Summary
このプロトコルは複雑なセルにセルinterdigitationsおよび膜の構造を調査するためにimmunofluorescenceのために末梢、成熟した、および核目のレンズ繊維のセルを準備する方法を記述する。
Abstract
水晶体は、眼の前房にある透明な楕円形の器官で、形を変えて網膜に光を細かく集束させ、鮮明な画像を形成します。この組織の大部分は、六角形の断面を持ち、水晶体の前極から後極まで伸びる特殊な分化した線維細胞で構成されています。これらの細長い細胞は、隣接する細胞と緊密に対向しており、細胞の長さに沿って複雑な指間があります。特殊なインターロッキング構造は、レンズの通常の生体力学的特性に必要であり、電子顕微鏡技術を用いて広範囲に説明されています。このプロトコルはこれらの複雑に定形づけられたセル内の蛋白質の詳しいローカリゼーションを可能にするためにマウス レンズ繊維のセルの単一、また束を維持し、immunostainする最初の方法を示す。代表的なデータは、水晶体のすべての領域にわたる末梢細胞、分化細胞、成熟細胞、および核線維細胞の染色を示しています。この方法は、他の種のレンズから単離されたファイバーセルに使用できる可能性があります。
Introduction
水晶体は、眼の前房にある透明な卵形組織で、上皮細胞と線維細胞1の2種類の細胞で構成されています(図1)。水晶体の前半球を覆う上皮細胞の単層があります。線維細胞は上皮細胞から分化し、水晶体の大部分を占めています。高度に特殊化された線維細胞は、伸長、分化、および成熟プログラミングを受け、水晶体周辺部から水晶体中心までの細胞膜形態の明瞭な変化を特徴とする2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 は、水晶体核とも呼ばれます。さまざまな距離から網膜に来る光を細かく焦点を合わせるレンズの機能は、剛性や弾力性などの生体力学的特性に依存します13、14、15、16、17、18、19。レンズファイバーの複雑なインターディジテーションは仮説が立てられており20,21、最近ではレンズの剛性22,23に重要であることが示されています。
図1:レンズの解剖図と、レンズファイバーからの代表的な走査型電子顕微鏡(SEM)画像。この漫画は、上皮細胞の前部単層(水色で網掛け)と水晶体線維細胞のバルクマス(白)の縦方向(上から下への前方から後方)の図を示しています。水晶体の中心(ピンク色)は核と呼ばれ、高度に圧縮されたファイバーセルで構成されています。右の断面図は、ハニカム状に詰め込まれたレンズファイバーの細長い六角形のセル形状を示しています。ファイバーセルには、2つの広い辺と4つの短辺があります。下部の代表的なSEM画像は、レンズの異なる深さにあるレンズファイバーセル間の複雑な膜インターディジテーションを示しています。右から、レンズ周辺部に新たに形成されたレンズファイバーは、短辺に沿って小さな突起があり、幅広側に沿ってボールとソケットがあります(赤枠)。成熟の過程で、レンズ繊維は短辺に沿った小さな突起(青いボックス)によって装飾された大きなパドルドメインを発達させます。成熟したファイバーセルは、小さな突起で示される大きなパドルドメインを持っています。これらの連動ドメインは、レンズの生体力学的特性にとって重要です。水晶体核の線維細胞は、短辺に沿った小さな突起が少なく、複雑な舌状溝の指間(紫色のボックス)を持っています。細胞の広い側面は球状膜の形態を示します。漫画は22,32から変更され、縮尺に合わせて描かれませんでした。スケールバー = 3 μm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
水晶体は、前世代の繊維の上に新しい線維細胞の殻を重ねることによって成長する24,25。ファイバーセルは、2つの広い辺と4つの短辺を持つ細長い六角形の断面形状をしています。これらの細胞は水晶体の前極から後極まで伸びており、種によっては水晶体線維の長さが数ミリメートルになることがあります。これらの細長い細胞の構造をサポートするために、広辺と短辺に沿った特殊なインターディジテーションがインターロッキング構造を作成し、レンズの形状と生体力学的特性を維持します。線維細胞の分化および成熟中の細胞膜形状の変化は、電子顕微鏡(EM)研究によって広く記録されています2,3,4,5,6,7,8,9,10,20,26,27,28,29 .新しく形成されたファイバーセルは、その広い側面に沿ってボールとソケットを持ち、短辺に沿って非常に小さな突起を持っていますが、成熟したファイバーは短辺に沿って連動する突起とパドルを持っています。核線維は、舌状および溝状の歯状および球状膜形態を示す。これらの複雑なインターロッキングメンブレンに必要なタンパク質についてはほとんど知られていません。線維細胞におけるタンパク質の局在に関するこれまでの研究は、複雑な細胞構造を明確に可視化することができない水晶体組織切片に依存していました。
この研究は、複雑な形態を維持し、細胞膜および細胞質内のタンパク質の免疫染色を可能にするために、レンズ線維細胞の単一および束を固定する新しい方法を作成し、完成させました。この方法は、EM研究のデータに匹敵する細胞膜構造を忠実に保持し、特定のタンパク質の一次抗体で染色することができます。我々は以前、分化と成熟を経る皮質水晶体線維を免疫染色したことがある22,23。このプロトコルでは、水晶体核から繊維細胞を汚す新しい方法もあります。このプロトコルは繊維のセル成熟および水晶体の核の圧縮の間に膜のinterdigitationsの形成そして変更のためのメカニズムを理解することへの扉を開ける。
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Protocol
マウスは、インディアナ大学ブルーミントン校の動物管理・利用委員会が承認した動物プロトコルに基づいて飼育されています。代表的なデータを生成するために使用したマウスは、C57BL6/Jバックグラウンドの対照(野生型)動物、雌、および8〜12週齢でした。この実験には、マウスの性別が実験結果に影響を与える可能性が非常に低いため、雄と雌の両方のマウスを使用できます。
1. レンズの解剖とカプセル化解除
- 米国国立衛生研究所(NIH)の「実験動物の飼育と使用に関するガイド」および同研究所が承認した動物使用プロトコルに従ってマウスを安楽死させる。
注:本研究では、マウスはCO2 の過剰摂取によって安楽死させられ、その後、承認された動物プロトコル(インディアナ大学)に従って子宮頸部脱臼が続きました。 - 湾曲した鉗子を使用してマウスから眼球を摘出し、鉗子の片側で目の周りの組織を押し下げて眼窩から眼球を移動させます。次に、目の下の鉗子を閉じ、持ち上げて眼窩から眼球を取り除きます。解剖トレイ内の新鮮な1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に眼球を移します。
- 視神経を極細ハサミで眼球にできるだけ近づけて切ります。先端の細いまっすぐなピンセットを、眼球の後部にある視神経の出口から眼球に慎重に挿入します。
- ステップ1.3のピンセットと同じ場所にハサミを慎重に挿入し、後部から角膜と強膜の接合部に向かって切開を開始します。
注:げっ歯類のレンズは目の~30%を占めています。ピンセットやハサミが目の奥深くまで挿入されすぎると、偶発的な損傷が発生します。 - 角膜と強膜の接合部の少なくとも半分が分離するまで、角膜と強膜の接合部に沿って切断を続けます。
- ピンセットを使用して角膜をそっと押し、手順1.4と1.5で行った切開から水晶体が出るようにします。
- 先端の細いまっすぐなピンセットを使用して、レンズから大きな組織片を慎重に取り除きます。レンズを点検して、赤道領域を見つけます。
- 先端の細いまっすぐなピンセットを使用してレンズを浅く突き刺し、レンズカプセルを取り外します。水晶体線維細胞の塊は無傷のままであり、水晶体上皮単層は水晶体嚢に付着したままである。レンズカプセルを廃棄します。
2. レンズ単線維細胞染色
- レンズファイバー細胞の塊を、新たに調製した1%パラホルムアルデヒド(PFA;1x PBS)溶液500 μLのウェルプレートに移し、サンプルを4°Cで一晩、穏やかなナーションでインキュベートします(図2A)。
注:記載されている溶液の容量は、48 ウェルプレート用に最適化されています。別のサイズのウェルプレートまたはチューブを使用する場合は、それに応じて溶液の量を調整してください。固定、ブロッキング、洗浄(1x PTX、0.1% Triton X-100 in 1x PBS)溶液を、10 x PBS と二重蒸留水(ddH2O)で最終濃度が 1 x PBS になるまで作製しました。 - レンズファイバーセルを1%PFAを含む60mmディッシュに移します。鋭利なメスを使用して、繊維細胞のボールを前後軸に沿って半分に分割します(図2B)。同じ軸に沿って半分に再び半分に切り、四分の一を作ります。
注:前後軸は、組織塊内の線維細胞の方向によって容易に認識されます。 - まっすぐなピンセットを使用して、水晶体ファイバーセルの四分の一から核領域を取り除きます(図2C)。
注:げっ歯類の水晶体では水晶体核領域は硬く、水晶体の中心は柔らかい皮質線維から簡単に分離します。 - 水晶体皮質領域の四分の一を200 μLの1% PFAで、室温(RT)で15分間、穏やかに振とう(プレートシェーカーで300rpm)後固定します。
- 750 μL の 1x PBS で 5 分間、RT で穏やかに振とうしながら、組織クォーターを 2 回洗浄します。
- 200 μL のブロッキング溶液(5% 血清、0.3% Triton X-100、1x PBS)を使用して、穏やかに振とうしながら室温で 1 時間、サンプルをブロッキングします。
注:このプロトコルの代表的なデータでは、サンプルは一次抗体または二次抗体で染色されていません。ブロッキングステップの後、サンプルを小麦胚芽凝集素(WGA;1:100)およびファロイジン(1:100)(材料表参照)と室温で穏やかに振とうし、光から保護しながら3時間インキュベートしました。一次抗体染色は、以前の出版物22,23で実証されています。 - 100 μLの一次抗体溶液とともに、穏やかに振とうしながら4°Cで一晩インキュベートします。
注:抗体はブロッキング溶液で希釈されています。組織切片のあるスライドと比較して、このタイプの調製物にはより多くの細胞があります。一次抗体の濃度を上げて、より多くの細胞を染色するための十分な抗体を提供する必要があります。抗体濃度は、組織切片に使用する濃度の2倍にすることが推奨されます。二次抗体も同様です。 - 1x PTX(0.1% Triton X-100、1x PBS)で、室温でそれぞれ5分間、穏やかに振とうしながら組織クォーターを3回洗浄します。
- ファイバー細胞を100 μLの二次抗体/色素溶液と室温で穏やかに振とうしながら3時間インキュベートします。このステップとその後のステップでは、サンプルを光から保護してください。
注:WGA、ファロイジン、およびその他の蛍光色素を二次抗体溶液に添加して、一次抗体を標識しながら、細胞膜、細胞骨格、またはその他の細胞小器官を同時に標識することができます。 - ファイバーセルを 1x PTX で 5 分間、室温で穏やかに振とうしながら 4 回洗浄します。
- プラスチャージした顕微鏡スライドに1滴または50 μLの封入剤を加えてから、組織クォーターをスライドに移します。
- ピンセットを使用して繊維セルを互いに穏やかに分離し、セルバンドルの重なりを制限します。
- #1.5のカバーガラスを封入剤のサンプルの上にそっと貼り付けます。封入剤はカバーガラスの端まで広がる必要があります。これが発生しない場合は、カバーガラスの端に封入剤を追加します。カバーガラスの端の周りの余分な封入剤を吸引し、マニキュアを使用してスライド上のカバーガラスの端を密封します。
注:これらの実験には、共焦点顕微鏡用に調製されたあらゆる種類の封入剤を使用できます。
3. 水晶体核単線維細胞染色
- セクション 1 で概説した解剖を完了します。
- 水晶体線維細胞のボールから皮質線維を機械的に除去し、水晶体核を残し、線維細胞塊を湿った手袋をはめた指先にそっと移し、組織塊を静かに転がします。
注:マウスレンズでは、手袋をはめた指先の間で水晶体線維細胞のボールを転がすことは、硬水晶体核から皮質線維細胞を除去するための効果的な方法である28,30。この機械的方法が効果的でないレンズについては、慎重な解剖またはボルテックス法29を使用して皮質線維細胞を除去してもよい。 - 水晶体核をウェルプレートで作りたての1%PFA溶液に移し、穏やかに振とうしながら4°Cで一晩インキュベートします。
- サンプルを1%PFAを含む60mmディッシュに移し、鋭利なメスを使用して水晶体核を前後軸に沿って分割します。組織サンプルを再び半分にして、核四分の一を生成します。
- ステップ2.4-2.13で概説されているプロセスに従って、免疫染色とサンプルの埋め込みを行います。
図2:水晶体線維細胞の調製と免疫染色を詳述したグラフィカルな要約 。 (A)この 48 ウェルプレートは、記載されたメソッドのサンプルプレートのセットアップを示すためにカラムごとに色分けされており、鉗子を使用した穏やかな取り扱いにより、さまざまな免疫染色ステップ間でサンプルを簡単に移すことができます。このプロトコルの代表的なデータは一次抗体とインキュベートされていませんが、図には一次抗体インキュベーション用のカラムが含まれており、使用済みの洗浄バッファーを吸引して除去した後、洗浄用のウェルを再利用できます。(B)水晶体線維細胞塊を固定した後、細胞の元の構造を保存するために、組織を前後軸(赤い破線)に沿って分割します。組織塊が半分になると、サンプルを回転させ、前後軸に沿って半分を四分の一に分割します(赤い破線)。(C)水晶体核領域(ピンク色)の除去は、ピンセットを使用して皮質線維細胞(青色)から密集した中央組織を掘り出すと簡単にできます。漫画の図は、部分的に BioRender.com を使用して作成され、縮尺どおりに描画されていません。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
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Representative Results
水晶体線維細胞は、水晶体皮質(分化線維と成熟線維)と核から調製され、F-アクチンはファロイジン、細胞膜はWGAで染色されます。細胞の束または単一のレンズファイバーの混合物(図3)が観察され、画像化されます。水晶体皮質からは、2種類の細胞が見られます(図3A)。水晶体周辺の分化線維細胞はまっすぐで、短辺に沿って非常に小さな突起があります。細胞が分化するにつれて、繊維細胞は波状になり、小さな連動した突起が生じます。さらに、成熟プロセスに沿って、繊維細胞は小さなインターロッキング突起で飾られた大きなパドルを発達させます。マウスの水晶体では水晶体核は非常にコンパクトで剛性が高く、核水晶体線維の固定と染色の前に、柔らかい水晶体皮質を機械的に除去 することによって 単離されます。水晶体核からは、低倍率画像では容易に見ることのできない、直径が小さく、微細な膜構造を持つレンズ繊維の束が見つかります。
水晶体の異なる領域からの水晶体線維細胞の高倍率3D再構成(図3B)では、F-アクチンとWGAが分化および成熟した線維細胞の細胞膜で高度に共局在していることがわかりました。F-アクチンは、分化および成熟した線維の細胞膜に沿った連動する突起に富んでいます(図3B、矢印)。成熟したファイバーセルは、大きなインターロッキングパドルを発達させます(図3B、アスタリスク)。WGA染色は、特に成熟線維細胞において、F-アクチンシグナルと完全に共局在しておらず、皮質アクチンネットワークが細胞膜に沿ったすべての小さな構造を支えているわけではないことを示唆しています。意外なことに、F-アクチンネットワークは核線維細胞の細胞質内にあることがわかった。F-アクチンシグナルは核線維細胞膜に沿った突起(図3B、矢印)に伸びていますが、アクチンネットワークは細胞膜の近くや突起内では濃縮されなくなります。核線維細胞の形態は、突起の組織化および頻度の減少に加えて、パドルを欠いている。
Figure 3: レンズの異なる領域からのファイバーセルのバンドル(低倍率)および単一(高倍率)画像の共焦点画像。 細胞はWGA(細胞膜、緑)、ファロイジン(F-アクチン、赤)、およびDAPI(核、青)で染色されます。(A)これらの調製物では、水晶体線維細胞の束が異なる領域から見出されることが多い。皮質製剤には、分化および成熟した繊維細胞があります。これらの異なる細胞は異なる形態を持っているため、簡単に識別できます。水晶体核からのサンプルでは、線維細胞束と解離した線維が見られます。スケールバー = 50 μm。 (B)単一の分化、成熟、および核線維セルを通るZスタックを収集し、3Dレンダリングを使用して示されている画像を再構築します。分化繊維と成熟繊維には、短辺に沿って多くの小さな突起があります(矢印は選択されたものを示しています)。これらの小さな突起は、F-アクチンに富んでいます。成熟したファイバーには、大きなインターロッキング パドル ドメイン(アスタリスク)もあります。核線維には、WGAで染色された小さな膜ポケットとくぼみがあり、短辺に沿っていくつかの突起(矢印)を保持しています。驚くべきことに、F-アクチンネットワークは現在、細胞膜で濃縮されたシグナルを伴わずに細胞質に分布しています。F-アクチンネットワークは小さな突起にまで広がっています。スケールバー = 5 μm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
繊維細胞を調べるときは、どのタイプの細胞が観察されているかについて混乱を避けるために、細胞の向きに注意することが重要です。Z スタックがセルから収集され、3D 再構成を使用して、XY、XZ、および YZ 平面の直交する 2D 投影が調べられます。この調製物では細胞の配向がランダムであるため、スライドガラス上で完全に平らに横たわっていない細胞が存在する可能性があります(図4)。この代表的な画像のセルはすべて成熟したレンズファイバーですが、各セルはXY平面上で大きく異なる外観をしています。緑色で擬似着色されたセルは、パドルと突起が見える広い面を上にして配向し、ピンク色で擬似着色されたセルは、短辺を上にして横たわっています。これは、XY 平面に示されている 2 つのセルの垂直な方向を示すことで、XZ 平面でより簡単に視覚化できます。YZ平面を調べると、XY平面からピンク色に着色された成熟繊維のパドルがはっきりとわかります。
図4:F-アクチンのファロイジンで染色された単一の成熟水晶体ファイバー細胞のグループを通る3D共焦点zスタックの直交2D投影(XY、XZ、およびYZ平面)。 2 つのセルは、各平面で識別できるようにピンクまたは緑で擬似色付けされています。XY 平面では、ピンク色のセルは短辺を上に向けて横たわり、緑のセルは広い辺を上に向けて平らに置いています。XZ 平面では、ピンク色のセルが向きに傾いており、緑色のセルがスライドガラスに平行になっていることがわかります。YZ面では、ピンク色の細胞のパドルと突起が観察され、この細胞が成熟した繊維細胞であることが確認されています。スケールバー = 5 μm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
繊維の厚さは約2〜4μmであるため25,31、zスタックの収集を通じて、細胞質を介して細胞表面または平面を観察することができます(図5)。これは、カバーガラスとほぼ平行で、セルの広い側が上を向いているセルに最適です。この成熟ファイバ細胞の細胞表面は、WGA信号を観察することで理解することができます(図5A)。XZ 平面は、この XY 平面がセルの広い側に沿っていることを明確に示しています。膜に沿った小さなWGA+点は、粗い細胞表面の形態を示唆しています。低露出画像の短辺に沿った小さな突起は、F-アクチンシグナルが大幅に濃縮されていることを示しています。高曝露では、突起のF-アクチンシグナルが飽和し、細胞膜を横切って微細な網状のF-アクチンネットワークが観察されます(アスタリスク)。XY平面を成熟線維の細胞質を通して考えると(図5B)、WGA染色は主に細胞膜に沿って観察されます。細胞表面に見られるものと同様に、F-アクチンは短辺に沿った突起に富んでおり、より高い曝露で網状の細胞質F-アクチンネットワークが見える(アスタリスク)。これまでの研究で、細胞質22,23を通るXY面の膜タンパク質の染色が示されてきましたが、この方法では、広い側の細胞表面に沿ってタンパク質を局在化させることも可能です。
図5:WGA(緑)とファロイジン(F-アクチン、赤)で染色した単一の成熟繊維細胞を通る3D共焦点zスタックの直交2D投影(XYおよびXZ平面)。 (A)広側に沿った細胞表面からの突起は、細胞膜に沿ったWGAを示しており、WGAの点状は、膜が完全に滑らかではないことを示唆しています。F-アクチンは短辺に沿った突起に富んでおり、F-アクチン染色の高露光画像は、細胞膜に沿った網状網目(アスタリスク)を明らかにします。(B)同じ細胞の細胞質を通る別の平面は、細胞膜に沿ってWGAを示し、細胞をフレーミングします。F-アクチンは、細胞質(アスタリスク)を介して網状ネットワークを形成し、細胞膜に沿った突起に非常に豊富に含まれています。スケールバー = 5 μm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
次に、走査型EM(SEM)実験と染色実験によるレンズファイバーの画像を比較します。SEM実験は、前述したように29を行い、試料の中心から周辺に向かって順次画像を撮影する。まず、短辺に小さな突起(図6、矢印)があり、広面にボールとソケット(矢じり)があるレンズファイバーの鑑別を調べます。SEM画像(図6A)と同様に、分化繊維の束が短辺に沿って配向されている場合、ボールとソケットのインターディジテーションは、セルの広い側に沿って伸びる大きな突起と溝です(図6B、矢印)。ソケットは、XYおよびXZ直交する2D投影のセルを単一の微分レンズファイバーで見ると見つかります(図6C、矢印)。また、短辺に沿った小さなインターロッキング突起も、SEM像(矢印)と比較して、これらの染色レンズファイバーセルに忠実に保存されています。次に、成熟した線維細胞の形態を調べます(図7)。SEM画像と染色された細胞では、細胞の広い側に沿って小さなくぼみがあります(図7A、B、矢印)。おそらく、これらは、成熟の過程で収縮しているボールとソケットのインターディジテーションの残骸です。小さな連動する突起(矢印)で装飾された大きなパドル(アスタリスク)は、SEMの細胞と染色された成熟繊維の間で比較できます。SEM画像の細胞には、連動する突起が細胞膜にドッキングしている明らかな溝もあります(図7C、矢印)。これらの溝は、これらの染色細胞にも見られ、WGAシグナルによって満たされています(図7D、矢印)。溝は、細胞膜から外側に突出するのではなく、細胞質に向かって内側に突出している突起のように見えることがあり、多くの場合、Fアクチン染色シグナルがほとんどない溝にはWGA染色のみが表示されます。
図6:水晶体皮質から分化する線維細胞のSEMおよび共焦点顕微鏡画像。 共焦点顕微鏡用のファイバー細胞は、WGA(緑)とファロイジン(F-アクチン、赤)で染色されます。(A)分化レンズファイバーの束のSEMは、細胞の広い側に沿ってボールとソケットのインターディジテーション(矢印)を示し、セルの短辺に沿って小さな連動突起(矢印)を示します。(B)分化繊維の束の共焦点画像を短辺から画像化すると、細胞の広い辺に沿って大きなボールとソケットの指が交差していることがわかります(矢印)。(C)1本の微分レンズファイバーを通る直交する2次元投影(XY面とXZ面)は、広い面に沿ってボールとソケットのインターディジテーション(矢印)と短辺に沿って小さな連動突起(矢印)を示しています。スケールバー = 5 μm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図7:水晶体皮質由来の成熟線維細胞のSEMおよび共焦点顕微鏡画像。 共焦点顕微鏡用のファイバー細胞は、WGA(緑)とファロイジン(F-アクチン、赤)で染色されます。(A)SEM画像には、細胞の短辺に沿って小さな突起(矢印)で装飾されたパドル(アスタリスク)を備えた2本の成熟繊維が連動しています。セルの広い側面に沿って小さなくぼみ(矢印)もあります。これらはおそらく、ボールとソケットの突起の収縮した残骸です。スケールバー = 5 μm。 (B)1本の成熟したレンズファイバーを通る直交する2D投影(XYおよびXZ平面)には、セルの短辺に沿って大きなパドル(アスタリスク)と小さな突起(矢印)が連動しています。SEM画像のくぼみに似た小さなWGA+リング(矢印)が、セルの広い側面に沿って見られます。これらのWGA+構造にはF-アクチン染色がありません。F-アクチンは、主に細胞膜の小さな突起に富んでおり、細胞質内では弱い網状染色パターンを持っています。スケールバー = 5 μm。 (C)細胞膜(矢印)に多数の溝があり、隣接する細胞からの突起が静止して連動している成熟繊維のSEM画像。スケールバー = 2 μm。 (D)WGAで染色された溝(矢じり)を示す、分離したばかりの成熟した繊維のペア。溝はF-アクチン染色を濃縮しておらず、インターロッキング構造として外側に伸びているのではなく、サイトゾルに向かって内側に伸びている突起のように見えます。スケールバー = 5 μm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
最後に、染色された核レンズファイバーをSEM調製からの画像と比較します。核レンズ線維を固定して染色するこの新しい方法は、水晶体のさまざまな領域にわたって核レンズ線維の形態を忠実に保持します(図8)。核線維細胞は、その短辺(矢印)に沿ってまれで大きな連動突起を持っています。最も外側の核レンズ線維は、SEMと染色された細胞画像の両方に見られるように、粗い細胞膜の質感を持っています。細胞が核の中心に向かってさらに圧縮されると、細胞膜に沿って舌状の溝の歯状結節が現れ(アスタリスク)、最も内側の核線維は、SEM画像およびWGA染色で理解できる球状膜形態を有する。F-アクチンはもはや細胞膜で濃縮されていませんが、細胞質を満たし、突起に弱く伸びるネットワークを形成します。
図8:核レンズ繊維細胞のSEMおよび共焦点顕微鏡画像。 共焦点顕微鏡用のファイバー細胞は、WGA(緑)とファロイジン(F-アクチン、赤)で染色されます。(A)最外層から水晶体中心に向かって核線維をSEM画像化すると、細胞の短辺にまれで大きな突起が見られる(矢印)。これらの細胞では細胞膜が粗く、舌状の溝の指状(アスタリスク)と最も内側の細胞の球状膜の形態があります。(B)単核レンズ線維による共焦点zスタックの3D再構成は、短辺に沿った突起(矢印)、舌状溝のインターディジテーション(アスタリスク)、WGA染色で明らかな粗い膜形態など、SEM画像に匹敵する特徴を持っています。F-アクチンは、細胞質を埋め尽くし、突起に弱く伸びるネットワークを形成します。スケールバー = 5 μm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルは忠実に水晶体のさまざまな深さからの束か単一のレンズ繊維の細胞の3D膜の形態を維持する固定、保存およびimmunostaining方法を実証した。染色されたレンズファイバーは、レンズファイバー細胞の形態を研究するために長い間使用されてきたSEM調製物と比較されます。結果は、両方の調製物間で同等の膜構造を示しています。EMは依然として細胞形態を研究するためのゴールドスタンダードですが、タンパク質33、34、35を局在化するためのSEMサンプルでの免疫標識はより困難であり、イメージングには電子顕微鏡が必要です。この免疫染色法の利点は、一度に複数のターゲットを標識でき、共焦点顕微鏡で画像を収集できることです。
この方法では複雑な細胞形態が維持されますが、遺伝子変異、老化、薬物治療などにより、対照レンズ線維と変化したレンズ線維のインターディジテーションを比較するためにSEMが必要です。免疫染色調製物は、水晶体皮質または核からスライド上にランダムに分布する細胞の混合物を作成します。したがって、細胞の形態が変化した場合、染色のために解離する前に細胞が水晶体内に位置していた深さを識別することがより困難になる可能性があります。このような場合、より高い空間精度を得るために、レンズを固定および染色した後、レンズをさらに関心領域に解剖する必要がある場合があります。また、染色結果をSEM画像と比較して、免疫染色したファイバーが改変された細胞の形態を保持していることを確認する必要があります。
この新しく作られた方法を用いて、核線維細胞も染色のために保存できることが初めて示されました。レンズ全体を固定する場合、固定液の貫通は水晶体核に到達しないため、核の固定前に水晶体皮質を除去することが重要である27。水晶体核を単離するこのプロトコルの方法は、より柔らかい皮質レンズ線維の機械的除去を記述する。これは、非常に硬くてコンパクトな水晶体核28,30,36のためにげっ歯類のレンズで可能です。他の種では、水晶体核はより柔らかく、染色のためにそれらの細胞を単離するために他の方法が必要になる場合があります。以前は、ボルテックス法を用いて、機械的除去では確実に単離できない軟らかい水晶体核を有するノックアウトマウス系統から皮質線維細胞を除去していた29。
これらの代表的なデータでは一次抗体染色は実証されていませんが、以前に一次抗体と適切な二次抗体で同様の染色を実施しました22,23。私たちの経験では、膜タンパク質の多くは点状シグナルを持っているため、細胞膜タンパク質をよりよく局在化し、細胞分化と成熟の各段階を認識するために、細胞膜を明確に描写するために、皮質線維のWGAまたはF-アクチンまたは核線維のWGAの使用が推奨されます。WGAまたはF-アクチン染色は、観察者が接眼レンズを使用してイメージングに適した細胞を簡単に見つけられるように、可視チャネル(赤、緑、または青)に配置する必要があります。このタイプの膜染色は、固定、染色、および固定プロセスによる細胞の損傷を特定し、機械的に損傷した細胞を排除するのにも役立ちます。この研究と以前の研究22,23では、機械的に損傷した細胞はめったに観察されません。
この方法では、イメージングのために細胞を忍耐強く体系的に検査する必要があります。細胞のランダムな混合は一見すると非常に困難になる可能性がありますが、通常、最適な方向にある細胞を見つけることができます。この方法は、他の種から単離されたレンズファイバーに適用できる可能性があります。大きなレンズでは、免疫染色する前に、慎重に解剖して細胞の異なる層を分離できる場合があります。要約すると、この研究は、繊維の束または単繊維細胞を保存してそれらの複雑な形態を研究し、これらの特殊な細胞でタンパク質を3Dで局在化するための堅牢で信頼性の高い方法を作成しました。核線維染色のためのこのユニークなプロトコルは、あまり研究されていないレンズの中心線維に新たな研究分野を開きます。
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Disclosures
著者は何も開示していません。
Acknowledgments
この研究は、米国国立眼科研究所の助成金R01 EY032056(CCへ)の支援を受けました。著者らは、電子顕微鏡画像の支援をしてくれたScripps Research Core Microscopy FacilityのTheresa Fassel博士とKimberly Vanderpool博士に感謝しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% Triton X-100 | FisherScientific | BP151-500 | |
| 60mm plate | FisherScientific | FB0875713A | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 10X phosphate buffered saline | ThermoFisher | 70011-044 | |
| 1X phosphate buffered saline | ThermoFisher | 14190136 | |
| 48-well plate | CytoOne | CC7672-7548 | |
| Cover slips (22 x 40 mm) | FisherScientific | 12-553-467 | |
| Curved tweezers | World Precision Instruments | 501981 | |
| Dissection microscope | Carl Zeiss | Stereo Discovery V8 | |
| Fine tip straight tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72707-01 | |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | FisherScientific | 12-550-15 | |
| LSM 800 confocal microscope with Airyscan (63X) and Zen 3.5 Software | Carl Zeiss | ||
| Nail polish | |||
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Phalloidin (rhodamine) | ThermoFisher | R415 | |
| Primary antibody | |||
| Scalpel Feather Disposable, steril, No. 11 | VWR | 76241-186 | |
| Secondary antibody | |||
| Straight forceps | World Precision Instruments | 11252-40 | |
| Thermo Scientific Nunc MicroWell MiniTrays (dissection tray) | FisherScientific | 12-565-154 | |
| Ultra-fine scissors | World Precision Instruments | 501778 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Wheat germ agglutinin (fluorescein) | Vector Laboratories | FL-1021-5 |
References
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