Summary
פרוטוקול זה מציג מודל עכבר סטנדרטי להרחבת תפרים ושיטת הדמיה תלת-ממדית לחקר השינויים המכנוביולוגיים של התפר ועיצוב מחדש של העצם תחת העמסת כוח מתיחה.
Abstract
תפרים קרניופלציאליים ממלאים תפקיד מכריע מעבר להיותם מפרקים סיביים המחברים עצמות גולגולתיות; הם משמשים גם כנישה העיקרית לצמיחת עצם קלווארית ופנים, המאחסנים תאי גזע מזנכימליים ואבות ניווניים. מכיוון שרוב עצמות הגולגולת מתפתחות באמצעות אוסיפיקציה תוך ממברנית, אזורי השוליים של התפרים משמשים כנקודות התחלה. בשל חשיבות זו, תפרים אלה הפכו למטרות מסקרנות בטיפולים אורתופדיים כמו הרחבת קמרון גולגולת בסיוע קפיץ, הרחבה מקסילרית מהירה ומשיכה מקסילרית. תחת כוח מעקב אורתופדי, תאי גזע התפרים מופעלים במהירות, והופכים למקור דינמי לעיצוב מחדש של העצם במהלך הרחבה. למרות חשיבותם, השינויים הפיזיולוגיים במהלך תקופות שיפוץ העצם עדיין אינם מובנים. שיטות החתך המסורתיות, בעיקר בכיוון הסגיטלי, אינן לוכדות את השינויים המקיפים המתרחשים לאורך התפר כולו. מחקר זה ביסס מודל עכבר סטנדרטי להרחבת תפר קשת. כדי להמחיש באופן מלא שינויים בעיצוב מחדש של העצם לאחר הרחבת התפרים, שיטת ניקוי הרקמה של פגסוס שולבה עם צביעת EdU בהרכבה מלאה ותיוג כפול של כלאט סידן. זה איפשר הדמיה של תאים מתרבים מאוד והיווצרות עצם חדשה על פני כל העצמות הקלוואריאליות לאחר ההתרחבות. פרוטוקול זה מציע מודל סטנדרטי של עכבר הרחבת תפרים ושיטת הדמיה תלת-ממדית, השופכת אור על השינויים המכנוביולוגיים בתפרים ובעיצוב מחדש של העצם תחת עומס כוח מתיחה.
Introduction
תפרים קרניופלציאליים הם רקמות סיביות המחברות בין עצמות גולגולת וממלאות תפקידים חיוניים בצמיחה ושיפוץ של עצמות גולגולתיות. מבנה התפר דומה לנהר, ומספק זרימה של משאבי תאים כדי להזין ולבנות את "גדת הנהר", המכונה חזיתות אוסטאוגניות, התורמות להיווצרות עצמות גולגולת באמצעות אוסטאוגנזה תוך ממברנית1.
העניין בתפרים קרניופלציאליים מונע על ידי צרכים קליניים להבין סגירה מוקדמת של תפרים גולגולתיים ותפקוד לקוי של תפרי הפנים, מה שעלול להוביל לעיוותים גולגולתיים ואף למצבים מסכני חיים אצל ילדים. כריתת סוטורקטומיה פתוחה משמשת באופן שגרתי בטיפול קליני, אך מעקב ארוך טווח הראה הישנות לא מלאה של אוסיפיקציה חוזרת בחלק מהחולים2. קרניוטומיה זעיר פולשנית בסיוע קפיצי הרחבה או כריתת גולגולת פס אנדוסקופית עשויה לספק גישה בטוחה יותר לשימור התפר הפוטנציאלי במקום להשליך את הרקמות3. באופן דומה, טיפולים אורתופדיים כגון מסכות פנים ומכשירי הרחבה נמצאים בשימוש נרחב לטיפול בהיפופלזיה מקסילרית קשת או אופקית, כאשר מחקרים מסוימים מרחיבים את מגבלת הגיל לטיפול בחולים מבוגרים באמצעות מרחיבי חיך בסיוע בורג קטן 4,5,6. בנוסף, התחדשות תפר גולגולתי עם תאי גזע מזנכימליים (MSC) בשילוב עם חומרים מתכלים היא טיפול פוטנציאלי בעתיד, המציע כיוון חדשני לטיפול במחלות קשורות7. עם זאת, תהליך התפקוד או מנגנון הבקרה של התפרים נותר חמקמק.
עיצוב מחדש של העצם מורכב בעיקר מאיזון בין היווצרות עצם המבוצעת על ידי אוסטאובלסטים לבין ספיגת עצם המבוצעת על ידי אוסטאוקלסטים, כאשר התמיינות אוסטאוגנית של תאי גזע המעוררים על ידי אותות מכניים ממלאת תפקיד חשוב. לאחר עשרות שנים של מחקר, נמצא כי תפרים גולגולתיים הם נישות תאי גזע מזנכימליות פלסטיות מאוד8. תאי גזע תופרים (SuSCs) הם קבוצה הטרוגנית של תאי גזע, השייכים לתאי גזע מזנכימליים (MSCs) או תאי גזע עצם (SSC). SuSCs מסומנים in vivo על ידי ארבעה סמנים, כולל Gli1, Axin2, Prrx1 ו- Ctsk. Gli1+ SuSCs, בפרט, אימתו בקפידה את המאפיינים הביולוגיים של תאי גזע, לא רק מציגים ביטוי גבוה של סמני MSC טיפוסיים, אלא גם מפגינים פוטנציאל אוסטאוגני וכונדרוגני מעולה9. מחקרים קודמים הראו כי Gli1+ SuSCs תורמים באופן פעיל להיווצרות עצם חדשה תחת כוח מתיחה, וזיהו אותם כמקור תאי גזע התפרים התומך באוסטאוגנזה10 של הסחת דעת.
בעבר, מאפיינים מכניים נרחבים של תאי גזע נחקרו במבחנה באמצעות Flexcell, כיפוף ארבע נקודות, מערכת העמסה מיקרו-מגנטית ועוד. למרות שתאי מזנכימליים שמקורם בתפר גולגולתי של עכבר זוהו במבחנה11, ותאי גזע מזנכימליים של תפרים אנושיים בודדו גם הם לאחרונה12, התגובה הביומכנית של תאי התפרים נותרה לא ברורה במערכת במבחנה. כדי להמשיך ולחקור את תהליך עיצוב מחדש של העצם, הוקם מודל הרחבת תפר המבוסס על תרבית איברי קלבריה מבודדים, וסלל את הדרך לביסוס מודל הרחבת תפר in vivo שימושי 1,13. ארנבים14 וחולדות15 היו בעלי החיים הנפוצים ביותר במחקר בסיסי להרחבת תפרים. עם זאת, עכברים הם מודלים מועדפים של בעלי חיים לחקר מחלות אנושיות בשל הגנום ההומולוגי מאוד שלהם עם בני אדם, קווי שינוי גנים רבים ויכולת הכלאה חזקה של רבייה. מודלים עכבריים קיימים של הרחבת תפר גולגולתי מסתמכים בדרך כלל על חוטי קפיץ אורתודונטיים מנירוסטה כדי להפעיל כוח מתיחה על תפר הקשת 16,17. בדגמים אלה, שני חורים נעשים בכל צד של עצמות הקודקוד כדי לתקן את מכשיר ההתרחבות, והחוטים מוטמעים מתחת לעור, מה שעשוי להשפיע על מצב הפעלת התא.
באשר לשיטת ההדמיה, התצפית הדו-ממדית של פרוסות בכיוון הקשת אומצה בדרך כלל במשך עשרות שנים. עם זאת, בהתחשב בכך שיפוץ עצם הוא תהליך דינמי תלת מימדי מורכב, קבלת מידע תלת מימדי מלא הפך צורך דחוף. טכניקת שקיפות הרקמה של פגסוס התפתחה כדי לענות על דרישה זו 18,19. הוא מציע יתרונות ייחודיים לשקיפות של רקמות קשות ורכות, ומאפשר לשחזר את תהליך עיצוב העצם המלא בחלל תלת ממדי.
כדי לקבל הבנה מעמיקה ומקיפה יותר של השינויים הפיזיולוגיים בתקופות עיצוב מחדש של העצם, הוקם מודל עכבר סטנדרטי להרחבת תפר סגיטלי עם הגדרת קפיץ בין המחזיקים בעבודת יד10. עם הליך תחריט והדבקה סטנדרטי של חומצה, מכשיר ההרחבה יכול להיות מחובר היטב לעצם הגולגולת, וליצור כוח מתיחה בניצב לתפר הסגיטלי. יתר על כן, שיטת ניקוי רקמות פגסוס יושמה לאחר תיוג כפול של העצם המינרלית לאחר ההתרחבות כדי להמחיש באופן מלא את השינויים במידול העצם לאחר הרחבת התפרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים הניסיוניים המתוארים כאן אושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים של בית החולים העממי התשיעי בשנחאי, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת ג'יאו טונג בשנגחאי (SH9H-2023-A616-SB). במחקר זה נעשה שימוש בעכברים זכרים C57BL/6 בני 4 שבועות. כל המכשירים בהם נעשה שימוש עוקרו לפני ההליך.
1. הכנת מודל הרחבת התפרים
- הכנת שני בעלי שמירה.
- השתמש בחוט אוסטרלי בגודל 0.014 אינץ' או חוט נירוסטה (ראה טבלת חומרים) ליצירת לולאה סלילית עם צבת חוט קלה. קוטר הלולאה הוא 2 מ"מ, והזנב בקוטר 1 מ"מ שמור משני הצדדים (איור 1A).
- יש לעקר את החוטים והמחזיקים לצורך הניתוח באוטוקלאב, מעקר פלזמה או חומר מעקר מתאים (למשל, גלוטראלדהיד).
- הכנת המעיינות.
- הכינו קפיצי נירוסטה בהתאמה אישית.
הערה: קפיץ הלחץ בקוטר חוט 0.2 מ"מ, קוטר חיצוני של 1.5 מ"מ, מרווח של 1 מ"מ ואורך של 7 מ"מ משמש במחקר זה (איור 1B). כל דחיסת קפיץ של 1 מ"מ קיבלה דחף של כ -30 גרם. - חותכים את הקפיץ לאורך זמין לפני ההגדרה. אשר את הכוח עבור קפיץ מיוחד לפני הניסוי.
הערה: גדלי הקפיצים משתנים כל עוד עוצמת הכוח זהה בניסויים מקבילים. הכוח נמדד על ידי מכשיר בדיקה חד-צירי שולחני או דינמומטר אלקטרוני קטן (ראה טבלת חומרים) אם המצב מוגבל. שינוי האורך מוערך לגודל הכוח (איור 1C-E). יש לציין כי יש צורך לשנות את ערך העמסת כוח הקפיץ בהתבסס על גיל, מצב העצם של העכבר וחפצי המחקר. - הכינו חוט אוסטרלי ישר אחד או חוט פלדה ישר באורך 7 מ"מ, והכינו שתי פיסות נייר בקוטר 2 מ"מ לשימוש כמחסומים (איור 1F).
- הכינו קפיצי נירוסטה בהתאמה אישית.
2. ניתוח הרחבת תפר קשת
- הרדמה: מרדימים את העכברים בטילטמין (25 מ"ג/ק"ג), זולאזפאם (25 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (10 מ"ג/ק"ג). במקביל, להחיל משחה אופתלמית סטרילית על העיניים כדי למנוע ייבוש של הקרניות. שפטו את עומק ההרדמה של העכברים באמצעות צביטת בוהן.
הערה: המאפיינים הבאים מצביעים על כך שהעכבר מורדם כראוי: נשימה איטית ויציבה, חולשת גפיים, הרפיית שרירים, היעלמות רפלקס דיקור העור ורפלקס העפעפיים, כמו גם רפלקס קרנית חלש יותר. - הסרת פרווה וחיטוי: בזהירות להסיר את הפרווה על החלק העליון של הראש עם קרם הסרת שיער; הימנעו מלגעת בעיניים. זמן קצר לאחר מכן, השתמש בסבבים לסירוגין של יודופור ו 75% אלכוהול כדי לחטא את אתר הניתוח. מתן meloxicam (1 מ"ג / ק"ג) כמו משכך כאבים לעכברים על ידי הזרקה תת עורית.
- קיבוע תנוחת הגוף: הניחו את העכבר שוכב על החלק הקדמי והשתמשו בסרטי ניתוח כדי לקבע את הגפיים על שולחן הניתוחים.
- דש קרקפת פתוח: השתמשו במספריים כירורגיים כדי לבצע דש ארקואט לאורך הקרקפת ליד צוואר העכבר, תוך חשיפה מלאה של תפר הקשת והגולגולת שמסביב. לאחר מכן, לתקן את דש הקרקפת עם תפר 6-0 על שולחן הניתוחים.
- קשרו את מחזיקי השימור לאחר תחריט חומצה.
- יבשו את הגולגולת וחרטו אותה עם 37% חומצה זרחתית למשך 20 שניות, והשתמשו במי מלח רגילים כדי לנקות את תחריט החומצה (איור 2A). שאריות גיר יתגלו לאחר ייבוש הגולגולת עם נורת פיפטת הגומי.
- מלטים את שני המחזיקים (מוכנים בשלב 1.1) משני צידי עצמות הקודקוד במרחק 3 מ"מ מהתפרים הסגיטליים בעזרת דבק קל (איור 2B).
- אפסו את דש הקרקפת.
- החזירו ידנית את דש הקרקפת (איור 2C). תייגו את מיקום המחזיקים, חתכו שני חורים קטנים בקרקפת במיקום המתאים של מחזיקי השימור הדו-צדדיים, ולאחר מכן אפסו את הקרקפת המנופפת.
- במקביל, להעביר את הלולאות הקטנות דרך החורים כדי לחשוף את פני העור. תפרו את החתך המעוגל בתפר 6-0 (איור 2D). יום עד שלושה ימים מותרים להתאוששות העור. מתן meloxicam (1 מ"ג / ק"ג) לעכברים על ידי הזרקה תת עורית כל 24 שעות במשך 1 עד 3 ימים.
הערה: לאחר הניתוח, יש לבדוק מדי יום את פעילות קרקפת העכבר והאם המחזיקים נופלים. ישנם סוגים שונים של עור בעניין צבע ועובי; הקרקפת הבריאה של העור תשמור על הצבע המקורי, וקצוות העור יתמזגו בהדרגה לאחר התפירה. אם נמצא זיהום בקרקפת, או אם מכשיר הניתוח נפל, הסר את העכבר מהמחקר והרדים אותו.
- התקן את הקפיץ ואת חוט המנחה.
- חותכים את הקפיץ 1 מ"מ יותר מהמרחק בין שני המחזיקים.
- דחסו את קפיץ הלחץ שנבחר והניחו אותו בין הסלילים הקטנים משני הצדדים.
- מעבירים את חוט הנירוסטה דרך הסלילים הקטנים והקפיץ, ומשחררים את הקפיץ לקבלת דחף התחלתי של כ-30 גרם.
- בדוק שהקרקפת מתחת לאזור הקפיץ של העכבר היא ללא דחיסה.
- לאחר שווידאתם שההדבקה יציבה ללא כל רפיון, קשרו שתי פיסות נייר בין הקפיץ לבין המחזיקים בדבק קל כדי ליצור מחסומים בשני קצות הקפיץ (איור 2E,F).
3. תיוג כפול של עצמות מינרליות
- הכנת פתרון המלאי.
- הכינו תמיסת דילול עם מים מזוקקים המכילה 0.9% NaCl ו-2% NaHCO3.
- השתמש בתמיסה המדללת להכנת 20 מ"ג / מ"ל של קומפלקס אליזרין דיהידרט ו -10 מ"ג / מ"ל של קלצין (ראה טבלת חומרים).
- כוונן את ה- pH ל- 7.4 באמצעות מכשיר מדידת pH. שטפו את בדיקת ה-pH בין המדידות כדי להבטיח קריאות מדויקות.
- שים את הצבע לתוך מיכל סטרילי ולאחסן אותו במקרר ב 4 ° C; רדיד אלומיניום משמש כדי להרחיק אור.
- הכן את פתרון העבודה. לפני ההזרקה, יש לדלל את תמיסת הציר ל-1 מ"ג/מ"ל עבור סידן ו-2 מ"ג/מ"ל עבור קומפלקס אליזרין דיהידרט באמצעות תמיסת המסה.
- הזריקו תוך צפקית 5 מ"ג/ק"ג של קלצאין ירוק ו-20 מ"ג/ק"ג אדום אליזרין בשתי נקודות זמן כדי לסמן את העצמות שעברו מינרליזציה ולנתח את השינויים בין שתי פעמים. בדרך כלל, לאסוף את הדגימות 12-14 שעות לאחר ההזרקה.
הערה: חממו את הצבעים לפני ההזרקה, וודאו שזמן ההזרקה אינו פחות מ-3 דקות. מרווח ההזרקה תלוי בזמן ההתרחבות. במחקר זה, אדום אליזרין וירוק קלצין הוזרקו במשך הלילה (O/N) לפני הרחבה ו- O/N לפני האיסוף, בהתאמה. - לאסוף עצמות קלוריות שלמות שהוכנו להליך ניקוי רקמות יום לאחר הזריקה השנייה.
4. צביעת EdU
- הזרקה תוך צפקית: הזרקה תוך צפקית EdU שעתיים לפני המתת העכברים (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי מוסדות). המינון הוא 1 מ"ג / 10 גרם משקל גוף.
- הכנת קוקטייל תיוג: ערבבו מי מלח חוצצים טריס (100 mmol / L סופי, pH 7.6), CuSO4 (4 mmol / L סופי), Sulfo-ציאנין 3 Azide (2-5 μmol / L סופי) ונתרן אסקורבט (100 mmol / L סופי, עשוי טרי בכל שימוש) (ראה טבלה של חומרים).
- צביעה בהרכבה מלאה של EdU: לאחר שלב הסרת צבע הרקמה בשיטת ניקוי הרקמה של PEGASOS (שלב 7), הכניסו דגימות לקוקטייל התיוג למשך יום אחד בטמפרטורת החדר (RT).
5. הדמיית טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת
- קיבוע רקמות ואחסון: קבע את עצמות הקלוואריה ב-4% פרפורמלדהיד (PFA) ב-4°C O/N ואחסן אותן ב-0.5% PFA לפני הסריקה.
- סריקה וניתוח: סרוק את הדגימות באמצעות מערכת הדמיה של טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (μCT) ברזולוציה גבוהה ובגודל ווקסל של 7 מיקרומטר.
6. הכנת פתרון עבודה לניקוי רקמות פגסוס
- 4% פוליפורמלדהיד (PFA): יש להמיס 4 גרם אבקת PFA ב-1× PBS עד 100 מ"ל.
- פתרון זילוח לב: 0.02% הפרין, כלומר, 20 מ"ג אבקת הפרין מומס ב 1× PBS עד 100 מ"ל; לחלופין, השתמש 0.05 mol/L EDTA, כלומר, 0.05 mol של אתילן דיאמין חומצה טטראצטית (EDTA) (ראה טבלה של חומרים), מומס בתמיסה מימית deionized לנפח כולל של 1 L.
- תמיסת הסתיידות: 0.5 mol/L EDTA, כלומר, 0.5 mol של אתילן דיאמין חומצה טטראצטית (EDTA), מומס בתמיסה מימית deionized לנפח כולל של 1 L.
- תמיסת דה-קולוריזציה: 25% Quadrol, שהם 250 מ"ל של Quadrol (N, N, N', N' - Tetrakis (2-Hydroxypropyl) ethylenediamine) (ראה טבלת חומרים) מומס במים deionized לנפח כולל של 1 L.
הערה: בשל צמיגות Quadrol, ניתן לחמם אותו ל 60 ° C כדי להגדיל את הנזילות שלו לפני התצורה. - תמיסת הסרת שומנים: 30%, 50%, 70% טרט-בוטנול (tB) (ראה טבלת חומרים), מוכן עם מים לפי חלק נפח.
הערה: בהתחשב בכך ששחפת טהורה היא גבישית בטמפרטורת החדר, יש לחמם אותה ל-60°C עד שהיא מתמוססת לפני שניתן יהיה להשתמש בה. לאחר מכן, 3% עד 5% (v/v) triethanolamine (TEA) מתווסף כדי לווסת את ה- pH של התמיסה >9.5. - תמיסת התייבשות: תמיסת TB-PEG, 70% tB + 27% PEG-MMA + 3% Quadrol (v/v), כאשר PEG-MMA הוא פולי (אתילן גליקול) מתיל אתר מתקרילט עם משקל מולקולרי ממוצע של 500 (פולי (אתילן גליקול) מתקרילט 500, PEG-MMA 500) (ראה טבלת חומרים).
- פתרון שקוף: תמיסת BB-PEG, 75% BB + 22% PEG-MMA + 3% Quadrol (v/v), כאשר BB הוא בנזיל בנזואט (BB).
7. שקיפות עצמות קלווריאלי בשיטת פגסוס
- מרדימים את העכבר על ידי הזרקה תוך צפקית של חומרי הרדמה (שלב 2.1), ושופטים את עומק ההרדמה של העכבר באמצעות תגובת הצביטה כדי להבטיח שאין תגובת התנגדות לפני זילוח הלב.
- בצע זילוח לב וקיבוע.
- החזיקו את בטן העכבר כלפי מעלה, תקנו את הגפיים בסרט הדבקה וחתכו בזהירות לאורך היקף בית החזה כדי לחשוף אותו במלואו.
- מיד לאחר ביצוע חתך קטן באטריום הימני עם מספריים אופתלמיים, להכניס זילוח 22 G מחט בקודקוד החדר השמאלי.
הערה: רק קצה המחט מוכנס כדי למנוע פגיעה במסתם הלב באמצעות החדרת יתר. אחרת, נוזל זילוח הלב ייכנס למחזור הדם הריאתי, וישפיע על אפקט הזילוח של מחזור הדם המערכתי. - לדחוף את נוזל זילוח הלב 30-50 מ"ל (שלב 6.2) במזרק. ניתן לראות כי הכבד הופך בהדרגה חיוור מאדום בוהק.
- לאחר שנוזל הזרימה מהאטריום הימני הופך ברור לחלוטין, להחדיר תמיסת 4% PFA בנפח שווה. הפעלת זילוח PFA מתבצעת במכסה מנוע מאוורר.
- נתחו והפרידו את הרקמות והאיברים, וקבעו אותם למשך הלילה עם 4% PFA ב-4°C.
- הסתיידות רקמות: עבור דגימות המעובדות על ידי צביעת EdU, הניחו את הרקמה הקשיחה הקבועה בתמיסת 0.5mol/L EDTA (pH 7.0) (10 מ"ל) בשולחן ניעור בטמפרטורה של 37°C למשך כיומיים, והחליפו את הנוזל מדי יום.
הערה: דלג על תהליך ההסתיידות בשיטת פגסוס המנורמלת עבור חומר כלאט סידן המסומן בעצמות כדי לשמר את האיתות במלואו. Decalcification נדרש לטיפול בעצמות כדי לדמיין את פלואורסצנטיות אנדוגנית או אותות immunostained הר שלם. - שינוי צבע רקמות: הניחו את העצמות הקלוואריאליות הקבועות בתמיסת קוואדרול 25% (20 מ"ל) בשולחן ניעור בטמפרטורה של 37°C למשך יום אחד, והחליפו את הנוזל פעם אחת.
הערה: זמן הסרת הצבע קשור לתוכן הם ברקמה. שימו לב לצבע נוזל הטיפול, שכן עומק הצבע מייצג את הצורך להמשיך את הטיפול בתחליפי נוזלים. - צביעת EdU: שטפו את הדגימות ב-1× PBS במשך 5 דקות (שלוש פעמים), ולאחר מכן טבלו אותן בקוקטייל התיוג למשך יום אחד. לאחר מכן, לשטוף את הדגימות ב 1× PBS במשך 1 שעה (שלוש פעמים).
- הסרת שומנים ברקמות והתייבשות
- הניחו את הרקמות בתמיסות 30% tB, 50% tB ו-70% tB ברצף כדי לבצע ירידה הדרגתית על שולחן רעד ב-37°C. מניחים בכל ריכוז כשעתיים.
- לאחר מכן, יש לייבש את הדגימות בתמיסת TB-PEG למשך 6 שעות על שולחן רועד בטמפרטורה של 37°C.
הערה: ניתן להגדיל או להקטין את זמן העיבוד לעיל בהתאם למספר הרקמות.
- שקיפות רקמות: הניחו את הרקמה המיובשת לחלוטין בתמיסת BB-PEG על שולחן ניעור בטמפרטורה של 37°C (2-4 שעות) עד לשקיפות. נכון לעכשיו, דגימות ניתן לאחסן עד 1-2 שנים.
הערה: לאחר ניקוי כמעט מלא, פתח את מכסה הצינור כדי לחשוף את הדגימות ומדיום לאוויר עם רעידות ישפר עוד יותר את השקיפות. שיטה זו מתאימה לשיפור השקיפות של רקמות ואיברים בודדים, כמו גם את כל הראש והגוף של עכברים צעירים. עם זאת, עבור שקיפות של כל הגוף של עכברים בוגרים, השלבים לעיל צריך להתבצע באמצעות שיטת זילוח מחזור מלא.
8. הדמיה
הערה: מיקרוסקופ קונפוקלי שימש להדמיה תלת-ממדית של רקמות שקופות במחקר זה. מיקרוסקופ גיליון אור מתאים גם לפרוטוקול זה. מספר מערכות הפעלה אומתו כזמינות בעבר. כאן נלקחת כדוגמה מערכת הפעלה של מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי (ראו טבלת חומרים).
- בהתאם למדריך למשתמש, בצע את השלבים הנכונים כדי לפתוח את ממשק הפעולה של לייזר קונפוקל ו- LAS AF. הפעל את הלייזר הנדרש בערוצי צילום שונים והתאם את הכוח. הגדר את הנתיב האופטי ואת אורך הגל המתאים, 561 ננומטר עבור אדום אליזרין ו 488 ננומטר עבור ירוק Calcein, שכל אחד מהם משמש עבור אות EdU על פי קוקטייל התיוג.
- הניחו את הדגימות השקופות בצלחת פטרי מזכוכית קעורה שיכולה לשאת דגימות עבות, קופסאות הטבעה או מכשירי מיקום מתוצרת עצמית כגון דבק עמיד למים כדי לטבול את הדגימות השקופות בנוזל שקוף.
- בחרו עדשה אובייקטיבית בעוצמה נמוכה כדי לאתר במהירות את הדגימה. ערוך סקירה כללית של כל הרקמה הקלוואריאלית עם פונקציית הסריקה המהירה, ומצא את אזור העניין להדמיה.
- הגדר את עוצמת הפלט, בחר את מצב הסריקה והתאם תחילה את מקדמי הצילום (רזולוציה, מהירות סריקה, גורם זום, איכות תמונה, רעשי רקע ממוצעים וכו ').
הערה: באופן כללי, Smart Gain נע בין 500 ל-800 (הן שינוי אות והן שינוי רעש); הסטה חכמה קרובה ככל האפשר ל-0 תוך הבטחת איכות התמונה (להפחתת רעשי רקע). כאשר רווח PMT גבוה מ- 800, או רווח HyD גדול מ- 100%, והבהירות עדיין אינה מספקת, ניתן להגדיל את עוצמת הלייזר כראוי, אך באופן עקרוני, ככל שנמוך יותר, כן ייטב. - הגדר את טווח המרחק הצירי Z ואת צעד Z, אשר מסתעף מהצד הרדוד ביותר של הארגון השקוף; כלומר, להגדיר את הצדדים העמוקים והרדודים ביותר.
הערה: אשר את הסיווג ואת מרחק העבודה עבור כל עדשה. הגדר בזהירות את טווח Z, ואל תפעיל את מרחק העבודה החורג ממגבלת העדשה שנבחרה. ניתן לבחור את "z-Galvo" כאשר יש צורך ברגולציה עדינה. - הגדר שוב את פרמטרי הצילום והתחל לירות. לאחר השלמת, מזג ועבד את התמונות באמצעות המודול הרב-תכליתי. לבסוף, אחסן וכבה את המכשיר בסדר שצוין.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באמצעות פרוטוקול זה נקבע מודל עכברי להרחבת תפר סגיטלי (איור 1-2). לצורך הדמיה תלת-ממדית של שינויים במידול העצם לאחר הרחבת התפרים, יושמה שיטת ניקוי רקמות פגסוס על כל עצמות הקלוואריה לאחר הרחבה. לאחר הזילוח הופרדו עצמות קלווריאלי (איור 3A), והמשיך בתהליך פגסוס המתאים (טבלה 1 וטבלה 2). למרבה הפלא, עצמות קלווריאלי נעשו כמעט שקופות לאחר תהליך פגסוס המלא, ללא קשר לשאלה אם בוצע דה-קלקציה (איור 3B,C).
כדי לדמיין במהירות את השינויים לאחר הרחבה, נעשה שימוש ב- μCT על הדגימות שנאספו וקבועות. בהשוואה לקבוצת הביקורת (איור 4A), תפר הגולגולת התרחב בהדרגה ובאופן משמעותי לאחר הפעלת כוח במשך יום אחד (איור 4B). ביום החמישי הופיעו בליטות גרמיות רכות על קצה העצם (איור 4C).
לצורך הדמיה תלת-ממדית של קצב סמיכות המינרליזציה בתפר כולו לאחר הרחבה, נעשה שימוש בשיטת הסימון הכפול יחד עם טכניקת פגסוס היעילה, אפילו על עצמות קלווריאליות שאינן מסוידות (איור 5). בתנאים פיזיולוגיים, היו שינויים קלים בין אותות התיוג לפני כן (איור 5A), בעוד שהעמסת כוח הפעילה באופן משמעותי אוסטאוגנזה. תבנית הזיגזג של עצם חדשה שעברה מינרליזציה, המסומנת בטוש סידן צהוב-ירוק יחיד, התרחבה לאחר שהתרחבה במשך 7 ימים (איור 5B,C). בהדמיה תלת-ממדית ברזולוציה גבוהה, שינויי הדפוס של עצמות השוליים הצביעו על תהליך עיצוב מחדש של העצם לאחר הרחבת התפרים, ומידת העצם החדשה שנוצרה השתנתה בשני צידי התפרים (איור 5C).
יתר על כן, כדי להמחיש את קצב ההתרבות של תאים עם הרחבת התפרים, נעשה ניסיון לשלב EdU שלם באמצעות שיטת ניקוי רקמות פגסוס עם תהליך הסתיידות. בהצלחה, התיוג היה יעיל ונשמר היטב ברקמות מנוקות. בקבוצת הביקורת, מספר תאי EdU+ פוזרו באופן מפוזר לאורך התפרים (איור 6A), מה שעשוי להיות חשוב לעיצוב מחדש פיזיולוגי של העצם, ואולי להתעלם ממנו בחתך דו-ממדי. לאחר שהתרחבו במשך יום אחד, התאים המתרבים הגיעו לשיאם באמצע ובקצוות התפרים (איור 6B). ככל שהתפר התרחב, מספר התאים המתרבים ירד עם הזמן, והגיע ליום 7 (איור 6C). התאים המודגשים היו תאים עגולים קטנים במח העצם, מה שמצביע על תאי דם, שהיו שונים מתאי התפר EdU+ (איור 6C).
איור 1: הוכנו חומרים חיוניים לניתוח. מחזיקי השמירה היו עשויים חוטי נירוסטה. קוטרם היה 2 מ"מ, וזנבות 1 מ"מ היו שמורים משני צדדים (A). קפיץ הלחץ בקוטר חוט 0.2 מ"מ, קוטר חיצוני 1.5 מ"מ, שטח מרווח 1 מ"מ הוחל (B). כוח המתיחה זוהה על ידי דינמטר (C,D). כל דחיסת קפיץ של 1 מ"מ קיבלה דחף של כ-30 גרם (E) בניסוי זה. פיסות נייר נחתכו לצורה של עפיפונים בקוטר 2 מ"מ לשימוש כמחסומים (F). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: התהליך הכירורגי של מודל עכבר מתרחב תפרים. לאחר היפוך דש הקלורי, נעשו תחריט חומצה (A) וכן הדבקה (B) במיקום שבו ייחשפו מחזיקי השמירה. לאחר איפוס דש הקרקפת (C), המחזיקים נחשפו במיקום המסומן (D). קפיץ נקבע בין שני מחזיקים כדי להפעיל כוח התפשטות על התפר הקלוריאלי, ושתי פיסות נייר נקבעו בשני קצות הקפיץ כמחסומים (E,F) לאחר שאושר כי המחזיקים מלוכדים היטב. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הליך ניקוי רקמות פגסוס יושם עבור שתי עצמות קלווריאליות עם או בלי הסתיידות. לאחר הזילוח הופרדו עצמות קלווריאליות, וחוברו אליהן כמה רקמות רכות ומוכתמות בדם (A). עצמות קלווריאליות שחוו את תהליך ההסתיידות (B) או עם אי-הסתיידות (C) היו שקופות כמעט לחלוטין לאחר כל התהליך של פגסוס. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: התפרים הקלוואריאליים התרחבו בהדרגה לאחר הפעלת כוח מתיחה. תמונות μCT של תפר קשת ללא העמסת כוח (A) ולאחר העמסת כוח במשך יום אחד ו -5 ימים (B,C). סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. Exp = הרחבה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: אוסטאוגנזה המופעלת לאחר הרחבת התפר בתמונות תלת-ממדיות. (A-C) הדמיה תלת מימדית של תפרים סגיטליים בעלי תווית כפולה שסולקו בשיטת פגסוס. אדום אליזרין וירוק קלצין הוזרקו תוך צפקית במהלך הלילה לפני ההתפשטות ולפני המתת חסד לאחר התרחבות במשך 7 ימים (B,C), בהתאמה, בהשוואה לקבוצת הביקורת ללא עומס מכני באותן נקודות זמן (A). עדשת 5x שימשה לרכישת כל תמונות התפר ביעילות (A,B), ותמונת הקופסה ב-(B) הוגדלה ב-(C, C', C'') שצולמה בעדשת 10x. סרגל קנה מידה ב- A,B: 100 מיקרומטר, C: 150 מיקרומטר. Exp = הרחבה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: תאי תפר התרבו מאוד בהעמסת כוח מתיחה בתמונות תלת-ממדיות. מבחני שילוב של הרכבה שלמה בשילוב עם שיטת ניקוי הרקמה של פגסוס הציגו את התאים המתרבים בתפר כולו כאשר הם נמצאים בשקט (A) או לאחר העמסת כוח במשך יום אחד ו-7 ימים (B,C). מצולם עם עדשת 10x. קווי מקף מתארים שני קצוות לתפרי קשת. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. Exp = הרחבה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| תהליכים | פתרונות | זמן וטמפרטורה |
| 1. הזרקה intraperitoneal | 1 מ"ג/10 גרם EdU | שעתיים לפני המתת העכברים |
| 2. זילוח | 0.02% הפרין & 0.05 mol/L EDTA | / |
| 3. קיבעון | 4% PFA | O/N, 4°C |
| 4. הסתיידות | 10% EDTA | 2 ימים, 37 °C |
| 5. דה-קולוריזציה | 25% קוואדרול | יום אחד, 37 °C (77 °F) |
| 6. צביעת EdU | קוקטייל תיוג | יום אחד, RT |
| 7. הסרת שומנים | 30% טרט-בוטאנול | 2 שעות, 37 °C |
| 50% טרט-בוטאנול | 2 שעות, 37 °C | |
| 70% טרט-בוטנול | 2 שעות, 37 °C | |
| 8. התייבשות | פתרון TB-PEG | 3 שעות * 2, 37 ° צלזיוס |
| 9. סליקה | פתרון BB-PEG | 2 שעות, 37 °C |
טבלה 1: הליך ניקוי רקמות פגסוס לעצמות קלוואריאליות עם צביעת EdU.
| תהליכים | פתרונות | זמן וטמפרטורה |
| 1. הזרקה intraperitoneal | 20 מ"ג/ק"ג אדום אליזארין | לילה לפני הרחבה |
| 2. הזרקה intraperitoneal | 5 מ"ג/ק"ג קלצאין | לילה לפני האיסוף |
| 3. זילוח | 0.02% הפרין & 0.05 mol/L EDTA | / |
| 4. קיבעון | 4% PFA | O/N, 4°C |
| 5. דה-קולוריזציה | 25% קוואדרול | יום אחד, 37 °C (77 °F) |
טבלה 2: הליך ניקוי רקמות פגסוס עבור עצמות קלווריאליות עם תיוג כפול של עצמות מינרליות על ידי ירוק קלצין ואדום אליזרין.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
יישמנו מודל סטנדרטי של עכבר הרחבת תפר כדי לבחון את השינויים המורפולוגיים הקבועים המתרחשים מדי שבוע במהלך כל מחזור השיפוץ בן החודש10. מודל זה שימושי לחקר עיצוב מחדש והתחדשות עצם קלווריאלית על ידי הרחבת תפרים קלווריאליים, כמו גם לחקר תאי תפר שונים in vivo. כדי להציג באופן מלא את התוצאות של מחקר כזה, הדמיה תלת מימדית של רקמות מוכתמות נדרש. לכן, טכנולוגיית פגסוס, הידועה ביעילותה בפינוי רקמות קשות19,20, שולבה עם תיוג כפול וצביעה של EdU כדי לחשוף קצבי מינרליזציה מורחבים ותאים מתרבים בתהליך ההתפשטות.
לגבי ניתוח הרחבת תפרים, אחד השלבים המרכזיים הוא חיבור טבעת התומך. כדי להבטיח קשר יציב עם משטח העצם, תיקננו את תהליך החריטה וההדבקה של חומצה בתחתית טבעת התומך. הלולאות הקטנות על טבעת התמך צריכות להיות בניצב לפני השטח של העצם ולהתאים לחורים קטנים בקרקפת. לאחר תפירת הקרקפת, יש לחשוף את הלולאות הקטנות לפני העור דרך חורים קטנים במצב טבעי ומאוזן כדי למנוע את קריסת טבעת השימור במהלך התקנת הקפיץ וחוט ההנחיה המופעלים בכוח, מה שעלול להוביל לכישלון הניתוח. בנוסף, בחירת קפיץ מתאים להפעלת כוח חיונית לניתוח מוצלח, שכן היא מקלה על התקנת הקפיץ תוך מניעת נפילת טבעת האחיזה והשגת הפעלת הכוח המיועדת.
בהשוואה לדגמים קודמים, מודל זה מציע מספר יתרונות. ראשית, הוא מונע היווצרות פגמים עצם עגולים בעצם הקודקוד, שמירה על מצב הפעלת התא. יתר על כן, ניתן להסיר את הכוח בכל עת על ידי פירוק הקפיץ, מה שהופך אותו מתאים לביסוס מודל הישנות לאחר מתיחת מאמץ. הנוחות של פירוק הקפיץ מבטיחה גם נזק משני מינימלי לחיות הניסוי. יתר על כן, ניתן לכוונן בקלות את הגודל המכני של לחץ המתיחה על ידי שינוי כוח הקפיץ. חשוב לציין כי מודל זה שומר על הסביבה הפיזיולוגית הטבעית סביב תפר הגולגולת, ובכך מבטיח את דיוק תוצאות הניסוי.
עם זאת, ישנן כמה מגבלות למודל הרחבה זה. ראשית, קיים סיכון שטבעת השמירה תיפול אם הכוח מוגזם. טירונים צריכים לבצע תרגילים מקדימים בהתקנת האביב כדי להפחית את הסיכון הזה. שנית, קיים סיכון לזיהום בעת פתיחת הקרקפת וחשיפת הגולגולת, ולכן חיטוי מכשירים הוא חיוני, וקיצור משך הניתוח מועיל לריפוי. הרדמת יתר עלולה גם להוביל למוות של עכברים.
לגבי שיטת פגסוס פסיבית, היא ישימה להשגת שקיפות ברקמות ואיברים בודדים, כמו גם בכל הראש והגוף של עכברים צעירים. בעוד יעיל עבור עצמות קלוריות שלמות, זמן עיבוד ארוך יותר נדרש עבור דגימות גדולות יותר, במיוחד עבור רקמות עצם שלמות או רקמות עצם ארוכות בתפזורת עם מפרקים. חשוב לציין כי אין לבצע הסתיידות רקמות בעת שימוש בפרוטוקול התיוג הכפול, שכן הוא מפריע לתהליך הצביעה. שיטת ניקוי הרקמה של פגסוס גמישה אף היא, ומאפשרת שילוב עם שיטות תיוג שונות, לא רק שילוב EdU או תיוג כפול של סידן, אלא גם פלואורסצנטיות אנדוגנית במודלים של עכברים טרנסגניים או צביעת צבע או נוגדנים בהרכבה שלמה, והכל עם פלואורסצנטיות שמורה היטב.
עם השפעות יציבות וחזרתיות גבוהה, מודל הרחבת תפר זה מתאים לזנים שונים של עכברים טרנסגניים בגילאים שונים. היכולת להתאים את עוצמת הלחץ המתיחה וכוח הנסיגה בכל עת מאפשרת מחקר נוח על הישנות לאחר גירוי מתח. על ידי שילוב שיטת הסימון הכפול של עצמות מינרליות עם טכניקת ניקוי רקמות פגסוס, אנו יכולים לצפות בפיזור המרחבי-זמני התלת-ממדי של תאי גזע בתפר גולגולתי במהלך עיצוב מחדש של העצם, מה שמאפשר חקירה נוספת של הקשר בין SUSCs ומתח מכני, כמו גם המנגנונים הספציפיים שלו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים על פלטפורמת המעבדה והסיוע של מכון האוזן, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת ג'יאוטונג בשנחאי. עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית שנחאי פוג'יאנג (22PJ1409200); הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס '11932012); קרן המחקר המדעי לפוסט-דוקטורט של בית החולים העממי התשיעי בשנחאי, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת ג'יאו טונג בשנחאי; מימון תוכנית מחקר בסיסית של בית החולים העממי התשיעי המסונף לבית הספר לרפואה של אוניברסיטת ג'יאו טונג בשנגחאי (JYZZ154).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37% Acid etching | Xihubiom | E10-02/1807011 | |
| Alizarin red | Sigma-Aldrich | A3882 | |
| AUSTRALIAN WIRE | A.J.WILCOCK | 0.014'' | |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | B6630 | |
| Calcein green | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Copper(II) sulfate, anhydrous | Sangon Biotech | A603008 | |
| Dynamometer | Sanliang | SF-10N | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| EdU | Invitrogen | E104152 | |
| Laser Confocal Microscope | Leica | SP8 | |
| PBS | Sangon Biotech | E607008 | |
| PEG-MMA 500 | Sigma-Aldrich | 447943 | |
| PFA | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| pH Meters | Mettler Toledo | S220 | |
| Quadrol | Sigma-Aldrich | 122262 | |
| Sodium Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| Sodium bicarbonate | Sangon Biotech | A500873 | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A610476 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Spring | TAOBAO | 0.2*1.5*1*7 | |
| Sulfo-Cyanine3 azide | Lumiprobe | A1330 | |
| tert-Butanol | Sigma-Aldrich | 360538 | Protect from light. Do not freeze. |
| Transbond MIP Moisture Insensitive Primer |
3M Unitek | 712-025 | |
| Transbond XT Light Cure Adhesive Paste |
3M Unitek | 712-035 | |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | V900257 | |
| Tris-buffered saline | Sangon Biotech | A500027 |
References
- Opperman, L. A. Cranial sutures as intramembranous bone growth sites. Developmental Dynamics. 219 (4), 472-485 (2000).
- Thenier-Villa, J. L., Sanromán-Álvarez, P., Miranda-Lloret, P., Plaza Ramírez, M. E. Incomplete reossification after craniosynostosis surgery-incidence and analysis of risk factors: a clinical-radiological assessment study. Journal Of Neurosurgery-pediatrics. 22 (2), 120-127 (2018).
- Markiewicz, M. R., Recker, M. J., Reynolds, R. M. Management of sagittal and lambdoid craniosynostosis: open cranial vault expansion and remodeling. Oral And Maxillofacial Surgery Clinics Of North America. 34 (3), 395-419 (2022).
- Mao, J. J., Wang, X., Kopher, R. A. Biomechanics of craniofacial sutures: orthopedic implications. Angle Orthodontist. 73 (2), 128-135 (2003).
- Shayani, A., Sandoval Vidal, P., Garay Carrasco, I., Merino Gerlach, M. Midpalatal suture maturation method for the assessment of maturation before maxillary expansion: a systematic review. Diagnostics (Basel). 12 (11), 2774 (2022).
- Suzuki, H., et al. Miniscrew-assisted rapid palatal expander (MARPE): the quest for pure orthopedic movement. Dental Press Journal Of Orthodontics. 21 (4), 17-23 (2016).
- Yu, M., et al. Cranial suture regeneration mitigates skull and neurocognitive defects in craniosynostosis. Cell. 184 (1), 243-256 (2021).
- Roth, D. M., Souter, K., Graf, D. Craniofacial sutures: Signaling centres integrating mechanosensation, cell signaling, and cell differentiation. European Journal of Cell Biology. 101 (3), 151258 (2022).
- Zhao, H., et al. The suture provides a niche for mesenchymal stem cells of craniofacial bones. Nature Cell Biology. 17 (4), 386-396 (2015).
- Jing, D., et al. Response of Gli1(+) suture stem cells to mechanical force upon suture expansion. Journal of Bone And Mineral Research. 37 (7), 1307-1320 (2022).
- Xu, Y., Malladi, P., Chiou, M., Longaker, M. T. Isolation and characterization of posterofrontal/sagittal suture mesenchymal cells in vitro. Plastic and Reconstructive Surgery. 119 (3), 819-829 (2007).
- Kong, L., et al. Isolation and characterization of human suture mesenchymal stem cells in vitro. International Journal of Stem Cells. 13 (3), 377-385 (2020).
- Ikegame, M., et al. Tensile stress induces bone morphogenetic protein 4 in preosteoblastic and fibroblastic cells, which later differentiate into osteoblasts leading to osteogenesis in the mouse calvariae in organ culture. Journal of Bone And Mineral Research. 16 (1), 24-32 (2001).
- Liu, S. S., Opperman, L. A., Buschang, P. H. Effects of recombinant human bone morphogenetic protein-2 on midsagittal sutural bone formation during expansion. American Journal of Orthodontics And Dentofacialorthopedics. 136 (6), 768-769 (2009).
- Liang, W., Ding, P., Li, G., Lu, E., Zhao, Z. Hydroxyapatite nanoparticles facilitate osteoblast differentiation and bone formation within sagittal suture during expansion in rats. Drug Design Development and Therapy. 15, 905-917 (2021).
- Morinobu, M., et al. Osteopontin expression in osteoblasts and osteocytes during bone formation under mechanical stress in the calvarial suture in vivo. Journal of Bone And Mineral Research. 18 (9), 1706-1715 (2003).
- Hwang, S., Chung, C. J., Choi, Y. J., Kim, T., Kim, K. H. The effect of cetirizine, a histamine 1 receptor antagonist, on bone remodeling after calvarial suture expansion. Korean Journal of Orthodontics. 50 (1), 42-51 (2020).
- Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).
- Jing, D., et al. Tissue clearing and its application to bone and dental tissues. Journal of Dental Research. 98 (6), 621-631 (2019).
- Luo, W., et al. Investigation of postnatal craniofacial bone development with tissue clearing-based three-dimensional imaging. Stem Cells Development. 28 (19), 1310-1321 (2019).
