Summary
Questo protocollo presenta un modello murino standardizzato di espansione della sutura e un metodo di visualizzazione 3D per studiare i cambiamenti meccanobiologici della sutura e il rimodellamento osseo sotto carico di forza di trazione.
Abstract
Le suture craniofacciali svolgono un ruolo cruciale oltre ad essere articolazioni fibrose che collegano le ossa craniofacciali; Servono anche come nicchia primaria per la crescita delle ossa calvari e facciali, ospitando cellule staminali mesenchimali e osteoprogenitori. Poiché la maggior parte delle ossa craniofacciali si sviluppa attraverso l'ossificazione intramembranosa, le regioni marginali delle suture fungono da punti di inizio. A causa di questa importanza, queste suture sono diventate bersagli intriganti nelle terapie ortopediche come l'espansione della volta cranica assistita da molle, la rapida espansione mascellare e la protrazione mascellare. Sotto la forza di tracciamento ortopedico, le cellule staminali di sutura vengono attivate rapidamente, diventando una fonte dinamica per il rimodellamento osseo durante l'espansione. Nonostante la loro importanza, i cambiamenti fisiologici durante i periodi di rimodellamento osseo rimangono poco compresi. I metodi di sezionamento tradizionali, principalmente in direzione sagittale, non catturano i cambiamenti completi che si verificano durante l'intera sutura. Questo studio ha stabilito un modello murino standard per l'espansione della sutura sagittale. Per visualizzare completamente i cambiamenti di rimodellamento osseo dopo l'espansione della sutura, il metodo di pulizia dei tessuti PEGASOS è stato combinato con la colorazione EdU a montaggio intero e la doppia marcatura chelante del calcio. Ciò ha permesso la visualizzazione di cellule altamente proliferanti e la formazione di nuovo osso in tutte le ossa calvari dopo l'espansione. Questo protocollo offre un modello murino standardizzato di espansione della sutura e un metodo di visualizzazione 3D, facendo luce sui cambiamenti meccanobiologici nelle suture e nel rimodellamento osseo sotto carico di forza di trazione.
Introduction
Le suture craniofacciali sono tessuti fibrosi che collegano le ossa craniofacciali e svolgono un ruolo essenziale nella crescita e nel rimodellamento delle ossa craniofacciali. La struttura della sutura assomiglia a un fiume, fornendo un flusso di risorse cellulari per nutrire e costruire la "riva del fiume", nota come fronti osteogenici, che contribuiscono alla formazione delle ossa craniofacciali attraverso l'osteogenesi intramembranosa1.
L'interesse per le suture craniofacciali è stato guidato dalle esigenze cliniche di comprendere la chiusura prematura delle suture craniche e la disfunzione della sutura facciale, che può portare a deformità craniofacciali e persino a condizioni pericolose per la vita nei bambini. La suturectomia a cielo aperto è utilizzata di routine nel trattamento clinico, ma il follow-up a lungo termine ha mostrato una recidiva di reossificazione incompleta in alcuni pazienti2. La craniotomia minimamente invasiva assistita da molle di espansione o craniectomia endoscopica a strisce può fornire un approccio più sicuro per preservare la potenziale sutura piuttosto che scartare i tessuti3. Allo stesso modo, le terapie ortopediche come le maschere facciali e gli apparecchi di espansione sono state ampiamente utilizzate per trattare l'ipoplasia sagittale o mascellare orizzontale, con alcuni studi che estendono il limite di età per il trattamento di pazienti adulti tramite espansori palatali assistiti da miniviti 4,5,6. Inoltre, la rigenerazione della sutura cranica con cellule staminali mesenchimali (MSC) combinate con materiali biodegradabili è una potenziale terapia in futuro, offrendo una nuova direzione per il trattamento delle malattie correlate7. Tuttavia, il processo funzionale o il meccanismo di regolazione delle suture rimane sfuggente.
Il rimodellamento osseo consiste principalmente in un equilibrio tra la formazione ossea condotta dagli osteoblasti e il riassorbimento osseo condotto dagli osteoclasti, dove la differenziazione osteogenica delle cellule staminali stimolate da segnali meccanici gioca un ruolo importante. Dopo decenni di ricerca, è stato scoperto che le suture craniofacciali sono nicchie di cellule staminali mesenchimali altamente plastiche8. Le cellule staminali di sutura (SuSC) sono un gruppo eterogeneo di cellule staminali, appartenenti alle cellule staminali mesenchimali (MSC) o alle cellule staminali ossee (SSC). Le SuSC sono marcate in vivo da quattro marcatori, tra cui Gli1, Axin2, Prrx1 e Ctsk. Le SuSC Gli1+ , in particolare, hanno rigorosamente verificato le caratteristiche biologiche delle cellule staminali, non solo esibendo un'elevata espressione dei tipici marcatori delle MSC, ma dimostrando anche un eccellente potenziale osteogenico e condrogenico9. Ricerche precedenti hanno dimostrato che le SuSC Gli1+ contribuiscono attivamente alla formazione di nuovo osso sotto la forza di trazione, identificandole come la fonte di cellule staminali della sutura che supporta l'osteogenesi da distrazione10.
In passato, sono state studiate in vitro ampie caratteristiche meccaniche delle cellule staminali tramite Flexcell, piegatura a quattro punti, sistema di caricamento a micromagnete e altri. Sebbene le cellule mesenchimali derivate dalla sutura cranica di topo siano state identificate in vitro11 e le cellule staminali mesenchimali da sutura umana siano state isolate di recente12, la risposta biomeccanica delle cellule di sutura rimane poco chiara nel sistema in vitro. Per studiare ulteriormente il processo di rimodellamento osseo, è stato stabilito un modello di espansione della sutura basato sulla coltura isolata di organi di calvaria, aprendo la strada alla creazione di un utile modello di espansione della sutura in vivo 1,13. I conigli14 e i ratti15 sono stati gli animali più utilizzati nella ricerca di base per l'espansione della sutura. Tuttavia, i topi sono modelli animali preferiti per esplorare le malattie umane a causa del loro genoma altamente omologo con gli esseri umani, delle numerose linee di modificazione genica e della forte capacità di ibridazione riproduttiva. I modelli murini esistenti di espansione della sutura cranica in genere si basano su fili elastici ortodontici in acciaio inossidabile per applicare una forza di trazione alla sutura sagittale16,17. In questi modelli, vengono praticati due fori su ciascun lato delle ossa parietali per fissare il dispositivo di espansione e i fili sono incorporati sotto la pelle, il che può influire sulla modalità di attivazione cellulare.
Per quanto riguarda il metodo di visualizzazione, l'osservazione bidimensionale delle fette in direzione sagittale è stata generalmente adottata per decenni. Tuttavia, considerando che il rimodellamento osseo è un complesso processo dinamico tridimensionale, ottenere informazioni tridimensionali complete è diventata un'esigenza urgente. La tecnica di trasparenza tissutale PEGASOS è emersa per soddisfare questo requisito18,19. Offre vantaggi unici per la trasparenza dei tessuti duri e molli, consentendo di riprodurre l'intero processo di rimodellamento osseo nello spazio tridimensionale.
Per ottenere una comprensione più profonda e completa dei cambiamenti fisiologici nei periodi di rimodellamento osseo, è stato stabilito un modello murino standard di espansione della sutura sagittale con un'impostazione a molla tra i supporti fatti a mano10. Con una procedura standardizzata di mordenzatura e incollaggio acido, il dispositivo di espansione potrebbe essere saldamente legato all'osso cranico, generando una forza di trazione perpendicolare alla sutura sagittale. Inoltre, il metodo di purificazione del tessuto PEGASOS è stato applicato dopo la doppia marcatura dell'osso mineralizzato post-espansione per visualizzare completamente i cambiamenti di modellazione ossea dopo l'espansione della sutura.
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Protocol
Tutte le procedure sperimentali qui descritte sono state approvate dal Comitato per la cura degli animali del Nono Ospedale del Popolo di Shanghai, Scuola di Medicina dell'Università Jiao Tong di Shanghai (SH9H-2023-A616-SB). In questo studio sono stati utilizzati topi maschi C57BL/6 di 4 settimane. Tutti gli strumenti utilizzati sono stati sterilizzati prima della procedura.
1. Preparazione del modello di espansione della sutura
- Predisposizione di due supporti di ritenzione.
- Utilizzare filo australiano da 0.014'' o filo di acciaio inossidabile (vedere la tabella dei materiali) per creare un anello elicoidale con pinze per fili leggeri. Il diametro dell'anello è di 2 mm e la coda di 1 mm è riservata su due lati (Figura 1A).
- Sterilizzare i fili e i supporti per l'intervento chirurgico in autoclave, sterilizzatore al plasma o sterilizzante a freddo adatto (ad es. glutaraldeide).
- Preparazione delle molle.
- Prepara molle in acciaio inossidabile personalizzate.
NOTA: In questo studio viene utilizzata la molla a pressione con diametro del filo di 0,2 mm, diametro esterno di 1,5 mm, spazio di intervallo di 1 mm e lunghezza di 7 mm (Figura 1B). Ogni compressione della molla di 1 mm otteneva una spinta di circa 30 g. - Tagliare la molla in una lunghezza disponibile prima di impostarla. Confermare la forza per la molla specializzata prima dell'esperimento.
NOTA: Le dimensioni delle molle variano purché l'entità della forza sia la stessa negli esperimenti paralleli. La forza viene misurata da uno strumento di prova uniassiale da tavolo o da un piccolo dinamometro elettronico (vedi Tabella dei materiali) se la condizione è limitata. La variazione di lunghezza viene valutata in base all'entità della forza (Figura 1C-E). In particolare, è necessario modificare il valore di carico della forza della molla in base all'età, alle condizioni ossee del topo e agli oggetti di ricerca. - Preparare un filo australiano dritto o un filo d'acciaio dritto di 7 mm di lunghezza e creare due pezzi di carta con un diametro di 2 mm da utilizzare come barriere (Figura 1F).
- Prepara molle in acciaio inossidabile personalizzate.
2. Chirurgia di espansione della sutura sagittale
- Anestetizzazione: Anestetizzare i topi con tiletamina (25 mg/kg), zolazepam (25 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg). Allo stesso tempo, applicare un unguento oftalmico sterile sugli occhi per prevenire la secchezza delle cornee. Giudica la profondità dell'anestesia dei topi pizzicando le dita dei piedi.
NOTA: Le seguenti caratteristiche indicano che il topo è anestetizzato correttamente: respirazione lenta e costante, debolezza degli arti, rilassamento muscolare, scomparsa del riflesso dell'agopuntura cutanea e del riflesso palpebrale, nonché riflesso corneale più debole. - Rimozione e disinfezione del pelo: rimuovere con cura il pelo sulla parte superiore della testa con una crema depilatoria; Evitare di toccarsi gli occhi. Subito dopo, utilizzare cicli alternati di iodoforo e alcol al 75% per disinfettare il sito chirurgico. Somministrare meloxicam (1 mg/kg) come analgesia ai topi mediante iniezione sottocutanea.
- Fissaggio della posizione del corpo: Metti il mouse sdraiato sulla parte anteriore e usa dei nastri chirurgici per fissare gli arti sul tavolo operatorio.
- Aprire il lembo del cuoio capelluto: utilizzare le forbici chirurgiche per eseguire un lembo arcuato lungo il cuoio capelluto vicino al collo del topo, esponendo completamente la sutura sagittale e il cranio circostante. Successivamente, fissare il lembo del cuoio capelluto con una sutura 6-0 sul tavolo operatorio.
- Incollare i supporti di ritenzione dopo l'acidatura.
- Asciugare il cranio e morderlo con acido fosforico al 37% per 20 secondi e utilizzare una normale soluzione salina per pulire l'acidatura (Figura 2A). Un residuo gessoso sarà evidente dopo aver asciugato il cranio con il bulbo della pipetta di gomma.
- Cementare i due supporti (preparati al punto 1.1) su entrambi i lati delle ossa parietali a 3 mm dalle suture sagittali con un adesivo fotopolimerizzabile (Figura 2B).
- Ripristina il lembo del cuoio capelluto.
- Riposizionare manualmente il lembo del cuoio capelluto (Figura 2C). Etichettare la posizione dei supporti, praticare due piccoli fori nel cuoio capelluto nella posizione corrispondente dei supporti di ritenzione bilaterali, quindi ripristinare il cuoio capelluto svolazzato.
- Allo stesso tempo, fai passare i piccoli anelli attraverso i fori per esporre la superficie della pelle. Suturare l'incisione curva con una sutura 6-0 (Figura 2D). Sono concessi da uno a tre giorni per il recupero della pelle. Somministrare meloxicam (1 mg/kg) ai topi mediante iniezione sottocutanea ogni 24 ore per 1-3 giorni.
NOTA: Dopo l'intervento chirurgico, controllare quotidianamente l'attività del cuoio capelluto del topo e se i supporti cadono. Esistono vari tipi di pelle in materia di colore e spessore; Il cuoio capelluto sano manterrà il colore originale e i bordi della pelle si fonderanno gradualmente dopo la sutura. Se viene rilevata un'infezione del cuoio capelluto o se il dispositivo chirurgico è caduto, rimuovere il topo dallo studio e sottoporlo a eutanasia.
- Installare la molla e il filo guida.
- Tagliare la molla 1 mm più lunga della distanza tra i due supporti.
- Comprimere la molla di pressione selezionata e posizionarla tra le piccole bobine su entrambi i lati.
- Passare il filo di acciaio inox attraverso le piccole spire e la molla, e rilasciare la molla per ottenere una spinta iniziale di circa 30 g.
- Verificare che il cuoio capelluto sotto l'area della molla del mouse sia privo di compressione.
- Dopo aver verificato che l'incollaggio sia solido senza allentamenti, incollare due pezzi di carta tra la molla e i supporti con un adesivo fotopolimerizzabile per creare barriere su entrambe le estremità della molla (Figura 2E,F).
3. Doppia etichettatura delle ossa mineralizzate
- Preparazione della soluzione madre.
- Preparare una soluzione di diluizione con acqua distillata contenente lo 0,9% di NaCl e il 2% di NaHCO3.
- Utilizzare la soluzione diluente per preparare 20 mg/mL di Alizarin complex dihydrate e 10 mg/mL di Calceina (vedere Tabella dei materiali).
- Regolare il pH a 7,4 utilizzando un dispositivo di misurazione del pH. Sciacquare la sonda di pH tra una misurazione e l'altra per garantire letture accurate.
- Mettere il colorante in un contenitore sterile e conservarlo in frigorifero a 4 °C; La pellicola viene utilizzata per tenere fuori la luce.
- Preparare la soluzione di lavoro. Prima dell'iniezione, diluire la soluzione madre a 1 mg/mL per il calcio e a 2 mg/mL per il complesso di alizarina diidrato utilizzando una soluzione di dissoluzione.
- Iniettare per via intraperitoneale 5 mg/kg di verde di Calceina e 20 mg/kg di rosso di Alizarina in due punti temporali per etichettare le ossa mineralizzate e analizzare i cambiamenti tra due volte. Generalmente, raccogliere i campioni 12-14 ore dopo l'iniezione.
NOTA: Riscaldare i coloranti prima dell'iniezione e assicurarsi che il tempo di iniezione non sia inferiore a 3 minuti. L'intervallo di iniezione dipende dal tempo di espansione. In questo studio, il rosso di alizarina e il verde di calceina sono stati iniettati durante la notte (O/N) prima dell'espansione e O/N prima della raccolta, rispettivamente. - Prelevare le ossa calvari intere preparate per la procedura di pulizia dei tessuti il giorno dopo la seconda iniezione.
4. Colorazione EdU
- Iniezione intraperitoneale: iniettare per via intraperitoneale EdU 2 h prima dell'eutanasia dei topi (seguendo i protocolli istituzionalmente approvati). La dose è di 1 mg/10 g di peso corporeo.
- Etichettatura della preparazione del cocktail: Miscelare soluzione salina tamponata Tris (100 mmol/L finale, pH 7,6), CuSO4 (4 mmol/L finale), Sulfo-Cianina 3 Azide (2-5 μmol/L finale) e Ascorbato di Sodio (100 mmol/L finale, prodotto fresco ad ogni utilizzo) (vedi Tabella dei materiali).
- Colorazione EdU a montaggio intero: dopo la fase di decolorazione dei tessuti nel metodo di pulizia dei tessuti PEGASOS (fase 7), mettere i campioni nel cocktail di etichettatura per 1 giorno a temperatura ambiente (RT).
5. Imaging con tomografia microcomputerizzata
- Fissazione e conservazione dei tessuti: fissare le ossa calvari in paraformaldeide (PFA) al 4% a 4 °C O/N e conservarle in PFA allo 0,5% prima della scansione.
- Scansione e analisi: scansiona i campioni con un sistema di imaging con tomografia microcomputerizzata (μCT) ad alta risoluzione e una dimensione del voxel di 7 μm.
6. Preparazione della soluzione di lavoro per la pulizia dei tessuti PEGASOS
- 4% poliformaldeide (PFA): Sciogliere 4 g di polvere di PFA in 1× PBS a 100 mL.
- Soluzione di perfusione cardiaca: 0,02% di eparina, cioè 20 mg di polvere di eparina disciolta in 1× PBS a 100 mL; in alternativa, utilizzare 0,05 mol/L di EDTA, cioè 0,05 mol di acido etilendiammina tetraacetico (EDTA) (vedi Tabella dei Materiali), disciolto in una soluzione acquosa deionizzata per un volume totale di 1 L.
- Soluzione di decalcificazione: 0,5 mol/L di EDTA, cioè 0,5 mol di acido etilendiammina tetraacetico (EDTA), disciolto in una soluzione acquosa deionizzata per un volume totale di 1 L.
- Soluzione di decolorazione: 25% di Quadrol, ovvero 250 mL di Quadrol (N, N, N', N' - Tetrakis (2-idrossipropil) etilendiammina) (vedi Tabella dei materiali) disciolti in acqua deionizzata per un volume totale di 1 L.
NOTA: A causa della viscosità di Quadrol, può essere riscaldato a 60 °C per aumentarne la fluidità prima della configurazione. - Soluzione sgrassante: 30%, 50%, 70% terz-butanolo (tB) (vedi tabella dei materiali), preparata con acqua per frazione volumetrica.
NOTA: Considerando che il tB puro è cristallino a temperatura ambiente, deve essere riscaldato a 60 °C fino a quando non si dissolve prima di poter essere utilizzato. Successivamente, viene aggiunta dal 3% al 5% (v/v) di trietanolammina (TEA) per regolare il pH della soluzione >9,5. - Soluzione di disidratazione: soluzione TB-PEG, 70% tB + 27% PEG-MMA + 3% Quadrol (v/v), in cui PEG-MMA è poli (glicole etilenico) metil etere metacrilato con un peso molecolare medio di 500 (poli (glicole etilenico) metacrilato 500, PEG-MMA 500) (vedi tabella dei materiali).
- Soluzione trasparente: soluzione BB-PEG, 75% BB + 22% PEG-MMA + 3% Quadrol (v/v), in cui BB è benzil benzoato (BB).
7. Trasparenza delle ossa calvari con il metodo PEGASOS
- Anestetizzare il topo mediante iniezione intraperitoneale di anestetici (passaggio 2.1) e giudicare la profondità dell'anestesia del topo attraverso la reazione di pizzicamento per assicurarsi che non vi sia alcuna reazione di resistenza prima della perfusione cardiaca.
- Eseguire la perfusione e la fissazione cardiaca.
- Tieni l'addome del topo verso l'alto, fissa gli arti con del nastro adesivo e taglia con cura lungo la circonferenza del torace per esporlo completamente.
- Subito dopo aver praticato un piccolo taglio nell'atrio destro con le forbici oftalmiche, inserire un ago di perfusione 22 G all'apice del ventricolo sinistro.
NOTA: Viene inserita solo la punta dell'ago per evitare di danneggiare la valvola cardiaca a causa di un inserimento eccessivo. In caso contrario, il liquido di perfusione cardiaca entrerà nella circolazione polmonare, influenzando l'effetto di perfusione della circolazione sistemica. - Spingere il liquido di perfusione cardiaca da 30-50 ml (passaggio 6.2) nella siringa. Si può vedere che il fegato diventa gradualmente pallido dal rosso vivo.
- Dopo che il fluido in uscita dall'atrio destro è diventato completamente limpido, infondere una soluzione di PFA al 4% in volume uguale. Il funzionamento della perfusione di PFA viene condotto in una cappa ventilata.
- Sezionare e separare i tessuti e gli organi e fissarli per una notte con PFA al 4% a 4 °C.
- Decalcificazione dei tessuti: per i campioni trattati mediante colorazione EdU, porre il tessuto duro fisso in una soluzione di EDTA 0,5 mol/L (pH 7,0) (10 mL) in una tavola vibrante a 37 °C per circa 2 giorni e cambiare il fluido ogni giorno.
NOTA: Saltare il processo di decalcificazione nel metodo PEGASOS normalizzato per le ossa marcate con agente chelante del calcio per preservare completamente la segnalazione. La decalcificazione è necessaria per trattare le ossa per visualizzare la fluorescenza endogena o i segnali immunocolorati a montaggio intero. - Decolorazione dei tessuti: Mettere le ossa calvari fisse in una soluzione di Quadrol al 25% (20 mL) in una tavola vibrante a 37 °C per 1 giorno e cambiare il fluido una volta.
NOTA: Il tempo di decolorazione è correlato al contenuto di eme nel tessuto. Osservare il colore del liquido di trattamento, poiché la profondità del colore rappresenta la necessità di continuare il trattamento di sostituzione del fluido. - Colorazione EdU: sciacquare i campioni in 1× PBS per 5 minuti (tre volte), quindi immergerli nel cocktail di etichettatura per 1 giorno. Successivamente, sciacquare i campioni in 1× PBS per 1 ora (tre volte).
- Sgrassaggio e disidratazione dei tessuti
- Posizionare i tessuti in soluzioni al 30% di tB, 50% di tB e 70% di tB in sequenza per eseguire la riduzione del gradiente su una tavola vibrante a 37 °C. Porre in ogni concentrazione per circa 2 ore.
- Successivamente, disidratare i campioni in soluzione di TB-PEG per 6 ore su una tavola vibrante a 37 °C.
NOTA: Il tempo di elaborazione di cui sopra può essere aumentato o diminuito a seconda del numero di tessuti.
- Trasparenza tissutale: Porre il tessuto completamente disidratato in soluzione di BB-PEG su un tavolo vibrante a 37 °C (2-4 h) fino a quando non diventa trasparente. Attualmente, i campioni possono essere conservati per un massimo di 1-2 anni.
NOTA: Dopo aver pulito quasi completamente, aprire il coperchio della provetta per esporre i campioni e il mezzo all'aria con l'agitazione migliorerà ulteriormente la trasparenza. Questo metodo è adatto per migliorare la trasparenza di singoli tessuti e organi, nonché dell'intera testa e del corpo dei giovani topi. Tuttavia, per la trasparenza dell'intero corpo dei topi adulti, i passaggi di cui sopra dovrebbero essere eseguiti utilizzando un metodo di perfusione a ciclo completo.
8. Imaging
NOTA: In questo studio è stata utilizzata la microscopia confocale per la visualizzazione 3D di tessuti trasparenti. Anche la microscopia a foglio luminoso è appropriata per questo protocollo. Diversi sistemi operativi sono stati verificati come disponibili in precedenza. In questo caso, viene preso come esempio un sistema operativo per microscopio confocale laser (vedi Tabella dei materiali).
- Secondo il manuale dell'utente, seguire i passaggi corretti per aprire l'interfaccia operativa confocale laser e LAS AF. Accendere il laser richiesto in diversi canali di ripresa e regolare la potenza. Impostare il percorso ottico e la lunghezza d'onda corrispondente, 561 nm per il rosso Alizarina e 488 nm per il verde Calceina, uno qualsiasi dei quali viene utilizzato per il segnale EdU in base al cocktail di marcatura.
- Posizionare i campioni trasparenti nella capsula di Petri in vetro concavo che può trasportare campioni spessi, scatole di inclusione o dispositivi di posizionamento autocostruiti come la colla impermeabile per immergere i campioni trasparenti in un liquido trasparente.
- Selezionare un obiettivo a bassa potenza per individuare rapidamente il campione. Fai una panoramica dell'intero tessuto calvario con la funzione di scansione rapida e trova l'area di interesse per l'imaging.
- Impostare la potenza di uscita, selezionare la modalità di scansione e regolare prima i coefficienti di scatto (risoluzione, velocità di scansione, fattore di zoom, qualità dell'immagine, rumore di fondo medio, ecc.).
NOTA: Generalmente, Smart Gain varia da 500 a 800 (variazione sia del segnale che del rumore); Smart Offset è il più vicino possibile a 0 garantendo al contempo la qualità dell'immagine (per ridurre il rumore di fondo). Quando il guadagno PMT è superiore a 800 o il guadagno HyD è superiore al 100% e la luminosità è ancora insufficiente, l'intensità del laser può essere aumentata in modo appropriato, ma in linea di principio, più bassa, meglio è. - Impostare l'intervallo Z della distanza assiale e il passo Z, che viene eseguito dal lato meno profondo dell'organizzazione trasparente; cioè, imposta i lati più profondi e meno profondi.
NOTA: Confermare la classificazione e la distanza di lavoro per ciascun obiettivo. Impostare con cautela la gamma Z e non utilizzare la distanza di lavoro oltre il limite dell'obiettivo selezionato. La "z-Galvo" può essere selezionata quando è necessaria una regolazione fine. - Impostare nuovamente i parametri di scatto e avviare la ripresa. Al termine, unire ed elaborare le immagini attraverso il modulo multifunzionale. Infine, conservare e spegnere lo strumento nell'ordine indicato.
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Representative Results
Utilizzando questo protocollo, è stato stabilito un modello murino per l'espansione della sutura sagittale (Figura 1-2). Per la visualizzazione 3D dei cambiamenti di modellazione ossea dopo l'espansione della sutura, il metodo di pulizia del tessuto PEGASOS è stato applicato a tutte le ossa calvari dopo l'espansione. Dopo la perfusione, le ossa calvari sono state separate (Figura 3A) e il processo PEGASOS appropriato è stato continuato (Tabella 1 e Tabella 2). Sorprendentemente, le ossa calvari sono diventate quasi trasparenti dopo il processo PEGASOS completo, indipendentemente dal fatto che sia stata eseguita o meno la decalcificazione (Figura 3B,C).
Per visualizzare rapidamente i cambiamenti dopo l'espansione, μCT è stato utilizzato sui campioni raccolti e fissati. Rispetto al gruppo di controllo (Figura 4A), la sutura cranica si è espansa gradualmente e significativamente dopo aver applicato la forza per 1 giorno (Figura 4B). Entro il quinto giorno, sono apparse soffici sporgenze ossee sul bordo osseo (Figura 4C).
Per la visualizzazione tridimensionale del tasso di giustapposizione di mineralizzazione nell'intera sutura dopo l'espansione, è stato utilizzato il metodo a doppia marcatura insieme all'efficiente tecnica PEGASOS, anche su ossa calvari non decalcificate (Figura 5). In condizioni fisiologiche, ci sono stati piccoli cambiamenti tra i segnali di marcatura precedente-post (Figura 5A), mentre il carico di forza ha attivato in modo significativo l'osteogenesi. Il modello a zig-zag dell'osso appena mineralizzato, marcato con un singolo marcatore giallo-verde di calcio, si è allargato dopo essersi espanso per 7 giorni (Figura 5B,C). Nella visualizzazione tridimensionale ad alta risoluzione, i cambiamenti del modello delle ossa marginali indicavano il processo di rimodellamento osseo dopo l'espansione della sutura e il grado di osso di nuova formazione variava su due lati delle suture (Figura 5C).
Inoltre, per visualizzare il tasso di proliferazione delle cellule dopo l'espansione della sutura, è stata tentata l'incorporazione di EdU a montaggio intero utilizzando il metodo di pulizia dei tessuti PEGASOS con un processo di calcificazione. Con successo, l'etichettatura è risultata efficiente e ben conservata nei tessuti puliti. Nel gruppo di controllo, diverse cellule EdU+ erano distribuite in modo diffuso attraverso le suture (Figura 6A), il che potrebbe essere importante per il rimodellamento osseo fisiologico e forse trascurato nel sezionamento 2D. Dopo l'espansione per 1 giorno, le cellule proliferanti hanno raggiunto il picco al centro e ai bordi delle suture (Figura 6B). Man mano che la sutura si allargava, il numero di cellule proliferanti diminuiva nel tempo, raggiungendo il giorno 7 (Figura 6C). Le cellule evidenziate erano piccole cellule rotonde nel midollo osseo, che indicavano le cellule del sangue, che differivano dalle cellule di sutura EdU+ (Figura 6C).
Figura 1: I materiali vitali sono stati preparati per l'intervento chirurgico. I supporti di ritenzione erano realizzati in filo di acciaio inossidabile. I loro diametri erano di 2 mm e le code di 1 mm erano riservate su due lati (A). È stata applicata la molla di pressione con diametro del filo di 0,2 mm, diametro esterno di 1,5 mm, spazio di intervallo di 1 mm (B). La forza di trazione è stata rilevata da un dinametro (C,D). Ogni compressione della molla di 1 mm ha ottenuto una spinta di circa 30 g (E) in questo esperimento. Ritagli di carta sono stati tagliati a forma di aquiloni con diametro di 2 mm da utilizzare come barriere (F). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Il processo chirurgico per il modello murino di espansione della sutura. Dopo aver capovolto il lembo calvario, l'incisione acida (A) e l'incollaggio (B) sono stati eseguiti nella posizione in cui i supporti di ritenzione sarebbero stati esposti. Dopo aver ripristinato il lembo del cuoio capelluto (C), i supporti sono stati esposti nella posizione contrassegnata (D). Una molla è stata posta tra due supporti per esercitare una forza di espansione sulla sutura calvariale, e due pezzi di carta sono stati fissati ad entrambe le estremità della molla come barriere (E,F) dopo aver confermato che i supporti erano saldamente legati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: La procedura di pulizia del tessuto PEGASOS è stata applicata per due ossa calvari con o senza decalcificazione. Dopo la perfusione, le ossa calvari sono state separate, con alcuni tessuti molli e macchiati di sangue attaccati (A). Le ossa calvari che hanno subito il processo di decalcificazione (B) o con non decalcificazione (C) erano quasi completamente trasparenti dopo l'intero processo di PEGASOS. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Suture calvari espanse gradualmente dopo l'esercizio di una forza di trazione. Immagini μCT della sutura sagittale senza carico forzato (A) e dopo carico forzato per 1 giorno e 5 giorni (B,C). Barra della scala: 100 μm. Exp = espansione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Osteogenesi attivata dopo l'espansione della sutura in immagini 3D. (A-C) Visualizzazione tridimensionale di suture sagittali a doppia marcatura eliminate con il metodo PEGASOS. Il rosso di alizarina e il verde di calceina sono stati iniettati per via intraperitoneale durante la notte prima dell'espansione e prima dell'eutanasia dopo l'espansione per 7 giorni (B,C), rispettivamente, rispetto al gruppo di controllo senza carico meccanico negli stessi punti temporali (A). L'obiettivo 5x è stato utilizzato per acquisire l'intera immagine della sutura in modo efficiente (A, B) e l'immagine del riquadro in (B) è stata ingrandita in (C, C', C'') ripreso con un obiettivo 10x. Barra della scala in A,B: 100 μm, C: 150 μm. Exp = espansione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Cellule di sutura altamente proliferate in seguito al carico della forza di trazione nelle immagini 3D. I saggi di incorporazione a montaggio intero combinati con il metodo di pulizia dei tessuti PEGASOS hanno mostrato le cellule proliferanti nell'intera sutura quando erano in quiete (A) o dopo il carico forzato per 1 giorno e 7 giorni (B,C). Immagine con un obiettivo 10x. Le linee tratteggiate delineano due bordi per le suture sagittali. Barra della scala: 100 μm. Exp = espansione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Processi | Soluzioni | Tempo e temperatura |
| 1. Iniezione intraperitoneale | 1 mg/10 g EdU | 2 ore prima dell'eutanasia dei topi |
| 2. Perfusione | 0,02% eparina e 0,05 mol/L EDTA | / |
| 3. Fissazione | 4% PFA | O/N, 4 °C |
| 4. Decalcificazione | 10% EDTA | 2 giorni, 37 °C |
| 5. Decolorazione | 25% Quadrol | 1 giorno, 37 °C |
| 6. Colorazione EdU | Etichettatura del cocktail | 1 giorno, RT |
| 7. Sgrassaggio | 30% terz-butanolo | 2 h, 37 °C |
| 50% terz-butanolo | 2 h, 37 °C | |
| 70% terz-butanolo | 2 h, 37 °C | |
| 8. Disidratazione | Soluzione TB-PEG | 3 h*2, 37 °C |
| 9. Schiarimento | Soluzione BB-PEG | 2 h, 37 °C |
Tabella 1: Procedura di pulizia tissutale PEGASOS per le ossa calvari con colorazione EdU.
| Processi | Soluzioni | Tempo e temperatura |
| 1. Iniezione intraperitoneale | 20 mg/kg Rosso di alizarina | durante la notte prima dell'espansione |
| 2. Iniezione intraperitoneale | 5 mg/kg di calceina | pernottamento prima del ritiro |
| 3. Perfusione | 0,02% eparina e 0,05 mol/L EDTA | / |
| 4. Fissazione | 4% PFA | O/N, 4 °C |
| 5. Decolorazione | 25% Quadrol | 1 giorno, 37 °C |
Tabella 2: Procedura di pulizia tissutale PEGASOS per le ossa calvari con doppia marcatura delle ossa mineralizzate mediante verde di calceina e rosso di alizarina.
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Discussion
Abbiamo applicato un modello murino di espansione della sutura standard per osservare i regolari cambiamenti morfologici che si verificano ogni settimana durante l'intero ciclo di rimodellamento della durata di un mese10. Questo modello è utile per la ricerca sul rimodellamento e la rigenerazione dell'osso calvario mediante l'espansione delle suture calvariali, nonché per lo studio di varie cellule di sutura in vivo. Per presentare in modo completo i risultati di tale ricerca, è necessaria la visualizzazione tridimensionale dei tessuti colorati. Pertanto, la tecnologia PEGASOS, nota per la sua efficienza nell'eliminazione dei tessuti duri19,20, è stata combinata con la doppia marcatura e la colorazione EdU per rivelare i tassi di mineralizzazione espansi e le cellule proliferanti durante il processo di espansione.
Per quanto riguarda l'intervento chirurgico di espansione della sutura, uno dei passaggi chiave è l'incollaggio dell'anello di ritegno. Per garantire un legame solido con la superficie ossea, abbiamo standardizzato il processo di mordenzatura acida e di incollaggio nella parte inferiore dell'anello di contenzione. I piccoli anelli sull'anello di ritenzione dovrebbero essere perpendicolari alla superficie ossea e corrispondere a piccoli fori sul cuoio capelluto. Dopo aver suturato il cuoio capelluto, le piccole anse devono essere esposte alla superficie della pelle attraverso piccoli fori in uno stato naturale ed equilibrato per evitare che l'anello di ritenzione collassi durante l'installazione della molla e del filo guida che applicano la forza, il che potrebbe portare al fallimento dell'intervento chirurgico. Inoltre, la scelta di una molla adatta per l'applicazione della forza è fondamentale per il successo dell'intervento chirurgico, in quanto facilita l'installazione della molla impedendo al contempo la caduta dell'anello di ritenzione e ottenendo l'applicazione della forza prevista.
Rispetto ai modelli precedenti, questo modello offre diversi vantaggi. In primo luogo, previene la formazione di difetti ossei circolari nell'osso parietale, preservando la modalità di attivazione cellulare. Inoltre, la forza può essere rimossa in qualsiasi momento smontando la molla, rendendola adatta a stabilire un modello di ricorrenza dopo lo stiramento da sforzo. La comodità di smontare la molla garantisce inoltre il minimo danno secondario agli animali da esperimento. Inoltre, l'entità meccanica della sollecitazione di trazione può essere facilmente regolata modificando la forza della molla. È importante sottolineare che questo modello mantiene l'ambiente fisiologico naturale intorno alla sutura cranica, garantendo così l'accuratezza dei risultati sperimentali.
Tuttavia, ci sono alcune limitazioni a questo modello di espansione. In primo luogo, c'è il rischio che l'anello di ritenzione cada se la forza è eccessiva. I principianti dovrebbero condurre esercizi preliminari nell'installazione della molla per mitigare questo rischio. In secondo luogo, c'è il rischio di infezione quando si apre il cuoio capelluto ed si espone il cranio, quindi la disinfezione dello strumento è essenziale e ridurre la durata dell'intervento chirurgico è benefico per la guarigione. L'anestesia eccessiva può anche portare alla morte dei topi.
Per quanto riguarda il metodo PEGASOS passivo, esso è applicabile al raggiungimento della trasparenza nei singoli tessuti e organi, nonché nell'intera testa e nel corpo dei giovani topi. Sebbene sia efficace per le ossa calvari intere, è necessario un tempo di elaborazione più lungo per i campioni più grandi, in particolare per i tessuti ossei interi o per i tessuti ossei lunghi alla rinfusa con articolazioni. È importante notare che la decalcificazione dei tessuti non deve essere eseguita quando si utilizza il protocollo di doppia etichettatura, poiché interferisce con il processo di colorazione. Il metodo di purificazione dei tessuti PEGASOS è anche flessibile, consentendo la combinazione con vari metodi di marcatura, non limitati all'incorporazione di EdU o alla doppia marcatura del calcio, ma anche alla fluorescenza endogena in modelli murini transgenici o alla colorazione di coloranti o anticorpi a montaggio intero, il tutto con fluorescenza ben conservata.
Con effetti stabili e un'elevata ripetibilità, questo modello di espansione della sutura è adatto a vari ceppi di topi transgenici di età diverse. La capacità di regolare l'entità della sollecitazione di trazione e di ritirare la forza in qualsiasi momento consente una comoda ricerca sulla ricorrenza dopo la stimolazione dello stress. Combinando il metodo della doppia marcatura delle ossa mineralizzate con la tecnica di pulizia dei tessuti PEGASOS, possiamo osservare la distribuzione spazio-temporale tridimensionale delle cellule staminali della sutura cranica durante il rimodellamento osseo, consentendo un'ulteriore esplorazione della relazione tra SUSC e stress meccanico, nonché dei suoi meccanismi specifici.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo per la piattaforma di laboratorio e l'assistenza dell'Ear Institute, Shanghai Jiaotong University School of Medicine. Questo lavoro è stato sostenuto dal Programma Pujiang di Shanghai (22PJ1409200); Fondazione Nazionale di Scienze Naturali della Cina (No.11932012); Fondazione per la ricerca scientifica post-dottorato del Nono Ospedale del Popolo di Shanghai, Scuola di Medicina dell'Università Jiao Tong di Shanghai; Finanziamento del programma di ricerca fondamentale del Nono Ospedale del Popolo affiliato alla Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (JYZZ154).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37% Acid etching | Xihubiom | E10-02/1807011 | |
| Alizarin red | Sigma-Aldrich | A3882 | |
| AUSTRALIAN WIRE | A.J.WILCOCK | 0.014'' | |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | B6630 | |
| Calcein green | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Copper(II) sulfate, anhydrous | Sangon Biotech | A603008 | |
| Dynamometer | Sanliang | SF-10N | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| EdU | Invitrogen | E104152 | |
| Laser Confocal Microscope | Leica | SP8 | |
| PBS | Sangon Biotech | E607008 | |
| PEG-MMA 500 | Sigma-Aldrich | 447943 | |
| PFA | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| pH Meters | Mettler Toledo | S220 | |
| Quadrol | Sigma-Aldrich | 122262 | |
| Sodium Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| Sodium bicarbonate | Sangon Biotech | A500873 | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A610476 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Spring | TAOBAO | 0.2*1.5*1*7 | |
| Sulfo-Cyanine3 azide | Lumiprobe | A1330 | |
| tert-Butanol | Sigma-Aldrich | 360538 | Protect from light. Do not freeze. |
| Transbond MIP Moisture Insensitive Primer |
3M Unitek | 712-025 | |
| Transbond XT Light Cure Adhesive Paste |
3M Unitek | 712-035 | |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | V900257 | |
| Tris-buffered saline | Sangon Biotech | A500027 |
References
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