Summary
Este protocolo descreve métodos para preparar células de fibras periféricas, maduras e nucleares do cristalino ocular para coloração por imunofluorescência para estudar interdigitações complexas célula-célula e a arquitetura da membrana.
Abstract
O cristalino é um órgão transparente e elipsoide na câmara anterior do olho que muda de forma para focalizar finamente a luz na retina para formar uma imagem clara. A maior parte desse tecido é composta por células fibrosas especializadas e diferenciadas que possuem secção transversal hexagonal e se estendem dos polos anterior para posterior do cristalino. Essas células longas e magras são fortemente opostas às células vizinhas e têm interdigitações complexas ao longo do comprimento da célula. As estruturas intertravadas especializadas são necessárias para as propriedades biomecânicas normais do cristalino e têm sido extensivamente descritas usando técnicas de microscopia eletrônica. Este protocolo demonstra o primeiro método para preservar e imunomanchar singular, bem como feixes de células de fibra de lente de camundongo para permitir a localização detalhada de proteínas dentro dessas células de forma complexa. Os dados representativos mostram a coloração das células periféricas, diferenciadoras, maduras e de fibras nucleares em todas as regiões do cristalino. Este método pode ser potencialmente utilizado em células de fibras isoladas de lentes de outras espécies.
Introduction
O cristalino é um tecido límpido e ovoide, na câmara anterior do olho, composto por dois tipos celulares, células epiteliais efibras1 (Figura 1). Existe uma monocamada de células epiteliais que recobre o hemisfério anterior do cristalino. As células fibrosas são diferenciadas das células epiteliais e compõem a maior parte do cristalino. As células fibrosas altamente especializadas sofrem uma programação de alongamento, diferenciação e maturação, marcada por distintas mudanças na morfologia da membrana celular da periferia do cristalino para o centro do cristalino2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 , também conhecido como núcleo do cristalino. A função do cristalino de focalizar a luz vinda de várias distâncias para a retina depende de suas propriedades biomecânicas, incluindo rigidez e elasticidade 13,14,15,16,17,18,19. As complexas interdigitações das fibras do cristalino foram hipotetizadas 20,21 e recentemente mostraram-se importantes para a rigidez do cristalino 22,23.
Figura 1: Diagramas de anatomia do cristalino e imagens representativas de microscopia eletrônica de varredura (MEV) das fibras do cristalino. O desenho mostra uma visão longitudinal (anterior a posterior de cima para baixo) da monocamada anterior de células epiteliais (sombreada em azul claro) e uma massa volumosa de células de fibra do cristalino (branco). O centro da lente (sombreado em rosa) é conhecido como núcleo e compreende células de fibra altamente compactadas. À direita, um desenho animado de seção transversal revela a forma de célula hexagonal alongada das fibras da lente que são embaladas em um padrão de favo de mel. As células de fibra têm dois lados largos e quatro lados curtos. Imagens SEM representativas ao longo da parte inferior mostram as interdigitações complexas da membrana entre as células de fibra da lente em diferentes profundidades da lente. A partir da direita, as fibras de lente recém-formadas na periferia da lente têm pequenas saliências ao longo dos lados curtos e bolas e soquetes ao longo do lado largo (caixas vermelhas). Durante a maturação, as fibras do cristalino desenvolvem grandes domínios de remo que são decorados por pequenas saliências ao longo dos lados curtos (caixas azuis). As células de fibras maduras possuem grandes domínios de pás ilustrados por pequenas saliências. Esses domínios de intertravamento são importantes para as propriedades biomecânicas das lentes. As células de fibra no núcleo do cristalino têm menos pequenas saliências ao longo de seus lados curtos e têm interdigitações complexas de língua e sulco (caixas roxas). Os lados largos da célula exibem uma morfologia de membrana globular. O desenho foi modificado de22,32 e não desenhado em escala. Barra de escala = 3 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A lente cresce pela adição de conchas de novas células de fibra sobrepostas às gerações anteriores de fibras24,25. As células de fibra têm uma forma de seção transversal hexagonal alongada com dois lados largos e quatro lados curtos. Essas células se estendem do polo anterior ao posterior do cristalino e, dependendo da espécie, as fibras do cristalino podem ter vários milímetros de comprimento. Para suportar a estrutura dessas células alongadas e magras, interdigitações especializadas ao longo dos lados largos e curtos criam estruturas interligadas para manter a forma da lente e as propriedades biomecânicas. Alterações na forma da membrana celular durante a diferenciação e maturação das células fibrosas têm sido extensivamente documentadas por estudos de microscopia eletrônica (ME)2,3,4,5,6,7,8,9,10,20,26,27,28,29 . As células de fibra recém-formadas têm bolas e soquetes ao longo de seus lados largos com saliências muito pequenas ao longo de seus lados curtos, enquanto as fibras maduras têm saliências e pás interligadas ao longo de seus lados curtos. As fibras nucleares exibem interdigitações de língua e sulco e morfologia da membrana globular. Pouco se sabe sobre as proteínas necessárias para essas complexas membranas interligadas. Estudos prévios sobre a localização de proteínas em células fibrosas basearam-se em cortes de tecido do cristalino, que não permitem uma visualização clara da arquitetura celular complexa.
Este trabalho criou e aperfeiçoou um novo método para fixar células de fibras simples e em feixes de lentes para preservar a morfologia complexa e permitir a imunomarcação de proteínas na membrana celular e dentro do citoplasma. Este método preserva fielmente a arquitetura da membrana celular, comparável aos dados de estudos de EM, e permite a coloração com anticorpos primários para proteínas específicas. Temos previamente imunomarcadas fibras corticais do cristalino em fase de diferenciação ematuração22,23. Neste protocolo, há também um novo método para corar células de fibra do núcleo do cristalino. Este protocolo abre as portas para a compreensão dos mecanismos de formação e mudanças nas interdigitações da membrana durante a maturação das células fibrosas e compactação do núcleo do cristalino.
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Protocol
Os camundongos foram cuidados com base em um protocolo animal aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Indiana University Bloomington. Os camundongos utilizados para gerar dados representativos foram animais controle (selvagem) no fundo C57BL6/J, fêmeas e com 8-12 semanas de idade. Camundongos machos e fêmeas podem ser usados para este experimento, já que é muito improvável que o sexo dos camundongos afete o resultado do experimento.
1. Dissecção e descapsulação do cristalino
- Eutanasiar camundongos seguindo o "Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório" do National Institutes of Health, bem como protocolos de uso de animais aprovados pela instituição.
NOTA: Para o presente estudo, os ratos foram eutanasiados por overdose de CO2 seguida de deslocamento cervical de acordo com um protocolo animal aprovado (Universidade de Indiana). - Enuclear os olhos dos ratos usando pinças curvas, deprimindo o tecido ao redor dos olhos com um lado da pinça para deslocar o olho para fora da cavidade. Em seguida, feche a pinça embaixo do olho e levante para remover o olho do encaixe. Transfira os olhos para solução salina tamponada com fosfato (PBS) fresca em uma bandeja de dissecção.
- Corte o nervo óptico com uma tesoura ultrafina o mais próximo possível do globo ocular. Insira cuidadosamente pinças retas de ponta fina no globo ocular através da saída do nervo óptico na parte posterior do olho.
- Introduza cuidadosamente a tesoura no mesmo local que a pinça no passo 1.3 e comece a cortar uma incisão posterior em direção à junção córnea-escleral.
NOTA: As lentes de roedores ocupam ~30% dos olhos. Danos acidentais ocorrerão se a pinça ou tesoura for inserida muito profundamente no olho. - Continue cortando ao longo da junção córnea-escleral até que pelo menos metade da junção tenha sido separada.
- Use uma pinça para empurrar suavemente a córnea para que a lente possa sair pela incisão feita com os passos 1.4 e 1.5.
- Remova cuidadosamente qualquer pedaço grande de tecido da lente usando pinças retas de ponta fina. Inspecione a lente para encontrar a região equatorial.
- Perfure superficialmente a lente usando pinças retas de ponta fina e, em seguida, remova a cápsula da lente. A massa de células de fibra do cristalino permanecerá intacta, e a monocamada epitelial do cristalino permanecerá presa à cápsula do cristalino. Descarte a cápsula da lente.
2. Coloração da célula de fibra única da lente
- Transferir a massa celular de fibra do cristalino para uma placa de poço com 500 μL de solução de paraformaldeído a 1% (PFA; em 1x PBS) recém-fabricada e incubar as amostras a 4 °C durante a noite com nutação suave (Figura 2A).
NOTA: Os volumes para as soluções fornecidas são otimizados para placas de 48 poços. Se forem utilizados tubos ou placas de poço de outro tamanho, ajuste os volumes das soluções em conformidade. As soluções de fixação, bloqueio e lavagem (1x PTX, 0,1% Triton X-100 em 1x PBS) foram feitas com 10x PBS e água bidestilada (ddH2O) até uma concentração final de 1x PBS. - Transfira as células de fibra da lente para uma placa de 60 mm com PFA a 1%. Utilizar bisturi afiado para dividir a bola de células fibrosas ao meio ao longo de seu eixo anteroposterior (Figura 2B). Corte as metades ao meio novamente ao longo do mesmo eixo para produzir quartos.
NOTA: O eixo anteroposterior é facilmente reconhecido pela direção das células fibrosas na massa tecidual. - Use uma pinça reta para remover a região do núcleo dos quartos das células de fibra do cristalino (Figura 2C).
NOTA: A região do núcleo da lente é rígida nas lentes de roedores, e o centro da lente se separará das fibras corticais mais macias facilmente. - Pós-fixar os quartos da região do córtex do cristalino em 200 μL de PFA a 1% por 15 min à temperatura ambiente (TR) com agitação suave (300 rpm em um agitador de placa).
- Lave os quartos de tecido duas vezes em 750 μL de 1x PBS por 5 min cada com agitação suave em RT.
- Bloquear as amostras usando 200 μL de solução de bloqueio (5% de soro, 0,3% Triton X-100, 1x PBS) por 1 h no TR com agitação suave.
NOTA: Para os dados representativos neste protocolo, as amostras não foram coradas com anticorpos primários ou secundários. Após a etapa de blocagem, as amostras foram incubadas com aglutinina de gérmen de trigo (WGA; 1:100) e faloidina (1:100) (ver Tabela de Materiais) por 3 h em TR com agitação suave e proteção contra a luz. A coloração primária de anticorpos foi demonstrada em publicações anteriores22,23. - Incubar com 100 μL de solução de anticorpos primários durante a noite a 4 °C com agitação suave.
NOTA: Os anticorpos são diluídos em solução de bloqueio. Em comparação com lâminas com cortes de tecido, há mais células neste tipo de preparação. As concentrações primárias de anticorpos devem ser aumentadas para fornecer amplos anticorpos para corar mais células. Recomenda-se dobrar a concentração de anticorpos em relação ao que é usado em cortes de tecido. O mesmo se aplica aos anticorpos secundários. - Lave os quartos de tecido três vezes com 1x PTX (0,1% Triton X-100, 1x PBS) por 5 min cada em RT com agitação suave.
- Incubar as células de fibra com 100 μL de solução secundária de anticorpo/corante durante 3 h em RT com agitação suave. Proteger as amostras da luz durante esta e as etapas subsequentes.
NOTA: WGA, faloidina e outros corantes fluorescentes podem ser adicionados à solução de anticorpos secundários para marcação simultânea da membrana celular, citoesqueleto ou outras organelas, ao mesmo tempo em que marcam o anticorpo primário. - Lave as células de fibra quatro vezes com 1x PTX por 5 min cada em RT com agitação suave.
- Adicione uma gota ou 50 μL de mídia de montagem em uma lâmina de microscópio com carga adicional antes de transferir os quartos de tecido para a lâmina.
- Use pinças para separar suavemente as células de fibra umas das outras e tente limitar a sobreposição dos feixes celulares.
- Aplique suavemente uma tampa #1.5 sobre a amostra na mídia de montagem. O meio de montagem deve se espalhar até a borda da tampa; Se isso não ocorrer, adicione alguns suportes de montagem adicionais à borda da tampa. Aspirar qualquer excesso de mídia de montagem ao redor da borda da lamínula e use esmalte para selar as bordas da lamínula na corrediça.
NOTA: Qualquer tipo de meio de montagem formulado para microscopia confocal pode ser usado para esses experimentos.
3. Coloração da célula de fibra única do núcleo do cristalino
- Complete a dissecação descrita na seção 1.
- Remova mecanicamente as fibras corticais da bola das células de fibra do cristalino, deixando o núcleo do cristalino, transferindo suavemente a massa celular de fibra para as pontas dos dedos molhadas e enluvadas e rolando suavemente a massa de tecido.
NOTA: Em lentes de camundongo, rolar a bola de células de fibra do cristalino entre as pontas dos dedos enluvados é um método eficaz para a remoção das células de fibras corticais do núcleo duro do cristalino28,30. Para lentes onde este método mecânico não é eficaz, dissecção cuidadosa ou um método de vórtice29 pode ser usado para remover as células de fibra cortical. - Transfira o núcleo da lente para uma solução de PFA a 1% recém-fabricada em uma placa de poço e incube durante a noite a 4 °C com agitação suave.
- Transfira a amostra para uma placa de 60 mm com PFA a 1% e use um bisturi afiado para dividir o núcleo do cristalino ao longo do eixo anteroposterior. Reduza as amostras de tecido pela metade novamente para produzir quartos de núcleo.
- Siga o processo descrito nas etapas 2.4-2.13 para imunomarcação e montagem da amostra.
Figura 2: Resumo gráfico detalhando a preparação e imunomarcação das células de fibras do cristalino . (A) Esta placa de 48 poços foi codificada por cor por coluna para demonstrar uma configuração da placa de amostra para os métodos descritos, permitindo a fácil transferência de amostras entre as várias etapas de imunomarcação por manuseio suave usando pinças. Embora os dados representativos para este protocolo não sejam incubados com um anticorpo primário, o diagrama inclui uma coluna para incubação de anticorpos primários, e os poços para lavagem podem ser reutilizados após a remoção dos tampões de lavagem usados por aspiração. (B) Após a fixação da massa celular fibrosa do cristalino, o tecido é dividido ao longo do eixo anteroposterior (linhas tracejadas vermelhas) para preservar a estrutura original das células. Uma vez que a massa de tecido tenha sido reduzida pela metade, as amostras são giradas e as metades divididas em quartos ao longo do eixo anteroposterior (linhas tracejadas vermelhas). (C) A remoção da região do núcleo do cristalino (em rosa) é feita facilmente usando uma pinça para extrair o tecido central denso das células de fibras corticais (em azul). Diagramas de desenhos animados foram parcialmente criados usando BioRender.com e não desenhados em escala. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Representative Results
As células de fibras do cristalino são preparadas a partir do córtex do cristalino (fibras diferenciadoras e fibras maduras) e do núcleo, e as células são coradas com faloidina para F-actina e WGA para a membrana celular. Uma mistura de feixes de células ou fibras de lente única (Figura 3) são observadas e imageadas. A partir do córtex do cristalino, encontram-se dois tipos de células (Figura 3A). As células de fibra diferenciadoras na periferia do cristalino são retas, com saliências muito pequenas ao longo de seus lados curtos. À medida que a célula se diferencia, as células de fibra tornam-se onduladas com pequenas saliências interligadas. Além disso, ao longo do processo de maturação, as células de fibra desenvolvem grandes pás decoradas com pequenas saliências interligadas. O núcleo do cristalino é altamente compacto e rígido em lentes de camundongo, e é isolado através da remoção mecânica do córtex do cristalino mais macio antes da fixação e coloração das fibras nucleares do cristalino. A partir do núcleo do cristalino, são encontrados feixes de fibras do cristalino que são menores em diâmetro e têm estruturas de membrana finas que não podem ser facilmente vistas em uma imagem de baixa magnificação.
Em reconstruções 3D de células de fibras do cristalino de diferentes regiões do cristalino (Figura 3B), verifica-se que a actina F e o WGA são altamente colocalizados na membrana celular em células de fibras maduras e diferenciadoras. A F-actina é enriquecida nas saliências interligadas ao longo da membrana celular em fibras diferenciadoras e maduras (Figura 3B, cabeças de setas). As células de fibras maduras desenvolvem grandes pás interligadas (Figura 3B, asteriscos). A coloração WGA não é completamente colocalizada com o sinal de F-actina, especialmente na célula de fibra madura, sugerindo que a rede de actina cortical não suporta todas as estruturas menores ao longo da membrana celular. Inesperadamente, verifica-se que a rede F-actina está dentro do citoplasma das células de fibras nucleares. Enquanto o sinal da F-actina se estende para as saliências (Figura 3B, setas) ao longo da membrana celular da fibra nuclear, a rede de actina não é mais enriquecida perto da membrana celular ou dentro das protrusões. A morfologia da célula de fibra nuclear carece de pás, além de diminuição da organização e frequência das protrusões.
Figura 3: Imagens confocais de feixes (baixa magnificação) e imagens únicas (altas) de células de fibras de diferentes regiões do cristalino. As células são coradas com WGA (membranas celulares, verde), faloidina (F-actina, vermelho) e DAPI (núcleos, azul). (A) Nessas preparações, feixes de células de fibras do cristalino são frequentemente encontrados de diferentes regiões. Nas preparações corticais, há células de fibras diferenciadoras e maduras. Essas diferentes células possuem morfologias distintas, permitindo fácil identificação. Nas amostras do núcleo do cristalino, encontram-se feixes de fibras celulares e fibras dissociadas. Barra de escala = 50 μm. (B) Pilhas Z através de células de fibra única, maduras e nucleares são coletadas, e a renderização 3D é usada para reconstruir as imagens mostradas. As fibras diferenciadoras e maduras têm muitas pequenas saliências ao longo de seus lados curtos (as pontas de seta marcam as selecionadas). Estas pequenas saliências são enriquecidas para F-actina. A fibra madura também tem grandes domínios de remo interligados (asteriscos). As fibras nucleares possuem pequenas bolsas de membrana e divots coradas por WGA e retêm algumas saliências ao longo de seus lados curtos (setas). Surpreendentemente, a rede F-actina está agora distribuída no citoplasma celular sem sinais enriquecidos na membrana celular. A rede F-actina se estende em pequenas saliências. Barra de escala = 5 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Quando as células de fibra são examinadas, é importante observar a orientação das células para evitar confusão sobre qual tipo de célula está sendo observada. Pilhas Z são coletadas através das células e, em seguida, a reconstrução 3D é usada para observar as projeções ortogonais 2D nos planos XY, XZ e YZ. Devido à orientação aleatória das células nessa preparação, é possível ter células que não estão perfeitamente planas sobre a lâmina de vidro (Figura 4). Todas as células nesta imagem representativa são fibras de lente maduras, mas cada célula tem uma aparência drasticamente diferente no plano XY. A célula pseudo-colorida em verde é orientada de lado largo para cima com pás e saliências visíveis, enquanto a célula pseudo-colorida em rosa está deitada com o lado curto para cima. Isso é mais facilmente visualizado no plano XZ, mostrando as orientações perpendiculares das duas células mostradas no plano XY. O exame do plano YZ mostra claramente as pás da fibra madura que é cor-de-rosa do plano XY.
Figura 4: Projeções 2D ortogonais (planos XY, XZ e YZ) de pilhas z confocais 3D através de um grupo de células de fibra de lente maduras únicas coradas com faloidina para F-actina. Duas células são pseudocoloridas em rosa ou verde para identificação em cada plano. No plano XY, a célula rosa está deitada com seu lado curto voltado para cima, enquanto a célula verde está deitada plana com seu lado largo voltado para cima. No plano XZ, observa-se que a célula rosa é inclinada na orientação, enquanto a célula verde é paralela à lâmina de vidro. No plano ZH, observam-se as pás e saliências das células róseas, confirmando que esta célula é uma célula de fibra madura. Barra de escala = 5 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Como as fibras têm cerca de 2-4 μm de espessura25,31, é possível através da coleta de pilhas z visualizar a superfície celular ou um plano através do citoplasma (Figura 5). Isso funciona melhor em células que são quase paralelas com a lamínula, com o lado largo da célula voltado para cima. A superfície celular dessa célula fibrosa madura pode ser apreciada observando-se o sinal WGA (Figura 5A). O plano XZ mostra claramente que este plano XY está ao longo do lado largo da célula. Pequenos pontos WGA+ ao longo da membrana sugerem uma morfologia rugosa da superfície celular. As pequenas saliências ao longo do lado curto em imagens de baixa exposição mostram um sinal de F-actina muito enriquecido. Em maior exposição, onde o sinal de F-actina nas protrusões está saturado, uma fina rede reticulada de F-actina é observada através da membrana celular (asteriscos). Quando um plano XY é considerado através do citoplasma da fibra madura (Figura 5B), a coloração WGA é observada principalmente ao longo da membrana celular. Semelhante ao que é visto na superfície celular, a F-actina é enriquecida nas protrusões ao longo dos lados curtos, com uma rede citoplasmática reticulada de F-actina visível em maior exposição (asteriscos). Nosso trabalho anterior mostrou a coloração para proteínas de membrana em planos XY através do citoplasmacelular22,23, mas com este método, também é possível localizar proteínas ao longo da ampla superfície celular lateral.
Figura 5: Projeções ortogonais 2D (planos XY e XZ) de z-pilhas confocais 3D através de uma única célula de fibra madura corada com WGA (verde) e faloidina (F-actina, vermelho). (A) Projeções da superfície celular ao longo do lado largo mostram WGA ao longo da membrana celular, e os pontos de WGA sugerem que a membrana não é completamente lisa. A F-actina é enriquecida nas saliências ao longo dos lados curtos, e uma imagem de alta exposição da coloração com F-actina revela uma rede reticulada ao longo da membrana celular (asteriscos). (B) Outro plano através do citoplasma da mesma célula mostra WGA ao longo da membrana celular, enquadrando a célula. A F-actina forma uma rede reticulada através do citoplasma (asteriscos) e é grandemente enriquecida nas protrusões ao longo da membrana celular. Barras de escala = 5 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Em seguida, são comparadas imagens das fibras da lente dos experimentos de varredura em MEV (MEV) e coloração. Experimentos de MEV são realizados como descrito anteriormente29, e as imagens são obtidas sequencialmente do centro da amostra para a periferia. Primeiro, examinam-se as fibras diferenciadoras do cristalino com pequenas saliências (Figura 6, setas) ao longo de seus lados curtos e uma esfera (pontas de seta) ao longo de seus lados largos. Semelhante à imagem de MEV (Figura 6A), em um feixe de fibras diferenciadoras orientadas ao longo de suas laterais curtas, as interdigitações de esfera e cálice são grandes saliências e sulcos que se estendem ao longo do lado largo das células (Figura 6B, pontas de setas). Um soquete é encontrado (Figura 6C, pontas de seta) quando a célula nas projeções 2D ortogonais XY e XZ é visualizada em fibras de lente diferenciadoras únicas. Pequenas saliências interligadas ao longo dos lados curtos também são fielmente preservadas nessas células de fibra do cristalino coradas em comparação com aquelas na imagem de MEV (setas). Em seguida, investiga-se a morfologia das células fibrosas maduras (Figura 7). Na imagem de MEV e na célula corada, há pequenas divots ao longo do lado largo das células (Figura 7A,B, pontas de setas). Presumivelmente, esses são os restos das interdigitações de bola e soquete que estão encolhendo durante o processo de maturação. As grandes pás (asteriscos) decoradas por pequenas saliências interligadas (setas) são comparáveis entre as células em MEV e a fibra madura corada. As células na imagem de MEV também têm sulcos óbvios onde uma protrusão interligada está se encaixando na membrana celular (Figura 7C, cabeças de setas). Esses sulcos também podem ser vistos nessas células coradas e são preenchidos pelo sinal WGA (Figura 7D, pontas de setas). Os sulcos podem parecer protuberâncias indo para dentro em direção ao citoplasma da célula em vez de se projetarem para fora da membrana celular, e muitas vezes apenas a coloração WGA é visível nos sulcos que têm muito pouco, se algum, sinal de coloração de F-actina.
Figura 6: MEV e imagens de microscopia confocal diferenciando células de fibras do córtex do cristalino. As células fibrosas para microscopia confocal são coradas com WGA (verde) e faloidina (F-actina, vermelho). (A) A MEV de um feixe de fibras diferenciadoras do cristalino mostra interdigitações de esferas e soquetes (pontas de setas) ao longo do lado largo das células com pequenas saliências interligadas (setas) ao longo dos lados curtos das células. (B) Imagens confocais de um feixe de fibras diferenciadoras obtidas dos lados curtos mostram grandes interdigitações de bola e soquete ao longo dos lados largos das células (cabeças de setas). (C) Projeções ortogonais 2D (planos XY e XZ) através de uma única fibra de lente diferenciadora mostram uma interdigitação de bola e soquete (pontas de seta) ao longo do lado largo e pequenas saliências interligadas ao longo do lado curto (setas). Barras de escala = 5 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: MEV e imagens de microscopia confocal de células de fibras maduras do córtex do cristalino. As células fibrosas para microscopia confocal são coradas com WGA (verde) e faloidina (F-actina, vermelho). (A) A imagem de MEV apresenta duas fibras maduras entrelaçadas com pás (asteriscos) decoradas por pequenas saliências (setas) ao longo dos lados curtos das células. Há também pequenas reentrâncias (pontas de setas) ao longo do lado largo da célula. Estes são possivelmente os restos de encolhimento de saliências de bola e soquete. Barra de escala = 5 μm. (B) Projeções ortogonais 2D (planos XY e XZ) através de uma única fibra de lente madura têm grandes pás (asteriscos) e pequenas saliências (setas) interligadas ao longo dos lados curtos das células. Pequenos anéis WGA+ (pontas de seta), semelhantes aos recuos na imagem de MEV, são vistos ao longo do lado largo da célula. Essas estruturas WGA+ não possuem coloração de F-actina. A F-actina é enriquecida principalmente na membrana celular nas pequenas protrusões e tem um padrão de coloração reticulado fraco no citoplasma. Barra de escala = 5 μm. (C) Imagem de MEV das fibras maduras mostrando muitos sulcos na membrana celular (cabeças de setas), onde as saliências das células vizinhas repousam e se interligam. Barra de escala = 2 μm. (D) Um par de fibras maduras que são apenas separadas mostrando sulcos (pontas de setas) corados por WGA. Os sulcos não têm enriquecimento da coloração de F-actina e parecem protrusões que se estendem para dentro em direção ao citosol, em vez de se estenderem para fora como uma estrutura interligada. Barra de escala = 5 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Finalmente, as fibras coradas do cristalino nuclear são comparadas com imagens de preparações de MEV. Este novo método para fixar e corar as fibras nucleares do cristalino preserva fielmente a morfologia das fibras do cristalino nuclear em diferentes áreas do cristalino (Figura 8). As células de fibras nucleares apresentam saliências interligadas infrequentes e maiores ao longo de seus lados curtos (setas). As fibras mais externas do cristalino nuclear têm uma textura rugosa da membrana celular, como visto tanto na MEV quanto nas imagens de células coradas. À medida que as células sofrem maior compactação em direção ao centro do núcleo, interdigitações língua e sulco aparecem ao longo da membrana celular (asteriscos), e as fibras nucleares mais internas têm uma morfologia de membrana globular que pode ser apreciada na imagem de MEV e com coloração WGA. A F-actina não é mais enriquecida na membrana celular, mas forma uma rede preenchendo o citoplasma e estendendo-se fracamente nas protrusões.
Figura 8: MEV e imagens de microscopia confocal de células de fibras nucleares do cristalino. As células fibrosas para microscopia confocal são coradas com WGA (verde) e faloidina (F-actina, vermelho). (A) Imagens de microscopia eletrônica de varredura de fibras nucleares das camadas mais externas em direção ao centro do cristalino revelam protuberâncias intertravadas infrequentes e maiores nos lados curtos das células (setas). A membrana celular é rugosa nessas células, com interdigitações língua e sulco (asteriscos) e morfologia da membrana globular nas células mais internas. (B) As reconstruções 3D de pilhas z confocais através de fibras nucleares de lente única têm características comparáveis às imagens de MEV, incluindo saliências ao longo dos lados curtos (setas), interdigitações de língua e sulco (asteriscos) e a morfologia da membrana rugosa que é aparente com a coloração WGA. A F-actina forma uma rede que preenche o citoplasma celular e se estende fracamente para as protrusões. Barras de escala = 5 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este protocolo demonstrou os métodos de fixação, preservação e imunomarcação que preservam fielmente a morfologia da membrana 3D de feixes ou células de fibras do cristalino singular de várias profundidades no cristalino. As fibras coradas do cristalino são comparadas com preparações de MEV que têm sido usadas há muito tempo para estudar a morfologia das células das fibras do cristalino. Os resultados mostram estruturas de membrana comparáveis entre as duas preparações. A ME continua sendo o padrão-ouro para o estudo da morfologia celular, mas a imunomarcação é mais desafiadora em amostras de MEV para localizaçãode proteínas 33,34,35 e requer um microscópio eletrônico para ser imageada. A vantagem desse método de imunomarcação é que vários alvos podem ser marcados de uma só vez, e as imagens são coletadas em um microscópio confocal.
Embora o método preserve a morfologia celular complexa, a MEV ainda é necessária para comparar interdigitações entre fibras de controle e lentes alteradas devido a mutação genética, envelhecimento, tratamentos farmacêuticos, etc. A preparação de imunomarcação cria uma mistura de células do córtex ou núcleo do cristalino que são distribuídas aleatoriamente na lâmina. Assim, se a morfologia das células estiver alterada, pode ser mais difícil discernir a profundidade em que as células estavam localizadas no cristalino antes da dissociação para coloração. Nesses casos, pode ser necessário dissecar ainda mais o cristalino em regiões de interesse após a fixação e colorir feixes menores de fibras do cristalino para maior precisão espacial. Os resultados da coloração também devem ser comparados com imagens de MEV para garantir que as fibras imunomarcadas preservem a morfologia das células alteradas.
Foi demonstrado pela primeira vez que as células de fibra nuclear também podem ser preservadas para coloração usando este método recém-criado. É importante remover o córtex do cristalino antes da fixação do núcleo, pois a penetração do fixador não atinge o núcleo do cristalino ao fixar todo o cristalino27. O método deste protocolo para isolar o núcleo do cristalino descreve a remoção mecânica das fibras corticais mais macias do cristalino. Isso é possível em lentes de roedores devido ao núcleo muito duro e compactodo cristalino 28,30,36. Em outras espécies, o núcleo do cristalino é mais macio e pode exigir outros métodos para isolar essas células para coloração. Anteriormente, um método de vórtice foi usado para remover células de fibras corticais de uma linhagem de camundongo knockout com um núcleo de lente mais macio que não podia ser isolado de forma confiável por remoção mecânica29.
Embora não tenhamos demonstrado coloração primária de anticorpos nesses dados representativos, realizamos previamente o mesmo tipo de coloração com anticorpos primários e anticorpos secundários apropriados22,23. Em nossa experiência, muitas das proteínas de membrana têm um sinal puntiforme e, portanto, o uso de WGA ou F-actina em fibras corticais ou WGA em fibras nucleares é recomendado para delinear claramente a membrana celular para melhor localizar proteínas de membrana celular e reconhecer cada estágio de diferenciação e maturação celular. A coloração WGA ou F-actina deve estar em um canal visível (vermelho, verde ou azul) para permitir que o observador encontre as células apropriadas para aquisição de imagens usando a ocular facilmente. Este tipo de coloração de membrana também pode ajudar a identificar qualquer dano às células a partir do processo de fixação, coloração e montagem para excluir células danificadas mecanicamente. Neste e em trabalhos anteriores22,23, células mecanicamente danificadas são raramente observadas.
Este método requer o paciente e o exame sistemático das células para aquisição de imagens. A mistura aleatória de células pode ser bastante assustadora à primeira vista, mas as células que estão na orientação ideal geralmente podem ser encontradas. Este método pode ser adaptado para fibras do cristalino isoladas de outras espécies. Em lentes maiores, pode ser possível usar dissecção cuidadosa para separar as diferentes camadas de células antes da imunomarcação. Em resumo, este estudo criou um método robusto e confiável para preservar feixes de fibras ou células de fibra única para estudar sua morfologia complexa e localizar proteínas em 3D nessas células especializadas. Este protocolo único para coloração de fibras nucleares abre uma nova área de estudo sobre as fibras centrais menos bem estudadas da lente.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo processo R01 EY032056 (para CC) do Instituto Nacional de Olhos. Os autores agradecem à Dra. Theresa Fassel e Kimberly Vanderpool do Scripps Research Core Microscopy Facility por sua assistência com as imagens do microscópio eletrônico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% Triton X-100 | FisherScientific | BP151-500 | |
| 60mm plate | FisherScientific | FB0875713A | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 10X phosphate buffered saline | ThermoFisher | 70011-044 | |
| 1X phosphate buffered saline | ThermoFisher | 14190136 | |
| 48-well plate | CytoOne | CC7672-7548 | |
| Cover slips (22 x 40 mm) | FisherScientific | 12-553-467 | |
| Curved tweezers | World Precision Instruments | 501981 | |
| Dissection microscope | Carl Zeiss | Stereo Discovery V8 | |
| Fine tip straight tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72707-01 | |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | FisherScientific | 12-550-15 | |
| LSM 800 confocal microscope with Airyscan (63X) and Zen 3.5 Software | Carl Zeiss | ||
| Nail polish | |||
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Phalloidin (rhodamine) | ThermoFisher | R415 | |
| Primary antibody | |||
| Scalpel Feather Disposable, steril, No. 11 | VWR | 76241-186 | |
| Secondary antibody | |||
| Straight forceps | World Precision Instruments | 11252-40 | |
| Thermo Scientific Nunc MicroWell MiniTrays (dissection tray) | FisherScientific | 12-565-154 | |
| Ultra-fine scissors | World Precision Instruments | 501778 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Wheat germ agglutinin (fluorescein) | Vector Laboratories | FL-1021-5 |
References
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