Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

הכנה וצביעה אימונופלואורסצנטית של צרורות ותאי סיבים בודדים מקליפת המוח וגרעין עדשת העין

Published: June 9, 2023 doi: 10.3791/65638
Automatic Translation
1, 1
1School of Optometry and Vision Science Program, Indiana University

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטות להכנת תאי סיבי עדשת עין היקפיים, בוגרים וגרעיניים לצביעת אימונופלואורסנציה כדי לחקור אינטרדיגיטציות מורכבות בין תאים ואת ארכיטקטורת הממברנה.

Abstract

העדשה היא איבר שקוף ואליפסואידי בחדר הקדמי של העין שמשנה צורה כדי למקד אור עדין על הרשתית ליצירת תמונה ברורה. חלק הארי של רקמה זו מורכב מתאי סיבים מיוחדים, ממוינים, בעלי חתך משושה ונמשכים מהקוטב הקדמי ועד האחורי של העדשה. תאים ארוכים ורזים אלה מנוגדים מאוד לתאים שכנים ויש להם אינטרדיגיטציות מורכבות לאורך התא. המבנים השלובים המיוחדים נדרשים לתכונות ביומכניות רגילות של העדשה ותוארו בהרחבה באמצעות טכניקות של מיקרוסקופ אלקטרונים. פרוטוקול זה מדגים את השיטה הראשונה לשימור ואימונוסטיין יחיד כמו גם צרורות של תאי סיבי עדשה עכבריים כדי לאפשר לוקליזציה מפורטת של חלבונים בתוך תאים בעלי צורה מורכבת זו. הנתונים המייצגים מראים צביעה של תאי הסיבים ההיקפיים, המתמיינים, הבוגרים והגרעיניים בכל אזורי העדשה. שיטה זו יכולה לשמש באופן פוטנציאלי על תאי סיבים שבודדו מעדשות של מינים אחרים.

Introduction

העדשה היא רקמה שקופה וביצית בחדר הקדמי של העין שמורכבת משני סוגי תאים, תאי אפיתל ותאי סיבים 1 (איור 1). יש monolayer של תאי אפיתל המכסה את ההמיספרה הקדמית של העדשה. תאי סיבים נבדלים מתאי אפיתל ומהווים את עיקר העדשה. תאי הסיבים המתמחים עוברים תהליך התארכות, התמיינות והבשלה, המתבטא בשינויים ברורים במורפולוגיית קרום התא מפריפריית העדשה למרכז העדשה 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 ידוע גם בשם גרעין העדשה., תפקידה של העדשה למקד אור עדין המגיע ממרחקים שונים אל הרשתית תלוי בתכונותיה הביומכניות, כולל קשיחות ואלסטיות 13,14,15,16,17,18,19. האינטרדיגיטציות המורכבות של סיבי העדשה הועלו20,21 ולאחרונה הוכחו כחשובות לנוקשות העדשה22,23.

Figure 1
איור 1: דיאגרמות אנטומיה של עדשה ותמונות של מיקרוסקופ אלקטרונים סורק מייצג (SEM) מסיבי עדשה. הקריקטורה מראה מבט אורכי (קדמי עד אחורי מלמעלה למטה) של השכבה הקדמית של תאי אפיתל (מוצללת בתכלת) ומסה גדולה של תאי סיבי עדשה (לבן). מרכז העדשה (מוצלל בוורוד) ידוע כגרעין והוא מורכב מתאי סיבים דחוסים מאוד. מימין, קריקטורה בחתך רוחב חושפת את צורת תא המשושה המוארך של סיבי עדשה הארוזים בתבנית חלת דבש. לתאי סיבים יש שני צדדים רחבים וארבעה צדדים קצרים. תמונות SEM מייצגות לאורך החלק התחתון מראות את האינטרדיגיטציות המורכבות של הממברנה בין תאי סיבי העדשה בעומקים שונים של העדשה. מימין, סיבי עדשה חדשים שנוצרו בשולי העדשה הם בעלי בליטות קטנות לאורך הצדדים הקצרים וכדורים ושקעים לאורך הצד הרחב (קופסאות אדומות). במהלך ההתבגרות, סיבי העדשה מפתחים אזורי משוטים גדולים המעוטרים על ידי בליטות קטנות לאורך הצדדים הקצרים (קופסאות כחולות). תאי סיבים בוגרים הם בעלי תחומי משוט גדולים המודגמים על ידי בליטות קטנות. תחומים שלובים אלה חשובים לתכונות ביומכניות של העדשה. לתאי סיבים בגרעין העדשה יש פחות בליטות קטנות לאורך הצדדים הקצרים שלהם ויש להם אינטרדיגיטציות מורכבות של לשון וחריץ (קופסאות סגולות). הצדדים הרחבים של התא מציגים מורפולוגיה של קרום כדורי. הקריקטורה שונתהמ-22,32 ולא צוירה בקנה מידה. סרגל קנה מידה = 3 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

העדשה גדלה על ידי הוספת קליפות של תאי סיבים חדשים על גבי הדורות הקודמים של סיבים24,25. לתאי סיבים יש צורת חתך משושה מוארכת עם שתי צלעות רחבות וארבע צלעות קצרות. תאים אלה משתרעים מהקוטב הקדמי לקוטב האחורי של העדשה, ובהתאם למין, סיבי העדשה יכולים להיות באורך של כמה מילימטרים. כדי לתמוך במבנה של תאים מוארכים ורזים אלה, אינטרדיגיטציות מיוחדות לאורך הצדדים הרחבים והקצרים יוצרות מבנים שלובים כדי לשמור על צורת העדשה ועל התכונות הביומכניות. שינויים בצורת קרום התא במהלך התמיינות ובגרות תאי סיבים תועדו בהרחבה על ידי מחקרי מיקרוסקופ אלקטרונים (EM) 2,3,4,5,6,7,8,9,10,20,26,27,28,29 . לתאי סיבים שזה עתה נוצרו יש כדורים ושקעים לאורך הצדדים הרחבים שלהם עם בליטות קטנות מאוד לאורך הצדדים הקצרים שלהם, בעוד שלסיבים בוגרים יש בליטות משתלבות ומשוטים לאורך הצדדים הקצרים שלהם. סיבים גרעיניים מציגים אינטרדיגיטציות של לשון וחריץ ומורפולוגיה של קרום כדורי. מעט ידוע על החלבונים הדרושים לממברנות שלובות מורכבות אלה. מחקרים קודמים על לוקליזציה של חלבונים בתאי סיבים הסתמכו על מקטעי רקמת העדשה, שאינם מאפשרים הדמיה ברורה של ארכיטקטורת התא המורכבת.

עבודה זו יצרה ושכללה שיטה חדשנית לקיבוע בודדים וצרורות של תאי סיבי עדשה כדי לשמר את המורפולוגיה המורכבת ולאפשר צביעה חיסונית של חלבונים בקרום התא ובתוך הציטופלסמה. שיטה זו משמרת נאמנה את ארכיטקטורת קרום התא, הדומה לנתונים ממחקרי EM, ומאפשרת צביעה בנוגדנים ראשוניים לחלבונים ספציפיים. בעבר יש לנו סיבי עדשה קורטיקלית חיסונית שעוברים התמיינות והתבגרות22,23. בפרוטוקול זה קיימת גם שיטה חדשה להכתמת תאי סיבים מגרעין העדשה. פרוטוקול זה פותח את הדלת להבנת מנגנוני היווצרות ושינויים באינטרדיגיטציות של ממברנות במהלך הבשלת תאי סיבים ודחיסת גרעין העדשה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

עכברים טופלו על בסיס פרוטוקול בעלי חיים שאושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת אינדיאנה בבלומינגטון. העכברים ששימשו ליצירת נתונים מייצגים היו חיות ביקורת (מסוג בר) ברקע C57BL6/J, נקבות ובנות 8-12 שבועות. ניתן להשתמש הן בעכברים זכרים והן בנקבות לניסוי זה, מאחר שהסבירות שמין העכברים תשפיע על תוצאות הניסוי נמוכה מאוד.

1. דיסקציה של עדשה ועריפת ראשים

  1. המתת חסד של עכברים בעקבות "המדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה" של המכונים הלאומיים לבריאות וכן פרוטוקולים לשימוש בבעלי חיים שאושרו על ידי המוסד.
    הערה: במחקר הנוכחי, עכברים הומתו על ידי מנת יתר של CO2 ואחריה פריקת צוואר הרחם בהתאם לפרוטוקול מאושר של בעלי חיים (אוניברסיטת אינדיאנה).
  2. לחנך את העיניים מהעכברים באמצעות מלקחיים מעוקלים על ידי דיכוי הרקמה סביב העיניים עם צד אחד של המלקחיים כדי להזיז את העין מחוץ לשקע. לאחר מכן, סגור את המלקחיים מתחת לעין והרים כדי להסיר את העין מהשקע. העבירו את העיניים למי מלח טריים חוצצי פוספט (PBS) במגש דיסקציה.
  3. חותכים את עצב הראייה עם מספריים עדינים במיוחד קרוב ככל האפשר לגלגל העין. יש להחדיר בזהירות פינצטה ישרה בעלת קצה דק לתוך גלגל העין דרך יציאת עצב הראייה בחלק האחורי של העין.
  4. מכניסים בזהירות מספריים באותו מיקום כמו הפינצטה בשלב 1.3 ומתחילים לחתוך חתך מהאחורי לכיוון צומת הקרנית-סקלרלית.
    הערה: עדשות מכרסמים תופסות ~30% מהעיניים. נזק מקרי יתרחש אם הפינצטה או המספריים מוחדרים עמוק מדי לתוך העין.
  5. ממשיכים לחתוך לאורך צומת הקרנית-סקלרלית עד להפרדת לפחות מחצית הצומת.
  6. השתמש בפינצטה כדי ללחוץ בעדינות על הקרנית כך שהעדשה תוכל לצאת דרך החתך שנעשה בשלבים 1.4 ו -1.5.
  7. הסר בזהירות חתיכות גדולות של רקמה מהעדשה באמצעות פינצטה ישרה בעלת קצה עדין. בדוק את העדשה כדי למצוא את האזור המשווני.
  8. ניקבו את העדשה בצורה רדודה באמצעות פינצטה ישרה בעלת קצה דק, ולאחר מכן הסירו את קפסולת העדשה. המסה של תאי סיבי העדשה תישאר שלמה, והחד-שכבה האפיתל של העדשה תישאר מחוברת לכמוסת העדשה. יש להשליך את כמוסת העדשה.

2. צביעת תא סיב בודד בעדשה

  1. העבירו את מסת תאי סיבי העדשה לצלחת באר עם 500 μL של תמיסת 1% פרפורמלדהיד (PFA; ב-1x PBS) ודגרו על הדגימות בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה עם אגוז עדין (איור 2A).
    הערה: הנפחים עבור הפתרונות שניתנו מותאמים ללוחות של 48 בארות. אם משתמשים בצלחת או צינורות בגודל אחר, התאימו את נפחי הפתרונות בהתאם. תמיסות קיבוע, חסימה ושטיפה (1x PTX, 0.1% Triton X-100 ב-1x PBS) יוצרו עם 10x PBS ומים מזוקקים כפול (ddH2O) לריכוז סופי של 1x PBS.
  2. העבירו את תאי סיבי העדשה לצלחת של 60 מ"מ עם 1% PFA. השתמשו באזמל חד כדי לפצל את כדור תאי הסיבים לשניים לאורך הציר הקדמי-אחורי שלו (איור 2B). חותכים את החצאים לשניים שוב לאורך אותו ציר כדי לייצר רבעים.
    הערה: הציר הקדמי-אחורי מזוהה בקלות על ידי כיוון תאי הסיבים במסת הרקמה.
  3. השתמשו בפינצטה ישרה כדי להסיר את אזור הגרעין מרבעי תאי סיבי העדשה (איור 2C).
    הערה: אזור גרעין העדשה קשיח בעדשות מכרסמים, ומרכז העדשה ייפרד בקלות מסיבי קליפת המוח הרכים יותר.
  4. לאחר מכן תקן את רבעי אזור קליפת המוח של העדשה ב- 200 μL של 1% PFA למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT) עם טלטול עדין (300 סל"ד בשייקר צלחת).
  5. שטפו את רבעי הרקמה פעמיים ב-750 מיקרוליטר של 1x PBS במשך 5 דקות כל אחד עם טלטול עדין ב-RT.
  6. חסום את הדגימות באמצעות 200 μL של תמיסת חסימה (5% סרום, 0.3% Triton X-100, 1x PBS) למשך שעה אחת ב- RT עם טלטול עדין.
    הערה: עבור הנתונים המייצגים בפרוטוקול זה, הדגימות לא הוכתמו בנוגדנים ראשוניים או משניים. לאחר שלב החסימה, הדגימות הודגרו עם אגלוטינין נבט חיטה (WGA; 1:100) ופאלואידין (1:100) (ראה טבלת חומרים) במשך 3 שעות ב- RT עם טלטול עדין והגנה מפני אור. צביעת נוגדנים ראשונית הודגמה בפרסומים קודמים22,23.
  7. יש לדגור עם 100 μL של תמיסת נוגדנים ראשונית למשך הלילה ב-4°C עם רעידות עדינות.
    הערה: הנוגדנים מדוללים בתמיסת חסימה. לעומת שקופיות עם קטעי רקמות, יש יותר תאים בסוג זה של הכנה. יש להגדיל את ריכוזי הנוגדנים הראשוניים כדי לספק נוגדנים בשפע כדי להכתים תאים נוספים. מומלץ להכפיל את ריכוז הנוגדנים ממה שמשתמשים בו על חלקי רקמות. כנ"ל לגבי נוגדנים משניים.
  8. שטפו את רבעי הטישו שלוש פעמים עם 1x PTX (0.1% Triton X-100, 1x PBS) במשך 5 דקות כל אחד ב-RT עם רעד עדין.
  9. לדגור על תאי הסיבים עם 100 μL של נוגדן/תמיסת צבע משנית במשך 3 שעות ב- RT עם ניעור עדין. הגן על הדגימות מפני אור במהלך שלב זה והשלבים הבאים.
    הערה: ניתן להוסיף WGA, פאלואדין וצבעים פלואורסצנטיים אחרים לתמיסת הנוגדנים המשנית לתיוג סימולטני של קרום התא, השלד הציטו-שלד או אברונים אחרים תוך סימון הנוגדן הראשוני.
  10. שטפו את תאי הסיבים ארבע פעמים עם PTX אחד במשך 5 דקות כל אחד ב-RT עם ניעור עדין.
  11. הוסף טיפה אחת או 50 מיקרוליטר של מדיית הרכבה לשקופית מיקרוסקופ טעונה פלוס לפני העברת רבעי הרקמה לשקופית.
  12. השתמשו בפינצטה כדי להפריד בעדינות את תאי הסיבים זה מזה ונסו להגביל את החפיפה בין צרורות התאים.
  13. החל בעדינות כיסוי #1.5 על גבי הדגימה במדיית הרכבה. אמצעי ההרכבה צריכים להתפשט לקצה הכיסוי; אם מצב זה אינו מתרחש, הוסף אמצעי הרכבה נוספים לקצה הכיסוי. יש לשאוף החוצה את עודפי אמצעי ההרכבה סביב קצה הכיסוי ולהשתמש בלק כדי לאטום את קצוות הכיסוי במגלשה.
    הערה: כל סוג של אמצעי הרכבה המנוסח עבור מיקרוסקופ קונפוקלי יכול לשמש לניסויים אלה.

3. גרעין עדשה צביעת תא סיב בודד

  1. השלם את הדיסקציה המתוארת בסעיף 1.
  2. הסר באופן מכני את סיבי קליפת המוח מהכדור של תאי סיבי העדשה, ועוזב את גרעין העדשה, על ידי העברה עדינה של מסת תא הסיבים לקצות אצבעות רטובות וכפפות וגלגול עדין של מסת הרקמה.
    הערה: בעדשות עכבר, גלגול כדור תאי סיבי העדשה בין קצות אצבעות הכפפות הוא שיטה יעילה להסרת תאי סיבי קליפת המוח מגרעין העדשה הקשה28,30. עבור עדשות שבהן שיטה מכנית זו אינה יעילה, ניתן להשתמש בדיסקציה זהירה או בשיטת מערבולות29 כדי להסיר את תאי סיבי קליפת המוח.
  3. העבירו את גרעין העדשה לתמיסת 1% PFA טרייה בצלחת טובה ודגרו למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C עם ניעור עדין.
  4. מעבירים את הדגימה לצלחת 60 מ"מ עם 1% PFA ומשתמשים באזמל חד כדי לפצל את גרעין העדשה לאורך הציר הקדמי-אחורי. הפחיתו שוב את דגימות הרקמה בחצי כדי לייצר רבעי גרעין.
  5. בצע את התהליך המתואר בשלבים 2.4-2.13 עבור immunostaining והרכבה דגימה.

Figure 2
איור 2: סיכום גרפי המפרט את ההכנה והצביעה החיסונית של תאי סיבי העדשה . (A) לוחית זו, בעלת 48 בארות, קודדה בצבע לפי עמודה כדי להדגים את הגדרת לוח הדגימה עבור השיטות המתוארות, ומאפשרת העברה קלה של דגימות בין שלבי החיסון השונים על ידי טיפול עדין באמצעות מלקחיים. בעוד הנתונים המייצגים עבור פרוטוקול זה אינם מודגרים עם נוגדן ראשוני, התרשים כולל עמודה עבור דגירה נוגדנים ראשוניים, ואת הבארות לשטיפה ניתן לעשות שימוש חוזר לאחר הסרת מאגרי כביסה משומשים על ידי שאיפה. (B) לאחר קיבוע מסת תאי סיבי העדשה, הרקמה מפוצלת לאורך הציר הקדמי-אחורי (קווים מקווקווים אדומים) כדי לשמר את המבנה המקורי של התאים. לאחר שמסת הרקמה נחתכה בחצי, הדגימות מסובבות והחצאים מפוצלים לרבעים לאורך הציר הקדמי-אחורי (קווים מקווקווים אדומים). (C) הסרת אזור גרעין העדשה (בוורוד) נעשית בקלות באמצעות פינצטה כדי לחפור את הרקמה המרכזית הצפופה מתאי הסיבים בקליפת המוח (בכחול). דיאגרמות מצוירות נוצרו בחלקן באמצעות BioRender.com ולא צוירו בקנה מידה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תאי סיבי העדשה מוכנים מקליפת המוח של העדשה (סיבים מתמיינים וסיבים בוגרים) ומהגרעין, והתאים מוכתמים בפלואידין עבור F-אקטין ו-WGA עבור קרום התא. תערובת של צרורות תאים או סיבי עדשה בודדים (איור 3) נצפית ומצולמת. מקליפת המוח של העדשה נמצאים שני סוגי תאים (איור 3A). תאי סיבים מתמיינים בפריפריה של העדשה הם ישרים, עם בליטות קטנות מאוד לאורך הצדדים הקצרים שלהם. ככל שהתא מתמיין, תאי הסיבים הופכים גליים עם בליטות משתלבות קטנות. יתר על כן, לאורך תהליך ההתבגרות, תאי סיבים לפתח משוטים גדולים מעוטרים בליטות משתלבות קטנות. גרעין העדשה קומפקטי וקשיח מאוד בעדשות עכבר, ומבודד באמצעות הסרה מכנית של קליפת המוח הרכה יותר של העדשה לפני קיבוע וצביעה של סיבי העדשה הגרעינית. מגרעין העדשה מתגלים צרורות של סיבי עדשה בקוטר קטן יותר ובעל מבנה קרום עדין שלא ניתן לראותו בקלות בתמונה בהגדלה נמוכה.

בשחזורים תלת-ממדיים בהגדלה גבוהה של תאי סיבי עדשה מאזורים שונים של העדשה (איור 3B), נמצא כי F-אקטין ו-WGA עוברים לוקליזציה גבוהה בקרום התא בתאי סיבים מתמיינים ובשלים. F-אקטין מועשר בבלטות המשתלבות לאורך קרום התא בסיבים מתמיינים ובשלים (איור 3B, ראשי חץ). תאי סיבים בוגרים מפתחים משוטים משתלבים גדולים (איור 3B, כוכביות). צביעת WGA אינה מלוקלית לחלוטין עם אות F-אקטין במיוחד בתא הסיבים הבוגר, דבר המצביע על כך שרשת האקטין בקליפת המוח אינה תומכת בכל המבנים הקטנים יותר לאורך קרום התא. באופן בלתי צפוי, נמצא כי רשת F-actin נמצאת בתוך הציטופלסמה של תאי סיבים גרעיניים. בעוד שהאות F-actin משתרע לתוך הבליטות (איור 3B, חיצים) לאורך קרום תא הסיב הגרעיני, רשת האקטין כבר אינה מועשרת ליד קרום התא או בתוך הבליטות. המורפולוגיה של תא הסיב הגרעיני חסרה משוטים, בנוסף לירידה בארגון ובתדירות הבליטות.

Figure 3
איור 3: תמונות קונפוקליות של צרורות (הגדלה נמוכה) ותמונות בודדות (הגדלה גבוהה) של תאי סיבים מאזורים שונים של העדשה. התאים מוכתמים ב-WGA (קרומי תאים, ירוק), פאלואדין (F-אקטין אדום) ו-DAPI (גרעינים, כחולים). (A) בתכשירים האלה, לעתים קרובות ניתן למצוא צרורות של תאי סיבי עדשה מאזורים שונים. בתכשירים קליפת המוח, ישנם תאי סיבים מתמיינים ובוגרים. לתאים שונים אלה יש מורפולוגיות נפרדות, המאפשרות זיהוי קל. בדגימות מגרעין העדשה נמצאים צרורות תאי סיבים וכן סיבים מנותקים. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. (B) נאספות ערימות Z דרך תאי סיב מתמיינים, בוגרים וגרעיניים יחידים, ועיבוד תלת-ממדי משמש לשחזור התמונות המוצגות. לסיבים המבדילים והבוגרים יש הרבה בליטות קטנות לאורך הצדדים הקצרים שלהם (ראשי החץ מסמנים סיבים נבחרים). בליטות קטנות אלה מועשרות עבור F-actin. לסיב הבוגר יש גם תחומי משוטים משתלבים גדולים (כוכביות). לסיבי הגרעין כיסי ממברנה קטנים ודיבות המוכתמות על ידי WGA ושומרים על כמה בליטות לאורך צידיהם הקצרים (חיצים). באופן מפתיע, רשת F-actin מופצת כעת בציטופלסמה של התא ללא אותות מועשרים בקרום התא. רשת F-actin אכן מתרחבת לבליטות קטנות. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

כאשר תאי הסיבים נבדקים, חשוב לציין את כיוון התאים כדי למנוע בלבול לגבי סוג התא שנצפה. ערימות Z נאספות דרך התאים, ולאחר מכן שחזור תלת-ממדי משמש כדי להסתכל על הקרנות דו-ממדיות אורתוגונליות במישורים XY, XZ ו-YZ. בשל הכיוון האקראי של התאים בהכנה זו, ייתכן שיהיו תאים שאינם שוכבים שטוחים לחלוטין על מגלשת הזכוכית (איור 4). כל התאים בתמונה מייצגת זו הם סיבי עדשה בוגרים, אך לכל תא יש מראה שונה באופן דרסטי במישור XY. התא בצבע פסאודו-ירוק מכוון כלפי צד רחב עם משוטים ובלטות גלויים, בעוד התא בצבע פסאודו בוורוד שוכב עם הצד הקצר למעלה. ניתן לדמיין זאת בקלות רבה יותר במישור XZ, המציג את הכיוונים הניצבים של שני התאים המוצגים במישור XY. בחינה של מישור YZ מראה בבירור את המשוטים של הסיב הבוגר שנצבע בוורוד ממישור XY.

Figure 4
איור 4: הקרנות דו-ממדיות אורתוגונליות (מישורי XY, XZ ו-YZ) של ערימות z קונפוקליות תלת-ממדיות דרך קבוצה של תאי סיבי עדשה בוגרים בודדים המוכתמים בפלואידין עבור F-אקטין (F-actin). שני תאים צבועים בפסאודו-צבע בוורוד או ירוק לצורך זיהוי בכל מישור. במישור XY, התא הוורוד שוכב כשצדו הקצר פונה כלפי מעלה, ואילו התא הירוק שוכב שטוח כשצדו הרחב פונה כלפי מעלה. במישור XZ, הוא ציין כי התא הוורוד מוטה בכיוון, בעוד התא הירוק מקביל לשקופית זכוכית. במישור YZ, המשוטים והבליטות של התאים הוורודים נצפים, המאשרים כי תא זה הוא תא סיבים בוגר. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

מאחר שעוביים של סיבים הוא בערך 25,31 מיקרומטר, אפשר באמצעות אוסףשל ערימות z לראות את פני התא או מישור דרך הציטופלסמה (איור 5). זה עובד הכי טוב על תאים שהם כמעט מקבילים עם הכיסוי, עם הצד הרחב של התא פונה כלפי מעלה. ניתן להעריך את פני התא בתא הסיב הבוגר הזה על-ידי התבוננות באות WGA (איור 5A). מישור XZ מראה בבירור שמישור XY זה נמצא לאורך הצד הרחב של התא. פונקטה קטנה מסוג WGA+ לאורך הממברנה מרמזת על מורפולוגיה גסה של פני השטח של התא. הבליטות הקטנות לאורך הצד הקצר בתמונות בעלות חשיפה נמוכה מראות אות F-אקטין מועשר מאוד. בחשיפה גבוהה יותר, כאשר אות F-actin בבלטות רווי, נצפתה רשת F-actin מרושתת עדינה על פני קרום התא (כוכביות). כאשר מישור XY נחשב דרך הציטופלסמה של הסיב הבוגר (איור 5B), צביעת WGA נצפית בעיקר לאורך קרום התא. בדומה למה שנראה על פני התא, F-actin מועשר בבלטות לאורך הצדדים הקצרים, עם רשת ציטופלזמית מרושתת F-actin גלוי בחשיפה גבוהה יותר (כוכביות). עבודתנו הקודמת הראתה צביעה של חלבוני ממברנה במישורי XY דרך ציטופלסמת התא22,23, אך בשיטה זו ניתן גם למקם חלבונים לאורך פני התא הרחבים.

Figure 5
איור 5: הקרנות דו-ממדיות אורתוגונליות (מישורי XY ו-XZ) של ערימות z קונפוקליות תלת-ממדיות דרך תא סיב בוגר יחיד המוכתם ב-WGA (ירוק) ופאלואדין (F-actin, אדום). (A) הקרנות מפני השטח של התא לאורך הצד הרחב מראות WGA לאורך קרום התא, והנקב של WGA מצביע על כך שהקרום אינו חלק לחלוטין. F-actin מועשר בבלטות לאורך הצדדים הקצרים, ותמונה בחשיפה גבוהה של צביעת F-actin חושפת רשת מרושתת לאורך קרום התא (כוכביות). (B) מישור אחר דרך הציטופלסמה של אותו תא מראה WGA לאורך קרום התא, מסגור התא. F-אקטין יוצר רשת מרושתת דרך הציטופלסמה (כוכביות) ומועשר מאוד בבלטות לאורך קרום התא. פסי קנה מידה = 5 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

לאחר מכן, משווים תמונות של סיבי עדשה מניסויי EM סורק (SEM) וצביעה. ניסויי SEM מבוצעים כמתואר לעיל29, והתמונות נלקחות ברצף ממרכז הדגימה לפריפריה. ראשית, נבדקים סיבי עדשה בעלי בליטות קטנות (איור 6, חיצים) לאורך צידיהם הקצרים וכדור ושקע (ראשי חץ) לאורך צידיהם הרחבים. בדומה לתמונת SEM (איור 6A), בצרור של סיבים מתמיינים המכוונים לאורך הצדדים הקצרים שלהם, האינטרדיגיטציות של הכדור והשקע הן בליטות וחריצים גדולים המשתרעים לאורך הצד הרחב של התאים (איור 6B, ראשי חץ). שקע נמצא (איור 6C, ראשי חץ) כאשר התא בהקרנות הדו-ממדיות האורתוגונליות XY ו-XZ נצפה בסיבי עדשה מתמיינים יחידים. בליטות משתלבות קטנות לאורך הצדדים הקצרים נשמרות נאמנה גם בתאי סיבי עדשה מוכתמים אלה בהשוואה לאלה שבתמונת SEM (חיצים). לאחר מכן, המורפולוגיה של תאי סיבים בוגרים נחקרת (איור 7). בתמונת SEM ובתא המוכתם יש דיווטים קטנים לאורך הצד הרחב של התאים (איור 7A,B, ראשי חץ). יש להניח שאלו הם שרידים של האינטרדיגיטציות הכדוריות והשקעיות שמתכווצות במהלך תהליך ההבשלה. המשוטים הגדולים (כוכביות) המעוטרים בבלטות משתלבות קטנות (חיצים) דומים בין התאים ב- SEM לבין הסיב הבוגר המוכתם. לתאים בתמונת SEM יש גם חריצים ברורים שבהם בליטה משתלבת עוגנת בקרום התא (איור 7C, ראשי חץ). ניתן לראות את החריצים האלה גם בתאים המוכתמים האלה, והם מתמלאים על-ידי אות WGA (איור 7D, ראשי חץ). החריצים יכולים להיראות כמו בליטות ההולכות פנימה לכיוון הציטופלסמה של התא במקום להקרין החוצה מקרום התא, ולעתים קרובות רק צביעת WGA נראית בחריצים שיש להם מעט מאוד, אם בכלל, אות צביעת F-actin.

Figure 6
איור 6: תמונות SEM ומיקרוסקופ קונפוקלי של תאי סיבים מתמיינים מקליפת המוח של העדשה. תאי סיבים למיקרוסקופ קונפוקלי מוכתמים ב- WGA (ירוק) ופאלואידין (F-actin, אדום). (A) SEM של צרור סיבי עדשה מתמיינים מראה אינטרדיגיטציות של כדורים ושקעים (ראשי חץ) לאורך הצד הרחב של התאים עם בליטות (חיצים) משתלבות קטנות לאורך הצדדים הקצרים של התאים. (B) תמונות קונפוקליות של צרור סיבים מתמיינים שצולמו מהצדדים הקצרים מראות אינטרדיגיטציות גדולות של כדורים ושקעים לאורך הצדדים הרחבים של התאים (ראשי חץ). (C) הקרנות דו-ממדיות אורתוגונליות (מישורי XY ו-XZ) דרך סיב עדשה מבדיל יחיד מראות אינטרדיגיטציה של כדור ושקע (ראשי חץ) לאורך הצד הרחב ובלטות משתלבות קטנות לאורך הצד הקצר (חיצים). פסי קנה מידה = 5 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7: תמונות SEM ומיקרוסקופ קונפוקלי של תאי סיבים בוגרים מקליפת המוח של העדשה. תאי סיבים למיקרוסקופ קונפוקלי מוכתמים ב- WGA (ירוק) ופאלואידין (F-actin, אדום). (A) בתמונת SEM יש שני סיבים בוגרים משתלבים עם משוטים (כוכביות) המעוטרים בבלטות קטנות (חצים) לאורך הצדדים הקצרים של התאים. יש גם כניסות קטנות (ראשי חץ) לאורך הצד הרחב של התא. ייתכן שאלה השרידים המתכווצים של בליטות כדוריות ושקעיות. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר. (B) הקרנות דו-ממדיות אורתוגונליות (מישורי XY ו-XZ) דרך סיב עדשה בוגר יחיד כוללות משוטים גדולים משתלבים (כוכביות) ובלטות קטנות (חצים) לאורך הצדדים הקצרים של התאים. טבעות WGA+ קטנות (ראשי חץ), בדומה לכניסות בתמונת SEM, נראות לאורך הצד הרחב של התא. למבני WGA+ אלה אין צביעת F-אקטין (F-actin). F-אקטין מועשר בעיקר בקרום התא בבלטות הקטנות ובעל דפוס צביעה מרושת חלש בציטופלסמה. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר. (C) תמונת SEM של הסיבים הבוגרים המראה חריצים רבים בקרום התא (ראשי חץ), היכן שהבליטות מהתאים השכנים נחות ומשתלבות. סרגל קנה מידה = 2 מיקרומטר. (D) זוג סיבים בוגרים המופרדים זה עתה, ומראים חריצים (ראשי חץ) מוכתמים על-ידי WGA. החריצים אינם בעלי העשרה של צביעת F-actin ונראים כמו בליטות הנמשכות פנימה לכיוון הציטוזול, ולא נמשכות החוצה כמבנה משתלב. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

לבסוף, סיבי העדשה הגרעינית המוכתמת מושווים לתמונות מתכשירי SEM. שיטה חדשה זו לקיבוע והכתמה של סיבי עדשה גרעינית משמרת נאמנה את המורפולוגיה של סיבי העדשה הגרעינית באזורים שונים של העדשה (איור 8). לתאי סיבים גרעיניים יש בליטות משתלבות נדירות וגדולות יותר לאורך הצדדים הקצרים שלהם (חיצים). סיבי העדשה הגרעינית החיצוניים ביותר הם בעלי מרקם קרום תא מחוספס, כפי שניתן לראות הן בתמונות SEM והן בתמונות התא המוכתם. כאשר התאים עוברים דחיסה נוספת לכיוון מרכז הגרעין, מופיעות אינטרדיגיטציות של לשון וחריץ לאורך קרום התא (כוכביות), ולסיבים הגרעיניים הפנימיים ביותר יש מורפולוגיית קרום כדורית שניתן להעריך על תמונת SEM ועם צביעת WGA. F-אקטין אינו מועשר עוד בקרום התא, אלא יוצר רשת הממלאת את הציטופלסמה ומתרחבת בצורה חלשה לתוך הבליטות.

Figure 8
איור 8: תמונות SEM ומיקרוסקופ קונפוקלי של תאי סיבי עדשה גרעינית. תאי סיבים למיקרוסקופ קונפוקלי מוכתמים ב- WGA (ירוק) ופאלואידין (F-actin, אדום). (A) תמונות SEM של סיבי גרעין מהשכבות החיצוניות ביותר לכיוון מרכז העדשה חושפות בליטות משתלבות נדירות וגדולות יותר בצדדים הקצרים של התאים (חיצים). קרום התא מחוספס בתאים אלה, עם אינטרדיגיטציות לשון וחריץ (כוכביות) ומורפולוגיה של קרום כדורי בתאים הפנימיים ביותר. (B) לשחזורים תלת-ממדיים של ערימות z קונפוקליות דרך סיבי עדשה גרעינית יחידה יש תכונות דומות לאלה של תמונות SEM, כולל בליטות לאורך הצדדים הקצרים (חצים), אינטרדיגיטציות לשון וחריץ (כוכביות), ומורפולוגיה של הממברנה המחוספסת הניכרת עם צביעת WGA. F-actin יוצר רשת הממלאת את הציטופלסמה של התא ומתרחבת בצורה חלשה לתוך הבליטות. פסי קנה מידה = 5 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה הדגים את שיטות הקיבוע, השימור והצביעה החיסונית המשמרת נאמנה את המורפולוגיה של הממברנה התלת-ממדית של צרורות או תאי סיבי עדשה בודדים מעומקים שונים בעדשה. סיבי העדשה המוכתמים מושווים לתכשירי SEM המשמשים זה מכבר לחקר המורפולוגיה של תאי סיבי העדשה. התוצאות מראות מבני קרום דומים בין שני התכשירים. EM נותר תקן הזהב לחקר מורפולוגיה של תאים, אך תיוג חיסוני מאתגר יותר בדגימות SEM עבור לוקליזציה של חלבונים33,34,35 ודורש מיקרוסקופ אלקטרונים כדי להיות דמות. יתרונה של שיטת אימונוסטיין זו הוא שניתן לתייג מספר מטרות בבת אחת, והתמונות נאספות במיקרוסקופ קונפוקלי.

בעוד השיטה משמרת את המורפולוגיה המורכבת של התא, SEM עדיין נדרש להשוות אינטרדיגיטציות בין סיבי עדשה בקרה ושינוי עקב מוטציה גנטית, הזדקנות, טיפולים תרופתיים וכו '. ההכנה החיסונית יוצרת תערובת של תאים מקליפת המוח או הגרעין של העדשה המפוזרים באופן אקראי על השקופית. לכן, אם המורפולוגיה של התאים משתנה, ייתכן שיהיה קשה יותר להבחין בעומק שבו התאים היו ממוקמים בעדשה לפני דיסוציאציה לצביעה. במקרים אלה, ייתכן שיהיה צורך לנתח את העדשה לאזורים מעניינים לאחר קיבוע והכתמת צרורות קטנים יותר של סיבי עדשה לדיוק מרחבי גבוה יותר. יש להשוות את תוצאות הצביעה גם לתמונות SEM כדי להבטיח שהסיבים החיסוניים ישמרו על המורפולוגיה של התאים שהשתנו.

זה הוכח לראשונה כי תאי סיבים גרעיניים יכולים להישמר גם עבור צביעה באמצעות שיטה חדשה זו. חשוב להסיר את קליפת העדשה לפני קיבוע הגרעין מכיוון שחדירה קיבועית אינה מגיעה לגרעין העדשה בעת קיבוע העדשה כולה27. השיטה של פרוטוקול זה לבידוד גרעין העדשה מתארת הסרה מכנית של סיבי עדשה קורטיקליים רכים יותר. זה אפשרי בעדשות מכרסמים בגלל גרעין העדשה הקשה והקומפקטי מאוד 28,30,36. במינים אחרים, גרעין העדשה רך יותר ועשוי לדרוש שיטות אחרות כדי לבודד תאים אלה לצורך צביעה. בעבר, נעשה שימוש בשיטת מערבולות כדי להסיר תאי סיבים קורטיקליים מקו עכבר נוקאאוט עם גרעין עדשה רך יותר שלא ניתן היה לבודד באופן אמין על ידי הסרה מכנית29.

אמנם לא הדגמנו צביעת נוגדנים ראשונית בנתונים מייצגים אלה, אך בעבר ביצענו את אותו סוג של צביעה עם נוגדנים ראשוניים ונוגדנים משניים מתאימים22,23. מניסיוננו, לרבים מחלבוני הממברנה יש אות ניקוב, ולכן מומלץ להשתמש ב-WGA או F-אקטין בסיבי קליפת המוח או WGA בסיבים גרעיניים כדי לתחום בבירור את קרום התא כדי למקם טוב יותר את חלבוני קרום התא ולזהות כל שלב של התמיינות התא והבשלתו. צביעת WGA או F-actin צריכה להיות בערוץ גלוי (אדום, ירוק או כחול) כדי לאפשר לצופה למצוא את התאים המתאימים להדמיה באמצעות העינית בקלות. סוג זה של צביעת קרום יכול גם לסייע בזיהוי כל נזק לתאים מתהליך הקיבוע, הצביעה וההרכבה כדי להוציא תאים שניזוקו מכנית. בעבודות אלה וקודמות22,23, תאים פגומים מכנית נצפים לעתים רחוקות.

שיטה זו דורשת בדיקה סבלנית ושיטתית של תאים לצורך הדמיה. תערובת אקראית של תאים יכול להיות די מרתיע במבט ראשון, אבל תאים כי הם שוכבים בכיוון אופטימלי בדרך כלל ניתן למצוא. שיטה זו יכולה להיות מותאמת לסיבי עדשה שבודדו ממינים אחרים. בעדשות גדולות יותר, ייתכן שניתן יהיה להשתמש בדיסקציה זהירה כדי להפריד בין שכבות התאים השונות לפני הצביעה החיסונית. לסיכום, מחקר זה יצר שיטה חזקה ואמינה לשימור צרורות של סיבים או תאי סיבים בודדים כדי לחקור את המורפולוגיה המורכבת שלהם ולמקם חלבונים בתלת-ממד בתאים מיוחדים אלה. פרוטוקול ייחודי זה לצביעת סיבים גרעיניים פותח תחום מחקר חדש לסיבים המרכזיים הפחות נחקרים של העדשה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענק R01 EY032056 (ל- CC) מהמכון הלאומי לעיניים. המחברים מודים לד"ר תרזה פאסל וקימברלי ונדרפול במתקן סקריפס למיקרוסקופיה על עזרתם בתמונות מיקרוסקופ אלקטרונים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100% Triton X-100 FisherScientific BP151-500
60mm plate FisherScientific FB0875713A
16% paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710
10X phosphate buffered saline ThermoFisher 70011-044
1X phosphate buffered saline ThermoFisher 14190136
48-well plate CytoOne CC7672-7548
Cover slips (22 x 40 mm) FisherScientific 12-553-467
Curved tweezers World Precision Instruments 501981
Dissection microscope Carl Zeiss Stereo Discovery V8
Fine tip straight tweezers Electron Microscopy Sciences 72707-01
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides FisherScientific 12-550-15
LSM 800 confocal microscope with Airyscan (63X) and Zen 3.5 Software Carl Zeiss
Nail polish
Normal donkey serum Jackson ImmunoResearch 017-000-121
Phalloidin (rhodamine) ThermoFisher R415
Primary antibody
Scalpel Feather Disposable, steril, No. 11 VWR 76241-186
Secondary antibody
Straight forceps World Precision Instruments 11252-40
Thermo Scientific Nunc MicroWell MiniTrays (dissection tray) FisherScientific 12-565-154
Ultra-fine scissors World Precision Instruments 501778
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1200
Wheat germ agglutinin (fluorescein) Vector Laboratories FL-1021-5

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lovicu, F. J., McAvoy, J. W. Growth factor regulation of lens development. Developmental Biology. 280 (1), 1-14 (2005).
  2. Kuszak, J., Alcala, J., Maisel, H. The surface morphology of embryonic and adult chick lens-fiber cells. The American Journal of Anatomy. 159 (4), 395-410 (1980).
  3. Kuszak, J. R. The ultrastructure of epithelial and fiber cells in the crystalline lens. International Review of Cytology. 163, 305-350 (1995).
  4. Kuszak, J. R., Macsai, M. S., Rae, J. L. Stereo scanning electron microscopy of the crystalline lens. Scanning Electron Microscopy. , 1415-1426 (1983).
  5. Lo, W. K., Harding, C. V. Square arrays and their role in ridge formation in human lens fibers. Journal of Ultrastructure Research. 86 (3), 228-245 (1984).
  6. Taylor, V. L., et al. Morphology of the normal human lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 37 (7), 1396-1410 (1996).
  7. Vrensen, G. F. Aging of the human eye lens-a morphological point of view. Comparative Biochemistry and Physiology. Part A, Physiology. 111 (4), 519-532 (1995).
  8. Vrensen, G. F., Duindam, H. J. Maturation of fiber membranes in the human eye lens. Ultrastructural and Raman microspectroscopic observations. Ophthalmic Research. 27, 78-85 (1995).
  9. Willekens, B., Vrensen, G. The three-dimensional organization of lens fibers in the rabbit. A scanning electron microscopic reinvestigation. Albrecht von Graefe's Archive for Clinical and Experimental Opthalmology. 216 (4), 275-289 (1981).
  10. Willekens, B., Vrensen, G. The three-dimensional organization of lens fibers in the rhesus monkey. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 219 (3), 112-120 (1982).
  11. Zhou, C. J., Lo, W. K. Association of clathrin, AP-2 adaptor and actin cytoskeleton with developing interlocking membrane domains of lens fibre cells. Experimental Eye Research. 77 (4), 423-432 (2003).
  12. Kuwabara, T. The maturation of the lens cell: a morphologic study. Experimental Eye Research. 20 (5), 427-443 (1975).
  13. Weeber, H. A., Eckert, G., Pechhold, W., vander Heijde, R. G. Stiffness gradient in the crystalline lens. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 245 (9), 1357-1366 (2007).
  14. Weeber, H. A., et al. Dynamic mechanical properties of human lenses. Experimental Eye Research. 80 (3), 425-434 (2005).
  15. Weeber, H. A., vander Heijde, R. G. On the relationship between lens stiffness and accommodative amplitude. Experimental Eye Research. 85 (5), 602-607 (2007).
  16. Heys, K. R., Cram, S. L., Truscott, R. J. Massive increase in the stiffness of the human lens nucleus with age: the basis for presbyopia. Molecular Vision. 10, 956-963 (2004).
  17. Heys, K. R., Friedrich, M. G., Truscott, R. J. Presbyopia and heat: changes associated with aging of the human lens suggest a functional role for the small heat shock protein, alpha-crystallin, in maintaining lens flexibility. Aging Cell. 6 (6), 807-815 (2007).
  18. Glasser, A., Campbell, M. C. Biometric, optical and physical changes in the isolated human crystalline lens with age in relation to presbyopia. Vision Research. 39 (11), 1991-2015 (1999).
  19. Pierscionek, B. K. Age-related response of human lenses to stretching forces. Experimental Eye Research. 60 (3), 325-332 (1995).
  20. Biswas, S. K., Lee, J. E., Brako, L., Jiang, J. X., Lo, W. K. Gap junctions are selectively associated with interlocking ball-and-sockets but not protrusions in the lens. Molecular Vision. 16, 2328-2341 (2010).
  21. Lo, W. K., et al. Aquaporin-0 targets interlocking domains to control the integrity and transparency of the eye lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (3), 1202-1212 (2014).
  22. Cheng, C., et al. Tropomyosin 3.5 protects the F-actin networks required for tissue biomechanical properties. Journal of Cell Science. 131 (23), (2018).
  23. Cheng, C., et al. Tropomodulin 1 regulation of actin is required for the formation of large paddle protrusions between mature lens fiber cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (10), 4084-4099 (2016).
  24. Kuszak, J. R. The development of lens sutures. Progress in Retinal and Eye Research. 14 (2), 567-591 (1995).
  25. Bassnett, S., Costello, M. J. The cause and consequence of fiber cell compaction in the vertebrate lens. Experimental Eye Research. 156, 50-57 (2017).
  26. Biswas, S., Son, A., Yu, Q., Zhou, R., Lo, W. K. Breakdown of interlocking domains may contribute to formation of membranous globules and lens opacity in ephrin-A5(-/-) mice. Experimental Eye Research. 145, 130-139 (2016).
  27. Blankenship, T., Bradshaw, L., Shibata, B., Fitzgerald, P. Structural specializations emerging late in mouse lens fiber cell differentiation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (7), 3269-3276 (2007).
  28. Cheng, C., et al. Age-related changes in eye lens biomechanics, morphology, refractive index and transparency. Aging. 11 (24), 12497-12531 (2019).
  29. Cheng, C., et al. EphA2 affects development of the eye lens nucleus and the gradient of refractive index. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 63 (1), 2 (2022).
  30. Cheng, C., Gokhin, D. S., Nowak, R. B., Fowler, V. M. Sequential application of glass coverslips to assess the compressive stiffness of the mouse lens: strain and morphometric analyses. Journal of Visualized Experiments. (111), e53986 (2016).
  31. Forrester, J. V., Dick, A. D., McMenamin, P. G., Roberts, F., Pearlman, E. Anatomy of the eye and orbit. The Eye (Fourth Edition). Saunders, W. B. , 1 (2016).
  32. Cheng, C., Nowak, R. B., Fowler, V. M. The lens actin filament cytoskeleton: Diverse structures for complex functions. Experimental Eye Research. 156, 58-71 (2017).
  33. Goldberg, M. W., Fiserova, J. Immunogold labeling for scanning electron microscopy. Methods in Molecular Biology. 1474, 309-325 (2016).
  34. Goldberg, M. W. High-resolution scanning electron microscopy and immuno-gold labeling of the nuclear lamina and nuclear pore complex. Methods in Molecular Biology. 1411, 441-459 (2016).
  35. Hermann, R., Walther, P., Muller, M. Immunogold labeling in scanning electron microscopy. Histochemistry and Cell Biology. 106 (1), 31-39 (1996).
  36. Gokhin, D. S., et al. Tmod1 and CP49 synergize to control the fiber cell geometry, transparency, and mechanical stiffness of the mouse lens. PLoS One. 7 (11), e48734 (2012).

Tags

הכנה צביעה אימונופלואורסצנטית צרורות תאי סיבים בודדים קליפת המוח גרעין עדשת עין איבר שקוף חדר קדמי רשתית תמונה ברורה תאי סיבים מיוחדים חתך משושה קוטב קדמי קוטב אחורי אינטרדיגיטציות מבנים שלובים תכונות ביומכניות טכניקות מיקרוסקופיית אלקטרונים שימור אימונוסטיין תאי סיבי עדשת עכבר לוקליזציה מפורטת של חלבונים תאים בעלי צורה מורכבת
הכנה וצביעה אימונופלואורסצנטית של צרורות ותאי סיבים בודדים מקליפת המוח וגרעין עדשת העין
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vu, M. P., Cheng, C. Preparation and … More

Vu, M. P., Cheng, C. Preparation and Immunofluorescence Staining of Bundles and Single Fiber Cells from the Cortex and Nucleus of the Eye Lens. J. Vis. Exp. (196), e65638, doi:10.3791/65638 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter