l’organisation et de la fréquence des protubérances.
Figure 3 : Images confococaux de faisceaux (faible grossissement) et d’images individuelles (fort grossissement) de cellules fibreuses provenant de différentes régions de la lentille. Les cellules sont colorées avec du WGA (membranes cellulaires, vert), de la phalloïdine (F-actine, rouge) et du DAPI (noyaux, bleu). (A) Dans ces préparations, on trouve souvent des faisceaux de cellules de fibres de cristallin provenant de différentes régions. Dans les préparations corticales, il y a des cellules fibreuses différenciées et matures. Ces différentes cellules ont des morphologies distinctes, ce qui permet une identification facile. Dans les échantillons prélevés dans le noyau du cristallin, on trouve des faisceaux de cellules fibreuses ainsi que des fibres dissociées. Barre d’échelle = 50 μm. (B) Des empilements Z à travers des cellules de fibres uniques, matures et nucléaires sont collectés, et un rendu 3D est utilisé pour reconstruire les images présentées. Les fibres différenciantes et matures ont de nombreuses petites protubérances le long de leurs côtés courts (les pointes de flèches marquent les fibres sélectionnées). Ces petites protubérances sont enrichies en F-actine. La fibre mature a également de grands domaines de pagaie imbriqués (astérisques). Les fibres nucléaires ont de petites poches membranaires et des mottes colorées par le WGA et conservent quelques protubérances le long de leurs côtés courts (flèches). Étonnamment, le réseau F-actine est maintenant distribué dans le cytoplasme cellulaire sans signaux enrichis au niveau de la membrane cellulaire. Le réseau F-actine s’étend en petites protubérances. Barre d’échelle = 5 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Lorsque les cellules fibreuses sont examinées, il est important de noter l’orientation des cellules pour éviter toute confusion quant au type de cellule observé. Les piles Z sont collectées dans les cellules, puis la reconstruction 3D est utilisée pour examiner les projections 2D orthogonales dans les plans XY, XZ et YZ. En raison de l’orientation aléatoire des cellules dans cette préparation, il est possible d’avoir des cellules qui ne sont pas parfaitement à plat sur la lame de verre (Figure 4). Toutes les cellules de cette image représentative sont des fibres de lentilles matures, mais chaque cellule a une apparence radicalement différente dans le plan XY. La cellule pseudo-colorée en vert est orientée vers le haut avec des palettes et des protubérances visibles, tandis que la cellule pseudo-colorée en rose est couchée avec le côté court vers le haut. Ceci est plus facilement visualisé dans le plan XZ, montrant les orientations perpendiculaires des deux cellules indiquées dans le plan XY. L’examen du plan YZ montre clairement les palettes de la fibre mature qui est colorée en rose à partir du plan XY.
Figure 4 : Projections orthogonales 2D (plans XY, XZ et YZ) d’empilements confocaux z 3D à travers un groupe de cellules de fibres de lentilles matures uniques colorées à la phalloïdine pour l’actine F. Deux cellules sont pseudo-colorées en rose ou en vert pour l’identification sur chaque plan. Dans le plan XY, la cellule rose est couchée avec son côté court vers le haut, tandis que la cellule verte est couchée à plat avec son côté large vers le haut. Dans le plan XZ, on observe que la cellule rose est inclinée en orientation, tandis que la cellule verte est parallèle à la lame de verre. Dans le plan YZ, les palettes et les protubérances des cellules roses sont observées, confirmant que cette cellule est une cellule fibreuse mature. Barre d’échelle = 5 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Étant donné que les fibres ont une épaisseur d’environ 2 à 4 μm25,31, il est possible, grâce à la collecte d’empilements z, de visualiser la surface cellulaire ou un plan à travers le cytoplasme (Figure 5). Cela fonctionne mieux sur les cellules qui sont presque parallèles à la lamelle, avec le côté large de la cellule vers le haut. La surface cellulaire de cette cellule fibreuse mature peut être appréciée en observant le signal WGA (Figure 5A). Le plan XZ montre clairement que ce plan XY se trouve le long du côté large de la cellule. De petits puncta WGA+ le long de la membrane suggèrent une morphologie rugueuse de la surface cellulaire. Les petites protubérances le long du côté court dans les images à faible exposition montrent un signal F-actine considérablement enrichi. À une exposition plus élevée, où le signal F-actine dans les protubérances est saturé, un fin réseau réticulé de F-actine est observé à travers la membrane cellulaire (astérisques). Lorsqu’un plan XY est considéré à travers le cytoplasme de la fibre mature (Figure 5B), la coloration WGA est observée principalement le long de la membrane cellulaire. Semblable à ce que l’on observe à la surface des cellules, la F-actine est enrichie dans les protubérances le long des côtés courts, avec un réseau cytoplasmique réticulé de F-actine visible à une exposition plus élevée (astérisques). Nos travaux précédents ont montré la coloration des protéines membranaires dans les plans XY à travers le cytoplasme cellulaire22,23, mais avec cette méthode, il est également possible de localiser les protéines le long de la surface cellulaire latérale large.
Figure 5 : Projections orthogonales 2D (plans XY et XZ) d’empilements confocaux z 3D à travers une seule cellule fibreuse mature colorée au WGA (vert) et à la phalloïdine (F-actine, rouge). (A) Les projections de la surface cellulaire le long du côté large montrent WGA le long de la membrane cellulaire, et la ponctuation de WGA suggère que la membrane n’est pas complètement lisse. La F-actine est enrichie dans les protubérances le long des côtés courts, et une image à haute exposition de la coloration de la F-actine révèle un réseau réticulé le long de la membrane cellulaire (astérisques). (B) Un autre plan à travers le cytoplasme de la même cellule montre WGA le long de la membrane cellulaire, encadrant la cellule. La F-actine forme un réseau réticulé à travers le cytoplasme (astérisques) et est fortement enrichie dans les protubérances le long de la membrane cellulaire. Barres d’échelle = 5 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Ensuite, les images des fibres de lentille provenant de l’EM de balayage (MEB) et des expériences de coloration sont comparées. Les expériences MEB sont réalisées comme décrit précédemment29, et les images sont prises séquentiellement du centre de l’échantillon à la périphérie. Tout d’abord, on a examiné la différenciation des fibres de lentilles avec de petites protubérances (figure 6, flèches) le long de leurs côtés courts et une rotule (pointes de flèches) le long de leurs côtés larges. Semblable à l’image MEB (Figure 6A), dans un faisceau de fibres de différenciation orientées le long de leurs côtés courts, les interdigitations à rotule sont de grandes protubérances et des rainures s’étendant le long du côté large des cellules (Figure 6B, pointes de flèche). Une alvéole est trouvée (Figure 6C, pointes de flèche) lorsque la cellule dans les projections 2D orthogonales XY et XZ est visualisée dans des fibres de lentille à différenciation unique. De petites protubérances imbriquées le long des côtés courts sont également fidèlement préservées dans ces cellules en fibre de lentille colorées par rapport à celles de l’image MEB (flèches). Ensuite, la morphologie des cellules fibreuses matures est étudiée (Figure 7). Dans l’image MEB et la cellule colorée, il y a de petits mottes le long du côté large des cellules (Figure 7A, B, pointes de flèche). On peut supposer qu’il s’agit des restes des interdigitations à rotule qui rétrécissent au cours du processus de maturation. Les grandes palettes (astérisques) décorées de petites protubérances imbriquées (flèches) sont comparables entre les cellules du MEB et la fibre mature colorée. Les cellules de l’image MEB présentent également des rainures évidentes où une saillie imbriquée s’ancre dans la membrane cellulaire (figure 7C, pointes de flèche). Ces rainures sont également visibles dans ces cellules colorées et sont remplies par le signal WGA (Figure 7D, pointes de flèche). Les rainures peuvent ressembler à des protubérances allant vers l’intérieur vers le cytoplasme cellulaire au lieu de se projeter vers l’extérieur de la membrane cellulaire, et souvent seule la coloration WGA est visible dans les rainures qui ont très peu, voire pas du tout, de signal de coloration F-actine.
Figure 6 : Images MEB et microscope confocal de cellules fibreuses différenciées du cortex du cristallin. Les cellules fibreuses pour la microscopie confocale sont colorées avec du WGA (vert) et de la phalloïdine (F-actine, rouge). (A) Le MEB d’un faisceau de fibres de lentilles de différenciation montre des interdigitations à rotule (pointes de flèche) le long du côté large des cellules avec de petites protubérances imbriquées (flèches) le long des côtés courts des cellules. (B) Les images confococaux d’un faisceau de fibres de différenciation imagées à partir des côtés courts montrent de grandes interdigitations à rotule le long des côtés larges des cellules (pointes de flèche). (C) Les projections 2D orthogonales (plans XY et XZ) à travers une seule fibre de lentille différenciatrice montrent une interdigitation à rotule (pointes de flèches) le long du côté large et de petites protubérances imbriquées le long du côté court (flèches). Barres d’échelle = 5 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Images MEB et au microscope confocal de cellules fibreuses matures du cortex du cristallin. Les cellules fibreuses pour la microscopie confocale sont colorées avec du WGA (vert) et de la phalloïdine (F-actine, rouge). (A) L’image MEB présente deux fibres matures imbriquées avec des pagaies (astérisques) décorées de petites protubérances (flèches) le long des côtés courts des cellules. Il y a aussi de petites indentations (pointes de flèches) le long du côté large de la cellule. Il s’agit peut-être des restes rétrécissants de protubérances à rotule. Barre d’échelle = 5 μm. (B) Les projections 2D orthogonales (plans XY et XZ) à travers une seule fibre de lentille mature ont de grandes palettes (astérisques) et de petites protubérances (flèches) imbriquées le long des côtés courts des cellules. De petits anneaux WGA+ (pointes de flèche), semblables aux indentations de l’image SEM, sont visibles le long du côté large de la cellule. Ces structures WGA+ n’ont pas de coloration F-actine. La F-actine est principalement enrichie au niveau de la membrane cellulaire dans les petites protubérances et présente un faible motif de coloration réticulé dans le cytoplasme. Barre d’échelle = 5 μm. (C) Image MEB des fibres matures montrant de nombreuses rainures dans la membrane cellulaire (pointes de flèche), où les protubérances des cellules voisines reposent et s’emboîtent. Barre d’échelle = 2 μm. (D) Une paire de fibres matures qui sont juste séparées montrant des rainures (pointes de flèches) colorées par WGA. Les rainures n’ont pas d’enrichissement en coloration F-actine et ressemblent à des protubérances s’étendant vers l’intérieur vers le cytosol, plutôt que de s’étendre vers l’extérieur comme une structure imbriquée. Barre d’échelle = 5 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Enfin, les fibres de lentilles nucléaires colorées sont comparées aux images des préparations MEB. Cette nouvelle méthode de fixation et de coloration des fibres de lentilles nucléaires préserve fidèlement la morphologie des fibres de lentilles nucléaires dans différentes zones de la lentille (Figure 8). Les cellules à fibres nucléaires ont des protubérances imbriquées peu fréquentes et plus grandes le long de leurs côtés courts (flèches). Les fibres de lentilles nucléaires les plus externes ont une texture de membrane cellulaire rugueuse, comme on le voit à la fois dans les images MEB et les cellules colorées. Au fur et à mesure que les cellules subissent un compactage supplémentaire vers le centre du noyau, des interdigitations de rainure et de languette apparaissent le long de la membrane cellulaire (astérisques), et les fibres nucléaires les plus internes ont une morphologie de membrane globulaire qui peut être appréciée sur l’image MEB et avec la coloration WGA. La F-actine n’est plus enrichie au niveau de la membrane cellulaire, mais forme un réseau remplissant le cytoplasme et s’étendant faiblement dans les protubérances.
Figure 8 : Images MEB et microscope confocal de cellules à fibres de lentilles nucléaires. Les cellules fibreuses pour la microscopie confocale sont colorées avec du WGA (vert) et de la phalloïdine (F-actine, rouge). (A) Les images MEB des fibres nucléaires des couches les plus externes vers le centre de la lentille révèlent des protubérances imbriquées peu fréquentes et plus grandes sur les côtés courts des cellules (flèches). La membrane cellulaire est rugueuse dans ces cellules, avec des interdigitations en rainure et languette (astérisques) et une morphologie de membrane globulaire dans les cellules les plus internes. (B) Les reconstructions 3D d’empilements confocaux en z à travers des fibres de lentilles nucléaires uniques ont des caractéristiques comparables à celles des images MEB, y compris les protubérances le long des côtés courts (flèches), les interdigitations à rainure et languette (astérisques) et la morphologie membranaire rugueuse qui est apparente avec la coloration WGA. La F-actine forme un réseau qui remplit le cytoplasme cellulaire et s’étend faiblement dans les protubérances. Barres d’échelle = 5 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Ce protocole a démontré les méthodes de fixation, de préservation et d’immunomarquage qui préservent fidèlement la morphologie membranaire 3D de faisceaux ou de cellules de fibres de lentilles singulières à différentes profondeurs dans le cristallin. Les fibres de lentilles colorées sont comparées aux préparations MEB qui ont longtemps été utilisées pour étudier la morphologie des cellules des fibres de lentilles. Les résultats montrent des structures membranaires comparables entre les deux préparations. L’EM reste l’étalon-or pour l’étude de la morphologie cellulaire, mais l’immunomarquage est plus difficile dans les échantillons MEB pour localiser les protéines33,34,35 et nécessite un microscope électronique pour être imagé. L’avantage de cette méthode d’immunomarquage est que plusieurs cibles peuvent être marquées à la fois et que les images sont recueillies au microscope confocal.
Bien que la méthode préserve la morphologie cellulaire complexe, le MEB est toujours nécessaire pour comparer les interdigitations entre les fibres de cristallin témoins et altérées en raison de mutations génétiques, du vieillissement, de traitements pharmaceutiques, etc. La préparation d’immunomarquage crée un mélange de cellules du cortex ou du noyau du cristallin qui sont réparties de manière aléatoire sur la lame. Ainsi, si la morphologie des cellules est altérée, il peut être plus difficile de discerner la profondeur à laquelle les cellules étaient situées dans le cristallin avant la dissociation pour la coloration. Dans ces cas, il peut être nécessaire de disséquer davantage la lentille dans les régions d’intérêt après la fixation et la coloration de plus petits faisceaux de fibres de lentille pour une plus grande précision spatiale. Les résultats de coloration doivent également être comparés aux images MEB pour s’assurer que les fibres immunocolorées préservent la morphologie des cellules altérées.
Il a été démontré pour la première fois que les cellules de fibres nucléaires peuvent également être préservées pour la coloration à l’aide de cette méthode nouvellement créée. Il est important d’enlever le cortex du cristallin avant la fixation du noyau car la pénétration du fixateur n’atteint pas le noyau du cristallin lors de la fixation de l’ensemble du cristallin27. La méthode de ce protocole pour isoler le noyau du cristallin décrit l’élimination mécanique des fibres corticales plus molles. Ceci est possible dans les lentilles de rongeurs en raison du noyau de lentille très dur et compact 28,30,36. Chez d’autres espèces, le noyau du cristallin est plus mou et peut nécessiter d’autres méthodes pour isoler ces cellules à des fins de coloration. Auparavant, une méthode de vortex était utilisée pour retirer les cellules de fibres corticales d’une lignée de souris knock-out avec un noyau de lentille plus mou qui ne pouvait pas être isolé de manière fiable par ablation mécanique29.
Bien que nous n’ayons pas démontré de coloration primaire des anticorps dans ces données représentatives, nous avons déjà effectué le même type de coloration avec des anticorps primaires et des anticorps secondaires appropriés22,23. D’après notre expérience, de nombreuses protéines membranaires ont un signal de ponctuation, et donc l’utilisation de WGA ou de F-actine dans les fibres corticales ou de WGA dans les fibres nucléaires est recommandée pour délimiter clairement la membrane cellulaire afin de mieux localiser les protéines de la membrane cellulaire et de reconnaître chaque étape de la différenciation et de la maturation cellulaires. La coloration WGA ou F-actine doit se faire dans un canal visible (rouge, vert ou bleu) pour permettre à l’observateur de trouver facilement les cellules appropriées pour l’imagerie à l’aide de l’oculaire. Ce type de coloration de la membrane peut également aider à identifier les dommages causés aux cellules par le processus de fixation, de coloration et de montage afin d’exclure les cellules endommagées mécaniquement. Dans ce travail et dans les précédents22,23, on observe rarement des cellules endommagées mécaniquement.
Cette méthode nécessite un examen patient et systématique des cellules pour l’imagerie. Le mélange aléatoire de cellules peut être assez intimidant à première vue, mais les cellules qui se trouvent dans l’orientation optimale peuvent généralement être trouvées. Cette méthode pourrait être adaptée pour les fibres de lentilles isolées d’autres espèces. Dans les lentilles plus grandes, il peut être possible d’utiliser une dissection minutieuse pour séparer les différentes couches de cellules avant l’immunomarquage. En résumé, cette étude a permis de créer une méthode robuste et fiable pour préserver des faisceaux de fibres ou des cellules monofibres afin d’étudier leur morphologie complexe et de localiser les protéines en 3D dans ces cellules spécialisées. Ce protocole unique pour la coloration des fibres nucléaires ouvre un nouveau domaine d’étude sur les fibres centrales du cristallin, moins bien étudiées.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la subvention R01 EY032056 (à CC) du National Eye Institute. Les auteurs remercient la Dre Theresa Fassel et Kimberly Vanderpool de l’installation de microscopie de base de recherche Scripps pour leur aide avec les images au microscope électronique.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% Triton X-100 | FisherScientific | BP151-500 | |
| 60mm plate | FisherScientific | FB0875713A | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 10X phosphate buffered saline | ThermoFisher | 70011-044 | |
| 1X phosphate buffered saline | ThermoFisher | 14190136 | |
| 48-well plate | CytoOne | CC7672-7548 | |
| Cover slips (22 x 40 mm) | FisherScientific | 12-553-467 | |
| Curved tweezers | World Precision Instruments | 501981 | |
| Dissection microscope | Carl Zeiss | Stereo Discovery V8 | |
| Fine tip straight tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72707-01 | |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | FisherScientific | 12-550-15 | |
| LSM 800 confocal microscope with Airyscan (63X) and Zen 3.5 Software | Carl Zeiss | ||
| Nail polish | |||
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Phalloidin (rhodamine) | ThermoFisher | R415 | |
| Primary antibody | |||
| Scalpel Feather Disposable, steril, No. 11 | VWR | 76241-186 | |
| Secondary antibody | |||
| Straight forceps | World Precision Instruments | 11252-40 | |
| Thermo Scientific Nunc MicroWell MiniTrays (dissection tray) | FisherScientific | 12-565-154 | |
| Ultra-fine scissors | World Precision Instruments | 501778 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Wheat germ agglutinin (fluorescein) | Vector Laboratories | FL-1021-5 |
References
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