טכניקת הדמיה תלת-ממדית לעיצוב מחדש של עצם במודל עכבר הרחבת תפר
Summary
פרוטוקול זה מציג מודל עכבר סטנדרטי להרחבת תפרים ושיטת הדמיה תלת-ממדית לחקר השינויים המכנוביולוגיים של התפר ועיצוב מחדש של העצם תחת העמסת כוח מתיחה.
Abstract
תפרים קרניופלציאליים ממלאים תפקיד מכריע מעבר להיותם מפרקים סיביים המחברים עצמות גולגולתיות; הם משמשים גם כנישה העיקרית לצמיחת עצם קלווארית ופנים, המאחסנים תאי גזע מזנכימליים ואבות ניווניים. מכיוון שרוב עצמות הגולגולת מתפתחות באמצעות אוסיפיקציה תוך ממברנית, אזורי השוליים של התפרים משמשים כנקודות התחלה. בשל חשיבות זו, תפרים אלה הפכו למטרות מסקרנות בטיפולים אורתופדיים כמו הרחבת קמרון גולגולת בסיוע קפיץ, הרחבה מקסילרית מהירה ומשיכה מקסילרית. תחת כוח מעקב אורתופדי, תאי גזע התפרים מופעלים במהירות, והופכים למקור דינמי לעיצוב מחדש של העצם במהלך הרחבה. למרות חשיבותם, השינויים הפיזיולוגיים במהלך תקופות שיפוץ העצם עדיין אינם מובנים. שיטות החתך המסורתיות, בעיקר בכיוון הסגיטלי, אינן לוכדות את השינויים המקיפים המתרחשים לאורך התפר כולו. מחקר זה ביסס מודל עכבר סטנדרטי להרחבת תפר קשת. כדי להמחיש באופן מלא שינויים בעיצוב מחדש של העצם לאחר הרחבת התפרים, שיטת ניקוי הרקמה של פגסוס שולבה עם צביעת EdU בהרכבה מלאה ותיוג כפול של כלאט סידן. זה איפשר הדמיה של תאים מתרבים מאוד והיווצרות עצם חדשה על פני כל העצמות הקלוואריאליות לאחר ההתרחבות. פרוטוקול זה מציע מודל סטנדרטי של עכבר הרחבת תפרים ושיטת הדמיה תלת-ממדית, השופכת אור על השינויים המכנוביולוגיים בתפרים ובעיצוב מחדש של העצם תחת עומס כוח מתיחה.
Introduction
תפרים קרניופלציאליים הם רקמות סיביות המחברות בין עצמות גולגולת וממלאות תפקידים חיוניים בצמיחה ושיפוץ של עצמות גולגולתיות. מבנה התפר דומה לנהר, ומספק זרימה של משאבי תאים כדי להזין ולבנות את “גדת הנהר”, המכונה חזיתות אוסטאוגניות, התורמות להיווצרות עצמות גולגולת באמצעות אוסטאוגנזה תוך ממברנית1.
העניין בתפרים קרניופלציאליים מונע על ידי צרכים קליניים להבין סגירה מוקדמת של תפרים גולגולתיים ותפקוד לקוי של תפרי הפנים, מה שעלול להוביל לעיוותים גולגולתיים ואף למצבים מסכני חיים אצל ילדים. כריתת סוטורקטומיה פתוחה משמשת באופן שגרתי בטיפול קליני, אך מעקב ארוך טווח הראה הישנות לא מלאה של אוסיפיקציה חוזרת בחלק מהחולים2. קרניוטומיה זעיר פולשנית בסיוע קפיצי הרחבה או כריתת גולגולת פס אנדוסקופית עשויה לספק גישה בטוחה יותר לשימור התפר הפוטנציאלי במקום להשליך את הרקמות3. באופן דומה, טיפולים אורתופדיים כגון מסכות פנים ומכשירי הרחבה נמצאים בשימוש נרחב לטיפול בהיפופלזיה מקסילרית קשת או אופקית, כאשר מחקרים מסוימים מרחיבים את מגבלת הגיל לטיפול בחולים מבוגרים באמצעות מרחיבי חיך בסיוע בורג קטן 4,5,6. בנוסף, התחדשות תפר גולגולתי עם תאי גזע מזנכימליים (MSC) בשילוב עם חומרים מתכלים היא טיפול פוטנציאלי בעתיד, המציע כיוון חדשני לטיפול במחלות קשורות7. עם זאת, תהליך התפקוד או מנגנון הבקרה של התפרים נותר חמקמק.
עיצוב מחדש של העצם מורכב בעיקר מאיזון בין היווצרות עצם המבוצעת על ידי אוסטאובלסטים לבין ספיגת עצם המבוצעת על ידי אוסטאוקלסטים, כאשר התמיינות אוסטאוגנית של תאי גזע המעוררים על ידי אותות מכניים ממלאת תפקיד חשוב. לאחר עשרות שנים של מחקר, נמצא כי תפרים גולגולתיים הם נישות תאי גזע מזנכימליות פלסטיות מאוד8. תאי גזע תופרים (SuSCs) הם קבוצה הטרוגנית של תאי גזע, השייכים לתאי גזע מזנכימליים (MSCs) או תאי גזע עצם (SSC). SuSCs מסומנים in vivo על ידי ארבעה סמנים, כולל Gli1, Axin2, Prrx1 ו- Ctsk. Gli1+ SuSCs, בפרט, אימתו בקפידה את המאפיינים הביולוגיים של תאי גזע, לא רק מציגים ביטוי גבוה של סמני MSC טיפוסיים, אלא גם מפגינים פוטנציאל אוסטאוגני וכונדרוגני מעולה9. מחקרים קודמים הראו כי Gli1+ SuSCs תורמים באופן פעיל להיווצרות עצם חדשה תחת כוח מתיחה, וזיהו אותם כמקור תאי גזע התפרים התומך באוסטאוגנזה10 של הסחת דעת.
בעבר, מאפיינים מכניים נרחבים של תאי גזע נחקרו במבחנה באמצעות Flexcell, כיפוף ארבע נקודות, מערכת העמסה מיקרו-מגנטית ועוד. למרות שתאי מזנכימליים שמקורם בתפר גולגולתי של עכבר זוהו במבחנה11, ותאי גזע מזנכימליים של תפרים אנושיים בודדו גם הם לאחרונה12, התגובה הביומכנית של תאי התפרים נותרה לא ברורה במערכת במבחנה. כדי להמשיך ולחקור את תהליך עיצוב מחדש של העצם, הוקם מודל הרחבת תפר המבוסס על תרבית איברי קלבריה מבודדים, וסלל את הדרך לביסוס מודל הרחבת תפר in vivo שימושי 1,13. ארנבים14 וחולדות15 היו בעלי החיים הנפוצים ביותר במחקר בסיסי להרחבת תפרים. עם זאת, עכברים הם מודלים מועדפים של בעלי חיים לחקר מחלות אנושיות בשל הגנום ההומולוגי מאוד שלהם עם בני אדם, קווי שינוי גנים רבים ויכולת הכלאה חזקה של רבייה. מודלים עכבריים קיימים של הרחבת תפר גולגולתי מסתמכים בדרך כלל על חוטי קפיץ אורתודונטיים מנירוסטה כדי להפעיל כוח מתיחה על תפר הקשת 16,17. בדגמים אלה, שני חורים נעשים בכל צד של עצמות הקודקוד כדי לתקן את מכשיר ההתרחבות, והחוטים מוטמעים מתחת לעור, מה שעשוי להשפיע על מצב הפעלת התא.
באשר לשיטת ההדמיה, התצפית הדו-ממדית של פרוסות בכיוון הקשת אומצה בדרך כלל במשך עשרות שנים. עם זאת, בהתחשב בכך שיפוץ עצם הוא תהליך דינמי תלת מימדי מורכב, קבלת מידע תלת מימדי מלא הפך צורך דחוף. טכניקת שקיפות הרקמה של פגסוס התפתחה כדי לענות על דרישה זו 18,19. הוא מציע יתרונות ייחודיים לשקיפות של רקמות קשות ורכות, ומאפשר לשחזר את תהליך עיצוב העצם המלא בחלל תלת ממדי.
כדי לקבל הבנה מעמיקה ומקיפה יותר של השינויים הפיזיולוגיים בתקופות עיצוב מחדש של העצם, הוקם מודל עכבר סטנדרטי להרחבת תפר סגיטלי עם הגדרת קפיץ בין המחזיקים בעבודת יד10. עם הליך תחריט והדבקה סטנדרטי של חומצה, מכשיר ההרחבה יכול להיות מחובר היטב לעצם הגולגולת, וליצור כוח מתיחה בניצב לתפר הסגיטלי. יתר על כן, שיטת ניקוי רקמות פגסוס יושמה לאחר תיוג כפול של העצם המינרלית לאחר ההתרחבות כדי להמחיש באופן מלא את השינויים במידול העצם לאחר הרחבת התפרים.
Protocol
Representative Results
Discussion
יישמנו מודל סטנדרטי של עכבר הרחבת תפר כדי לבחון את השינויים המורפולוגיים הקבועים המתרחשים מדי שבוע במהלך כל מחזור השיפוץ בן החודש10. מודל זה שימושי לחקר עיצוב מחדש והתחדשות עצם קלווריאלית על ידי הרחבת תפרים קלווריאליים, כמו גם לחקר תאי תפר שונים in vivo. כדי להציג באופן מלא א…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים על פלטפורמת המעבדה והסיוע של מכון האוזן, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת ג’יאוטונג בשנחאי. עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית שנחאי פוג’יאנג (22PJ1409200); הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס ‘11932012); קרן המחקר המדעי לפוסט-דוקטורט של בית החולים העממי התשיעי בשנחאי, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת ג’יאו טונג בשנחאי; מימון תוכנית מחקר בסיסית של בית החולים העממי התשיעי המסונף לבית הספר לרפואה של אוניברסיטת ג’יאו טונג בשנגחאי (JYZZ154).
Materials
| 37% Acid etching | Xihubiom | E10-02/1807011 | |
| Alizarin red | Sigma-Aldrich | A3882 | |
| AUSTRALIAN WIRE | A.J.WILCOCK | 0.014'' | |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | B6630 | |
| Calcein green | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Copper(II) sulfate, anhydrous | Sangon Biotech | A603008 | |
| Dynamometer | Sanliang | SF-10N | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| EdU | Invitrogen | E104152 | |
| Laser Confocal Microscope | Leica | SP8 | |
| PBS | Sangon Biotech | E607008 | |
| PEG-MMA 500 | Sigma-Aldrich | 447943 | |
| PFA | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| pH Meters | Mettler Toledo | S220 | |
| Quadrol | Sigma-Aldrich | 122262 | |
| Sodium Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| Sodium bicarbonate | Sangon Biotech | A500873 | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A610476 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Spring | TAOBAO | 0.2*1.5*1*7 | |
| Sulfo-Cyanine3 azide | Lumiprobe | A1330 | |
| tert-Butanol | Sigma-Aldrich | 360538 | Protect from light. Do not freeze. |
| Transbond MIP Moisture Insensitive Primer |
3M Unitek | 712-025 | |
| Transbond XT Light Cure Adhesive Paste |
3M Unitek | 712-035 | |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | V900257 | |
| Tris-buffered saline | Sangon Biotech | A500027 |
References
- Opperman, L. A. Cranial sutures as intramembranous bone growth sites. Developmental Dynamics. 219 (4), 472-485 (2000).
- Thenier-Villa, J. L., Sanromán-Álvarez, P., Miranda-Lloret, P., Plaza Ramírez, M. E. Incomplete reossification after craniosynostosis surgery-incidence and analysis of risk factors: a clinical-radiological assessment study. Journal Of Neurosurgery-pediatrics. 22 (2), 120-127 (2018).
- Markiewicz, M. R., Recker, M. J., Reynolds, R. M. Management of sagittal and lambdoid craniosynostosis: open cranial vault expansion and remodeling. Oral And Maxillofacial Surgery Clinics Of North America. 34 (3), 395-419 (2022).
- Mao, J. J., Wang, X., Kopher, R. A. Biomechanics of craniofacial sutures: orthopedic implications. Angle Orthodontist. 73 (2), 128-135 (2003).
- Shayani, A., Sandoval Vidal, P., Garay Carrasco, I., Merino Gerlach, M. Midpalatal suture maturation method for the assessment of maturation before maxillary expansion: a systematic review. Diagnostics (Basel). 12 (11), 2774 (2022).
- Suzuki, H., et al. Miniscrew-assisted rapid palatal expander (MARPE): the quest for pure orthopedic movement. Dental Press Journal Of Orthodontics. 21 (4), 17-23 (2016).
- Yu, M., et al. Cranial suture regeneration mitigates skull and neurocognitive defects in craniosynostosis. Cell. 184 (1), 243-256 (2021).
- Roth, D. M., Souter, K., Graf, D. Craniofacial sutures: Signaling centres integrating mechanosensation, cell signaling, and cell differentiation. European Journal of Cell Biology. 101 (3), 151258 (2022).
- Zhao, H., et al. The suture provides a niche for mesenchymal stem cells of craniofacial bones. Nature Cell Biology. 17 (4), 386-396 (2015).
- Jing, D., et al. Response of Gli1(+) suture stem cells to mechanical force upon suture expansion. Journal of Bone And Mineral Research. 37 (7), 1307-1320 (2022).
- Xu, Y., Malladi, P., Chiou, M., Longaker, M. T. Isolation and characterization of posterofrontal/sagittal suture mesenchymal cells in vitro. Plastic and Reconstructive Surgery. 119 (3), 819-829 (2007).
- Kong, L., et al. Isolation and characterization of human suture mesenchymal stem cells in vitro. International Journal of Stem Cells. 13 (3), 377-385 (2020).
- Ikegame, M., et al. Tensile stress induces bone morphogenetic protein 4 in preosteoblastic and fibroblastic cells, which later differentiate into osteoblasts leading to osteogenesis in the mouse calvariae in organ culture. Journal of Bone And Mineral Research. 16 (1), 24-32 (2001).
- Liu, S. S., Opperman, L. A., Buschang, P. H. Effects of recombinant human bone morphogenetic protein-2 on midsagittal sutural bone formation during expansion. American Journal of Orthodontics And Dentofacialorthopedics. 136 (6), 768-769 (2009).
- Liang, W., Ding, P., Li, G., Lu, E., Zhao, Z. Hydroxyapatite nanoparticles facilitate osteoblast differentiation and bone formation within sagittal suture during expansion in rats. Drug Design Development and Therapy. 15, 905-917 (2021).
- Morinobu, M., et al. Osteopontin expression in osteoblasts and osteocytes during bone formation under mechanical stress in the calvarial suture in vivo. Journal of Bone And Mineral Research. 18 (9), 1706-1715 (2003).
- Hwang, S., Chung, C. J., Choi, Y. J., Kim, T., Kim, K. H. The effect of cetirizine, a histamine 1 receptor antagonist, on bone remodeling after calvarial suture expansion. Korean Journal of Orthodontics. 50 (1), 42-51 (2020).
- Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).
- Jing, D., et al. Tissue clearing and its application to bone and dental tissues. Journal of Dental Research. 98 (6), 621-631 (2019).
- Luo, W., et al. Investigation of postnatal craniofacial bone development with tissue clearing-based three-dimensional imaging. Stem Cells Development. 28 (19), 1310-1321 (2019).
