Summary
Denne protokol præsenterer en standardiseret suturudvidelsesmusemodel og en 3D-visualiseringsmetode til at studere de mekanobiologiske ændringer af sutur og knoglemodellering under trækkraftbelastning.
Abstract
Kraniofaciale suturer spiller en afgørende rolle ud over at være fibrøse led, der forbinder kraniofaciale knogler; De tjener også som den primære niche for calvarial og facial knoglevækst, der huser mesenkymale stamceller og osteoprogenitorer. Da de fleste kraniofaciale knogler udvikler sig gennem intramembranøs ossifikation, fungerer suturernes marginale regioner som initieringspunkter. På grund af denne betydning er disse suturer blevet spændende mål i ortopædiske terapier som fjederassisteret kraniehvelvudvidelse, hurtig maksillær ekspansion og maksillær protraktion. Under ortopædisk sporingskraft aktiveres suturstamceller hurtigt og bliver en dynamisk kilde til knoglemodellering under ekspansion. På trods af deres betydning forbliver de fysiologiske ændringer under knoglemodelleringsperioder dårligt forstået. Traditionelle sektioneringsmetoder, primært i sagittal retning, fanger ikke de omfattende ændringer, der forekommer gennem hele suturen. Denne undersøgelse etablerede en standard musemodel for sagittal suturudvidelse. For fuldt ud at visualisere knoglemodelleringsændringer efter suturudvidelse blev PEGASOS-vævsrensningsmetoden kombineret med helmonteret EdU-farvning og calciumchelaterende dobbeltmærkning. Dette muliggjorde visualisering af stærkt prolifererende celler og ny knogledannelse på tværs af hele calvariale knogler efter ekspansion. Denne protokol tilbyder en standardiseret suturudvidelsesmusemodel og en 3D-visualiseringsmetode, der kaster lys over de mekanobiologiske ændringer i suturer og knoglemodellering under trækkraftbelastning.
Introduction
Kraniofacial suturer er fibrøst væv, der forbinder kraniofaciale knogler og spiller vigtige roller i vækst og ombygning af kraniofaciale knogler. Suturens struktur ligner en flod, der giver en strøm af celleressourcer til at nære og opbygge "flodbredden", kendt som de osteogene fronter, som bidrager til dannelsen af kraniofaciale knogler via intramembranøs osteogenese1.
Interessen for kraniofaciale suturer har været drevet af kliniske behov for at forstå for tidlig lukning af kraniesuturer og ansigtssuturdysfunktion, hvilket kan føre til kraniofaciale deformiteter og endda livstruende tilstande hos børn. Åben suturektomi anvendes rutinemæssigt i klinisk behandling, men langvarig opfølgning har vist ufuldstændig re-ossifikation tilbagefald hos nogle patienter2. Minimalt invasiv kraniotomi assisteret af ekspansionsfjedre eller endoskopisk stribe kraniektomi kan give en sikrere tilgang til at bevare den potentielle sutur snarere end at kassere vævene3. Tilsvarende har ortopædiske terapier såsom ansigtsmasker og ekspansionsapparater været meget udbredt til behandling af sagittal eller vandret maksillær hypoplasi, hvor nogle undersøgelser udvider aldersbegrænsningen til behandling af voksne patienter via miniscrew-assisterede palatale ekspandere 4,5,6. Derudover er kranial suturregenerering med mesenkymale stamceller (MSC'er) kombineret med biologisk nedbrydelige materialer en potentiel terapi i fremtiden, der tilbyder en ny retning for behandling af relaterede sygdomme7. Imidlertid forbliver funktionsprocessen eller reguleringsmekanismen for suturer undvigende.
Knoglemodellering består hovedsageligt af en balance mellem knogledannelse udført af osteoblaster og knogleresorption udført af osteoklaster, hvor osteogen differentiering af stamceller stimuleret af mekaniske signaler spiller en vigtig rolle. Efter årtiers forskning har det vist sig, at kraniofaciale suturer er meget plastiske mesenkymale stamcellenicher8. Suturstamceller (SuSC'er) er en heterogen gruppe af stamceller, der tilhører mesenkymale stamceller (MSC'er) eller knoglestamceller (SSC'er). SuSC'er er mærket in vivo med fire markører, herunder Gli1, Axin2, Prrx1 og Ctsk. Især Gli1+ SuSC'er har nøje verificeret stamcellernes biologiske egenskaber og udviser ikke kun høj ekspression af typiske MSC-markører, men viser også fremragende osteogent og kondrogent potentiale9. Tidligere forskning har vist, at Gli1+ SuSC'er aktivt bidrager til ny knogledannelse under trækkraft og identificerer dem som suturstamcellekilden, der understøtter distraktionsosteogenese10.
Tidligere blev omfattende mekaniske egenskaber ved stamceller undersøgt in vitro via Flexcell, firepunktsbøjning, mikromagnetbelastningssystem og andre. Selvom mesenkymale celler afledt af mus er blevet identificeret in vitro11, og humane suturmesenkymale stamceller også er blevet isoleret for nylig12, forbliver suturcellernes biomekaniske respons uklar i in vitro-systemet. For yderligere at undersøge knoglemodelleringsprocessen er der etableret en suturudvidelsesmodel baseret på isoleret calvaria-organkultur, hvilket baner vejen for etablering af en nyttig in vivo-suturudvidelsesmodel 1,13. Kaniner14 og rotter15 har været de mest anvendte dyr i grundforskning til suturudvidelse. Imidlertid er mus foretrukne dyremodeller til at udforske menneskelig sygdom på grund af deres meget homologe genom med mennesker, adskillige genmodifikationslinjer og stærk reproduktiv hybridiseringsevne. Eksisterende musemodeller af kranial suturudvidelse er typisk afhængige af ortodontiske fjedertråde i rustfrit stål for at påføre trækkraft på sagittalsuturen 16,17. I disse modeller er der lavet to huller i hver side af parietalbenene for at fastgøre ekspansionsanordningen, og ledningerne er indlejret under huden, hvilket kan påvirke celleaktiveringstilstanden.
Med hensyn til visualiseringsmetoden er den todimensionelle observation af skiver i sagittal retning generelt blevet vedtaget i årtier. I betragtning af at knoglemodellering er en kompleks tredimensionel dynamisk proces, er opnåelse af komplet tredimensionel information imidlertid blevet et presserende behov. PEGASOS-vævsgennemsigtighedsteknikken opfyldte dette krav18,19. Det giver unikke fordele for gennemsigtigheden af hårdt og blødt væv, hvilket gør det muligt at reproducere den komplette knoglemodelleringsproces i tredimensionelt rum.
For at få en dybere og mere omfattende forståelse af de fysiologiske ændringer i knogleremodelleringsperioderne blev der etableret en standard sagittal suturudvidelsesmusemodel med en fjederindstilling mellem de håndlavede holdere10. Med en standardiseret syreætsnings- og bindingsprocedure kunne ekspansionsanordningen være fast bundet til kraniebenet og generere en trækkraft vinkelret på sagittalsuturen. Desuden blev PEGASOS-vævsrensningsmetoden anvendt efter dobbeltmærkning af den mineraliserede knogle efter ekspansion for fuldt ud at visualisere knoglemodelleringsændringerne efter suturudvidelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle procedurer, der er beskrevet her, blev godkendt af Animal Care Committee of Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (SH9H-2023-A616-SB). 4 uger gamle C57BL/6 hanmus blev anvendt i denne undersøgelse. Alle de anvendte instrumenter blev steriliseret før proceduren.
1. Forberedelse af suturudvidelsesmodellen
- Forberedelse af to retentionsindehavere.
- Brug 0,014 '' australsk tråd eller rustfrit ståltråd (se materialetabel) til at lave en spiralformet løkke med let trådtang. Sløjfens diameter er 2 mm, og 1 mm hale er reserveret på to sider (figur 1A).
- Steriliser ledningerne og holderne til operationen i en autoklave, plasmasterilisator eller egnet koldsterilant (f.eks. Glutaraldehyd).
- Forberedelse af fjedrene.
- Forbered tilpassede fjedre i rustfrit stål.
BEMÆRK: Trykfjederen med 0,2 mm tråddiameter, 1,5 mm udvendig diameter, 1 mm intervalrum og 7 mm længde anvendes i denne undersøgelse (figur 1B). Hver 1 mm fjederkompression opnåede et tryk på ca. 30 g. - Skær fjederen i en tilgængelig længde, før den sættes. Bekræft kraften for den specialiserede fjeder før eksperimentet.
BEMÆRK: Størrelsen af fjedre varieres, så længe kraftstørrelsen er den samme i parallelle eksperimenter. Kraften måles ved hjælp af et uniaxialt testinstrument på bordpladen eller et lille elektronisk dynamometer (se materialetabellen), hvis tilstanden er begrænset. Længdeændringen evalueres til kraftstørrelsen (figur 1C-E). Især er det nødvendigt at ændre fjederkraftbelastningsværdien baseret på musens alder, knogletilstand og forskningsobjekterne. - Forbered en lige australsk tråd eller lige ståltråd på 7 mm længde, og lav to stykker papir med 2 mm diametre til brug som barrierer (figur 1F).
- Forbered tilpassede fjedre i rustfrit stål.
2. Sagittal sutur ekspansion kirurgi
- Anæstetisering: Bedøv musene med tiletamin (25 mg / kg), zolazepam (25 mg / kg) og xylazin (10 mg / kg). På samme tid påføres steril oftalmisk salve til øjnene for at forhindre tørring af hornhinderne. Bedøm dybden af musenes anæstesi via en tåklemme.
BEMÆRK: Følgende egenskaber indikerer, at musen er bedøvet korrekt: langsom og stabil vejrtrækning, svaghed i lemmer, muskelafslapning, forsvinden af hudakupunkturrefleks og øjenlågsrefleks samt svagere hornhinderefleks. - Pelsfjernelse og desinfektion: Fjern forsigtigt pelsen på toppen af hovedet med hårfjerningscreme; Undgå at røre øjnene. Kort efter skal du bruge skiftende runder af iodophor og 75% alkohol til at desinficere det kirurgiske sted. Meloxicam (1 mg/kg) administreres som analgesi til musene ved subkutan injektion.
- Kropspositionsfiksering: Sæt musen liggende på forsiden og brug kirurgiske bånd til at fastgøre lemmerne på operationsbordet.
- Åben hovedbundsklap: Brug kirurgisk saks til at udføre en bueformet klap langs hovedbunden nær musens hals, hvilket fuldt ud udsætter sagittal sutur og omgivende kranium. Derefter fastgøres hovedbundsklappen med en 6-0 sutur på operationsbordet.
- Bind retentionsholderne efter syreætsning.
- Tør kraniet og æts det med 37% fosforsyre i 20 sekunder, og brug normalt saltvand til at rense syreætsningen (figur 2A). En kalkholdig rest vil være tydelig efter tørring af kraniet med gummipipettepæren.
- De to holdere (fremstillet i trin 1.1) cementeres på begge sider af parietalbenene 3 mm fra sagittalsuturerne med et lyshærdet klæbemiddel (figur 2B).
- Nulstil hovedbundsklappen.
- Sæt hovedbundsklappen manuelt tilbage (figur 2C). Mærk holderens position, skær to små huller i hovedbunden i den tilsvarende position af de bilaterale retentionsholdere, og nulstil derefter den blappede hovedbund.
- Før samtidig de små løkker gennem hullerne for at udsætte hudens overflade. Sutur det buede snit med en 6-0 sutur (figur 2D). En til tre dage er tilladt til hudgendannelse. Administrer meloxicam (1 mg/kg) til musene ved subkutan injektion hver 24. time i 1 til 3 dage.
BEMÆRK: Efter operationen skal du dagligt kontrollere aktiviteten i musens hovedbund, og om holderne falder af. Der er forskellige hudtyper med hensyn til farve og tykkelse; Den sunde hudbund bevarer den oprindelige farve, og hudkanterne smelter gradvist sammen efter suturering. Hvis der findes en infektion i hovedbunden, eller hvis den kirurgiske enhed er faldet af, skal du fjerne musen fra undersøgelsen og aflive den.
- Installer fjederen og styretråden.
- Skær fjederen 1 mm længere end afstanden mellem de to holdere.
- Komprimer den valgte trykfjeder og placer den mellem de små spoler på begge sider.
- Før den rustfrie ståltråd gennem de små spoler og fjederen, og slip fjederen for at opnå et starttryk på ca. 30 g.
- Kontroller, at hovedbunden under musens fjederområde er uden kompression.
- Efter at have bekræftet, at limningen er fast uden løshed, bindes to papirlapper mellem fjederen og holderne med et lyshærdet klæbemiddel for at sætte barrierer i begge ender af fjederen (figur 2E, F).
3. Dobbelt mærkning af mineraliserede knogler
- Fremstilling af stamopløsningen.
- Der fremstilles en fortyndingsopløsning med destilleret vand, der indeholder 0,9 % NaCl og 2 % NaHCO3.
- Brug fortyndingsopløsningen til at fremstille 20 mg/ml Alizarinkompleksdihydrat og 10 mg/ml Calcein (se materialetabel).
- Juster pH til 7,4 ved hjælp af en pH-måleenhed. Skyl pH-sonden mellem målingerne for at sikre nøjagtige aflæsninger.
- Anbring farvestoffet i en steril beholder og opbevar det i køleskab ved 4 °C; Folie bruges til at holde lyset ude.
- Forbered arbejdsløsningen. Før injektion fortyndes stamopløsningen til 1 mg/ml calcium og 2 mg/ml for Alizarinkompleksdihydrat ved hjælp af en opløsningsopløsning.
- Intraperitonealt injicere 5 mg / kg Calcein grøn og 20 mg / kg Alizarin rød på to tidspunkter for at mærke de mineraliserede knogler og analysere ændringerne mellem to gange. Generelt indsamles prøverne 12-14 timer efter injektion.
BEMÆRK: Opvarm farvestofferne før injektion, og sørg for, at injektionstiden ikke er mindre end 3 minutter. Injektionsintervallet afhænger af ekspansionstidspunktet. I denne undersøgelse blev Alizarinrød og Calceingrøn injiceret natten over (O/N) før henholdsvis ekspansion og O/N før indsamling. - Saml hele calvariale knogler forberedt til vævsrensningsprocedure en dag efter den anden injektion.
4. EdU-farvning
- Intraperitoneal injektion: Intraperitonealt injicer EdU 2 timer før aflivning af musene (efter institutionelt godkendte protokoller). Dosis er 1 mg/10 g legemsvægt.
- Mærkning af cocktailpræparat: Bland Tris-bufret saltvand (100 mmol / L endelig, pH 7,6), CuSO4 (4 mmol / L endelig), Sulfo-cyanin 3 azid (2-5 mmol / L endelig) og natriumascorbat (100 mmol / L endelig, lavet frisk hver brug) (se tabel over materialer).
- EdU helmonteret farvning: Efter vævsaffarvningstrinnet i PEGASOS-vævsrensningsmetoden (trin 7) sættes prøver i mærkningscocktailen i 1 dag ved stuetemperatur (RT).
5. Mikrocomputertomografibilleddannelse
- Vævsfiksering og opbevaring: Fastgør de calvariale knogler i 4% paraformaldehyd (PFA) ved 4 °C O/N og opbevar dem i 0,5% PFA før scanning.
- Scanning og analyse: Scan prøverne med et mikrocomputertomografi (μCT) billeddannelsessystem med høj opløsning og en voxelstørrelse på 7 μm.
6. Udarbejdelse af arbejdsløsning til rensning af PEGASOS-væv
- 4% polyformaldehyd (PFA): 4 g PFA-pulver opløses i 1× PBS til 100 ml.
- Hjerteperfusionsopløsning: 0,02% heparin, det vil sige 20 mg heparinpulver opløst i 1× PBS til 100 ml; alternativt anvendes 0,05 mol / L EDTA, det vil sige 0,05 mol ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) (se materialetabel), opløst i en deioniseret vandig opløsning til et samlet volumen på 1 liter.
- Afkalkningsopløsning: 0,5 mol / l EDTA, det vil sige 0,5 mol ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA), opløst i en deioniseret vandig opløsning til et samlet volumen på 1 liter.
- Affarvningsopløsning: 25% quadrol, som er 250 ml quadrol (N, N, N', N' - Tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylendiamin) (se tabel over materialer) opløst i deioniseret vand til et samlet volumen på 1 L.
BEMÆRK: På grund af Quadrols viskositet kan den opvarmes til 60 °C for at øge dens fluiditet før konfiguration. - Affedtningsopløsning: 30%, 50%, 70% tert-butanol (tB) (se materialetabel), fremstillet med vand efter volumenfraktion.
BEMÆRK: Da ren tB er krystallinsk ved stuetemperatur, skal den opvarmes til 60 °C, indtil den opløses, før den kan anvendes. Derefter tilsættes 3% til 5% (v / v) triethanolamin (TEA) for at regulere opløsningens pH >9,5. - Dehydreringsopløsning: TB-PEG-opløsning, 70% tB + 27% PEG-MMA + 3% Quadrol (v / v), hvori PEG-MMA er poly (ethylenglycol) methylethermethacrylat med en gennemsnitlig molekylvægt på 500 (Poly (ethylenglycol) methacrylat 500, PEG-MMA 500) (se materialetabel).
- Gennemsigtig opløsning: BB-PEG-opløsning, 75% BB + 22% PEG-MMA + 3% Quadrol (v / v), hvori BB er benzylbenzoat (BB).
7. Gennemsigtighed af calvariale knogler med PEGASOS-metoden
- Bedøv musen ved intraperitoneal injektion af anæstetika (trin 2.1), og bedøm dybden af anæstesi af musen gennem klemmereaktionen for at sikre, at der ikke er nogen modstandsreaktion før hjerteperfusion.
- Udfør hjerteperfusion og fiksering.
- Hold musens underliv opad, fastgør lemmerne med tape, og skær forsigtigt langs brystkassens omkreds for fuldt ud at udsætte den.
- Umiddelbart efter at have lavet et lille snit i højre atrium med oftalmisk saks, indsæt en perfusion 22 G nål i toppen af venstre ventrikel.
BEMÆRK: Kun nålespidsen indsættes for at undgå at beskadige hjerteklappen ved overdreven indsættelse. Ellers kommer hjerteperfusionsvæske ind i lungecirkulationen, hvilket påvirker perfusionseffekten af den systemiske cirkulation. - Tryk 30-50 ml hjerteperfusionsvæske (trin 6.2) i sprøjten. Det kan ses, at leveren gradvist bliver bleg fra lyse rødt.
- Når udstrømningsvæsken fra højre atrium bliver helt klar, tilsættes 4% PFA-opløsning i lige stor volumen. Drift af PFA-perfusion udføres i en ventileret hætte.
- Væv og organer dissekeres og adskilles, og de fikseres natten over med 4 % PFA ved 4 °C.
- Afkalkning af væv: For prøver, der behandles ved EdU-farvning, anbringes det faste hårde væv i 0,5 mol/l EDTA-opløsning (pH 7,0) (10 ml) i et rystebord ved 37 °C i ca. 2 dage, og væsken skiftes dagligt.
BEMÆRK: Spring afkalkningsprocessen over i den normaliserede PEGASOS-metode til calciumchelateringsmiddel mærket knogler for fuldt ud at bevare signaleringen. Afkalkning er nødvendig for at behandle knoglerne for at visualisere den endogene fluorescens eller helmonterede immunfarvede signaler. - Affarvning af væv: Anbring de faste calvariale knogler i 25% Quadrol-opløsning (20 ml) i et rystebord ved 37 °C i 1 dag, og skift væsken én gang.
BEMÆRK: Affarvningstiden er relateret til hæmindholdet i vævet. Overhold farven på behandlingsvæsken, da farvedybden repræsenterer behovet for at fortsætte væskeudskiftningsbehandlingen. - EdU-farvning: Skyl prøverne i 1× PBS i 5 minutter (tre gange), og nedsænk dem derefter i mærkningscocktailen i 1 dag. Derefter skylles prøverne i 1× PBS i 1 time (tre gange).
- Affedtning og dehydrering af væv
- Vævene anbringes i 30 % tB-, 50 % tB- og 70 % tB-opløsninger i rækkefølge for at opnå gradientfald på et rystebord ved 37 °C. Der anbringes i hver koncentration i ca. 2 timer.
- Derefter dehydreres prøverne i TB-PEG-opløsning i 6 timer på et rystebord ved 37 °C.
BEMÆRK: Ovenstående behandlingstid kan øges eller formindskes afhængigt af vævets antal.
- Vævets gennemsigtighed: Anbring det fuldstændigt dehydrerede væv i BB-PEG-opløsning på et rystebord ved 37 °C (2-4 timer), indtil det er gennemsigtigt. I øjeblikket kan prøver opbevares i op til 1-2 år.
BEMÆRK: Efter næsten fuldstændig rydning skal du åbne rørlåget for at udsætte prøverne og mediet for luft med omrystning vil yderligere forbedre gennemsigtigheden. Denne metode er egnet til at forbedre gennemsigtigheden af individuelle væv og organer samt hele hovedet og kroppen af unge mus. For gennemsigtigheden af hele kroppen af voksne mus skal ovenstående trin imidlertid udføres ved hjælp af en fuldcyklusperfusionsmetode.
8. Billedbehandling
BEMÆRK: Konfokal mikroskopi blev anvendt til 3D-visualisering af gennemsigtigt væv i denne undersøgelse. Lysarkmikroskopi er også passende for denne protokol. Flere operativsystemer er blevet verificeret som tilgængelige før. Her tages et laserkonfokalmikroskopoperativsystem som et eksempel (se materialetabel).
- I henhold til brugervejledningen skal du følge de korrekte trin for at åbne laserkonfokalen og LAS AF-betjeningsgrænsefladen. Tænd for den nødvendige laser i forskellige optagekanaler, og juster strømmen. Indstil den optiske sti og den tilsvarende bølgelængde, 561 nm for Alizarin rød og 488 nm for Calcein grøn, hvoraf enhver bruges til EdU-signalet i henhold til mærkningscocktailen.
- Placer de gennemsigtige prøver i det konkave glas petriskål, der kan bære tykke prøver, indlejringskasser eller selvfremstillede placeringsanordninger såsom vandtæt lim for at nedsænke de gennemsigtige prøver i en gennemsigtig væske.
- Vælg et objektiv med lavt strømforbrug for hurtigt at finde prøven. Lav et overblik over hele det calvariale væv med hurtigscanningsfunktionen, og find interesseområdet for billeddannelse.
- Indstil udgangseffekt, vælg scanningstilstand, og juster først optagekoefficienterne (opløsning, scanningshastighed, zoomfaktor, billedkvalitet, gennemsnitlig baggrundsstøj osv.).
BEMÆRK: Generelt varierer Smart Gain fra 500 til 800 (både signal- og støjændring); Smart Offset er så tæt på 0 som muligt, samtidig med at billedkvaliteten sikres (for at reducere baggrundsstøj). Når PMT-forstærkningen er højere end 800, eller HyD-forstærkningen er større end 100%, og lysstyrken stadig er utilstrækkelig, kan laserintensiteten øges passende, men i princippet jo lavere, jo bedre. - Indstil den aksiale afstand Z-området og Z-trinnet, som bores ned fra den laveste side af den gennemsigtige organisation; Det vil sige, sæt de dybeste og laveste sider.
BEMÆRK: Bekræft klassificeringen og arbejdsafstanden for hvert objektiv. Indstil forsigtigt Z-området, og betjen ikke arbejdsafstanden, der overstiger grænsen for det valgte objektiv. "z-Galvo" kan vælges, når der er behov for finregulering. - Indstil optageparametrene igen, og start optagelsen. Efter færdiggørelsen skal du flette og behandle billederne gennem det multifunktionelle modul. Til sidst opbevares og lukkes instrumentet i den angivne rækkefølge.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjælp af denne protokol er der etableret en musemodel til sagittal suturudvidelse (figur 1-2). Til 3D-visualisering af knoglemodelleringsændringer efter suturudvidelse blev PEGASOS-vævsrensningsmetoden anvendt på hele calvariale knogler efter ekspansion. Efter perfusion blev calvariale knogler adskilt (figur 3A), og den relevante PEGASOS-proces blev fortsat (tabel 1 og tabel 2). Bemærkelsesværdigt nok blev calvariale knogler næsten gennemsigtige efter hele PEGASOS-processen, uanset om afkalkning blev udført (figur 3B, C).
For hurtigt at visualisere ændringerne efter ekspansion blev μCT brugt på de indsamlede og faste prøver. I sammenligning med kontrolgruppen (figur 4A) ekspanderede kraniesuten gradvist og signifikant efter påføring af kraft i 1 dag (figur 4B). Ved den femte dag optrådte fluffy knoglefremspring på knoglekanten (figur 4C).
Til tredimensionel visualisering af mineraliseringssidestillingshastigheden i hele suturen efter ekspansion blev den dobbelte mærkningsmetode anvendt sammen med den effektive PEGASOS-teknik, selv på ikke-afkalkede calvariale knogler (figur 5). Under fysiologiske forhold var der mindre ændringer mellem forudgående mærkningssignaler (figur 5A), mens kraftbelastning signifikant aktiverede osteogenese. Zigzagmønsteret af nyligt mineraliseret knogle, mærket med en enkelt calcium gulgrøn markør, udvidet efter udvidelse i 7 dage (figur 5B, C). I tredimensionel visualisering med høj opløsning indikerede mønsterændringerne af marginale knogler knoglemodelleringsprocessen efter suturudvidelse, og graden af nydannet knogle varierede på to sider af suturerne (figur 5C).
For at visualisere cellernes spredningshastighed ved suturudvidelse blev helmonteret EdU-inkorporering forsøgt ved hjælp af PEGASOS-vævsrensningsmetoden med en forkalkningsproces. Succesfuldt var mærkningen effektiv og velbevaret i ryddet væv. I kontrolgruppen blev flere EdU + celler diffust fordelt gennem suturerne (figur 6A), hvilket kan være vigtigt for fysiologisk knoglemodellering og muligvis overset i 2-D sektionering. Efter udvidelse i 1 dag toppede de prolifererende celler i midten og kanterne af suturerne (figur 6B). Da suturen blev udvidet, faldt antallet af prolifererende celler over tid og nåede dag 7 (figur 6C). De fremhævede celler var små runde celler i knoglemarven, hvilket indikerer blodlegemer, som adskilte sig fra EdU + suturcellerne (figur 6C).
Figur 1: Vitale materialer blev forberedt til operation. Fastholdelsesholdere var lavet af rustfrit ståltråd. Deres diametre var 2 mm, og 1 mm haler var reserveret på to sider (A). Trykfjederen med 0,2 mm tråddiameter, 1,5 mm udvendig diameter, 1 mm intervalrum blev påført (B). Trækkraften blev detekteret af et dynameter (C,D). Hver 1 mm fjederkompression opnåede et tryk på ca. 30 g (E) i dette eksperiment. Papirlapper blev skåret i form af drager med 2 mm diametre til brug som barrierer (F). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Den kirurgiske proces for suturudvidende musemodel. Efter at have vendt den kalvariale klap blev syreætsning (A) såvel som binding (B) udført på den position, hvor retentionsholderne ville blive eksponeret. Efter nulstilling af hovedbundsklappen (C) blev holderne eksponeret i den markerede position (D). En fjeder blev sat mellem to holdere for at udøve ekspansionskraft på den kalvariale sutur, og to papirlapper blev fastgjort i begge ender af fjederen som barrierer (E, F) efter at have bekræftet, at holderne var bundet fast. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: PEGASOS-vævsclearingprocedure blev anvendt for to calvariale knogler med eller uden afkalkning. Efter perfusion blev calvariale knogler adskilt, med nogle blodfarvede og bløde væv fastgjort (A). Calvariale knogler, der har oplevet afkalkningsprocessen (B) eller med ikke-afkalkning (C), var næsten fuldstændig gennemsigtige efter hele PEGASOS-processen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Calvariale suturer ekspanderede gradvist efter anstrengelse af trækkraft. μCT-billeder af sagittal sutur uden kraftbelastning (A) og efter kraftbelastning i 1 dag og 5 dage (B,C). Skalabjælke: 100 μm. Exp = udvidelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Osteogenese aktiveret efter suturudvidelse i 3D-billeder. (A-C) Tredimensionel visualisering af dobbeltmærkede sagittale suturer ryddet ved PEGASOS-metoden. Alizarinrød og Calceingrøn blev intraperitonealt injiceret natten over før ekspansion og før aflivning efter udvidelse i henholdsvis 7 dage (B,C) sammenlignet med kontrolgruppen uden mekanisk belastning på samme tidspunkter (A). 5x linse blev brugt til at erhverve hele suturbillederne effektivt (A, B), og boksbilledet i (B) blev forstørret i (C, C ', C '') afbildet med et 10x objektiv. Skalabjælke i A,B: 100 μm, C: 150 μm. Exp = udvidelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Suturceller stærkt spredt ved trækkraftbelastning i 3D-billeder. Helmonterede inkorporeringsassays kombineret med PEGASOS-vævsrensningsmetoden viste de prolifererende celler i hele suturen, når de var i stilhed (A) eller efter kraftbelastning i 1 dag og 7 dage (B,C). Billedet med et 10x objektiv. Bindestreglinjer skitserer to kanter til sagittale suturer. Skalabjælke: 100 μm. Exp = udvidelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Processer | Løsninger | Tid og temperatur |
| 1. Intraperitoneal injektion | 1 mg/10 g EDU | 2 timer før aflivning af musene |
| 2. Perfusion | 0,02% heparin & 0,05 mol / l EDTA | / |
| 3. Fiksering | 4% PFA | O/N, 4 °C |
| 4. Afkalkning | 10% EDTA | 2 dage, 37 °C |
| 5. Affarvning | 25% Quadrol | 1 dag, 37 °C |
| 6. EdU-farvning | mærkning cocktail | 1 dag, RT |
| 7. Affedtning | 30% tert-butanol | 2 timer, 37 °C |
| 50% tert-butanol | 2 timer, 37 °C | |
| 70% tert-butanol | 2 timer, 37 °C | |
| 8. Dehydrering | TB-PEG-opløsning | 3 timer*2, 37 °C |
| 9. Rydning | BB-PEG-opløsning | 2 timer, 37 °C |
Tabel 1: PEGASOS-vævsrensningsprocedure for calvariale knogler med EdU-farvning.
| Processer | Løsninger | Tid og temperatur |
| 1. Intraperitoneal injektion | 20 mg/kg Alizarin rød | natten over før udvidelse |
| 2. Intraperitoneal injektion | 5 mg/kg Calcein | natten over før afhentning |
| 3. Perfusion | 0,02% heparin & 0,05 mol / l EDTA | / |
| 4. Fastgørelse | 4% PFA | O/N, 4 °C |
| 5. Affarvning | 25% Quadrol | 1 dag, 37 °C |
Tabel 2: PEGASOS-vævsrensningsprocedure for calvariale knogler med dobbelt mærkning af mineraliserede knogler med Calcein-grøn og Alizarin-rød.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi anvendte en standard suturudvidelsesmusemodel til at observere de regelmæssige morfologiske ændringer, der opstår hver uge i hele den månedlange ombygningscyklus10. Denne model er nyttig til forskning i calvarial knoglemodellering og regenerering ved at udvide calvariale suturer samt til at studere forskellige suturceller in vivo. For fuldt ud at præsentere resultaterne af sådan forskning er der behov for tredimensionel visualisering af farvede væv. Derfor blev PEGASOS-teknologien, der er kendt for sin effektivitet til at rydde hårdt væv19,20, kombineret med dobbelt mærkning og EdU-farvning for at afsløre udvidede mineraliseringshastigheder og prolifererende celler under udvidelsesprocessen.
Med hensyn til suturekspansionskirurgi er et af de vigtigste trin bindingen af fastholdelsesringen. For at sikre en fast binding til knogleoverfladen standardiserede vi syreætsnings- og bindingsprocessen i bunden af holderringen. De små løkker på holderringen skal være vinkelret på knogleoverfladen og svare til små huller i hovedbunden. Efter suturering af hovedbunden skal de små løkker udsættes for hudoverfladen gennem små huller i en naturlig og afbalanceret tilstand for at undgå, at retentionsringen kollapser under installationen af den kraftpåførende fjeder og styretråd, hvilket kan føre til kirurgisk svigt. Derudover er valg af en passende kraftpåførende fjeder afgørende for en vellykket operation, da det gør installationen af fjederen lettere, samtidig med at retentionsringen forhindres i at falde af og opnå den tilsigtede kraftanvendelse.
Sammenlignet med tidligere modeller tilbyder denne model flere fordele. For det første forhindrer det dannelsen af cirkulære knogledefekter i parietalbenet, idet celleaktiveringstilstanden bevares. Desuden kan kraften fjernes når som helst ved at adskille fjederen, hvilket gør den velegnet til etablering af en gentagelsesmodel efter spændingsstrækning. Bekvemmeligheden ved at adskille fjederen sikrer også minimal sekundær skade på forsøgsdyrene. Desuden kan den mekaniske størrelse af trækspænding let justeres ved at ændre fjederkraften. Det er vigtigt, at denne model opretholder det naturlige fysiologiske miljø omkring kraniesuturen og dermed sikrer nøjagtigheden af eksperimentelle resultater.
Der er dog nogle begrænsninger for denne udvidelsesmodel. For det første er der risiko for, at retentionsringen falder af, hvis kraften er for stor. Nybegyndere bør gennemføre indledende øvelser i foråret installation for at mindske denne risiko. For det andet er der risiko for infektion, når man åbner hovedbunden og udsætter kraniet, så instrumentdesinfektion er afgørende, og forkortelse af operationens varighed er gavnlig for heling. Overbedøvelse kan også føre til musenes død.
Med hensyn til den passive PEGASOS-metode er den anvendelig til at opnå gennemsigtighed i individuelle væv og organer samt hele hovedet og kroppen af unge mus. Mens effektiv for hele calvariale knogler, kræves en længere behandlingstid for større prøver, især for hele knoglevæv eller bulk lange knoglevæv med led. Det er vigtigt at bemærke, at vævsafkalkning ikke bør udføres, når du bruger dobbeltmærkningsprotokollen, da det forstyrrer farvningsprocessen. PEGASOS-vævsrensningsmetoden er også fleksibel, hvilket muliggør kombination med forskellige mærkningsmetoder, ikke begrænset til EdU-inkorporering eller calciumdobbeltmærkning, men også endogen fluorescens i transgene musemodeller eller helmonteret farvestof eller antistoffarvning, alt sammen med velbevaret fluorescens.
Med stabile effekter og høj repeterbarhed er denne suturudvidelsesmodel velegnet til forskellige stammer af transgene mus i forskellige aldre. Evnen til at justere størrelsen af trækspænding og trække kraft til enhver tid muliggør praktisk forskning i gentagelse efter stressstimulering. Ved at kombinere dobbeltmærkningsmetoden for mineraliserede knogler med PEGASOS-vævsrensningsteknikken kan vi observere den tredimensionelle rumlige tidsmæssige fordeling af kraniesuturstamceller under knoglemodellering, hvilket muliggør yderligere udforskning af forholdet mellem SUSC'er og mekanisk stress samt dets specifikke mekanismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker for laboratorieplatformen og hjælp fra Ear Institute, Shanghai Jiaotong University School of Medicine. Dette arbejde blev støttet af Shanghai Pujiang-programmet (22PJ1409200); Kinas nationale naturvidenskabelige fond (nr. 11932012); Postdoktoral videnskabelig forskning Foundation af Shanghai niende folks hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine; Finansiering af grundforskningsprogram af Ninth People's Hospital tilknyttet Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (JYZZ154).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37% Acid etching | Xihubiom | E10-02/1807011 | |
| Alizarin red | Sigma-Aldrich | A3882 | |
| AUSTRALIAN WIRE | A.J.WILCOCK | 0.014'' | |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | B6630 | |
| Calcein green | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Copper(II) sulfate, anhydrous | Sangon Biotech | A603008 | |
| Dynamometer | Sanliang | SF-10N | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| EdU | Invitrogen | E104152 | |
| Laser Confocal Microscope | Leica | SP8 | |
| PBS | Sangon Biotech | E607008 | |
| PEG-MMA 500 | Sigma-Aldrich | 447943 | |
| PFA | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| pH Meters | Mettler Toledo | S220 | |
| Quadrol | Sigma-Aldrich | 122262 | |
| Sodium Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| Sodium bicarbonate | Sangon Biotech | A500873 | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A610476 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Spring | TAOBAO | 0.2*1.5*1*7 | |
| Sulfo-Cyanine3 azide | Lumiprobe | A1330 | |
| tert-Butanol | Sigma-Aldrich | 360538 | Protect from light. Do not freeze. |
| Transbond MIP Moisture Insensitive Primer |
3M Unitek | 712-025 | |
| Transbond XT Light Cure Adhesive Paste |
3M Unitek | 712-035 | |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | V900257 | |
| Tris-buffered saline | Sangon Biotech | A500027 |
References
- Opperman, L. A. Cranial sutures as intramembranous bone growth sites. Developmental Dynamics. 219 (4), 472-485 (2000).
- Thenier-Villa, J. L., Sanromán-Álvarez, P., Miranda-Lloret, P., Plaza Ramírez, M. E. Incomplete reossification after craniosynostosis surgery-incidence and analysis of risk factors: a clinical-radiological assessment study. Journal Of Neurosurgery-pediatrics. 22 (2), 120-127 (2018).
- Markiewicz, M. R., Recker, M. J., Reynolds, R. M. Management of sagittal and lambdoid craniosynostosis: open cranial vault expansion and remodeling. Oral And Maxillofacial Surgery Clinics Of North America. 34 (3), 395-419 (2022).
- Mao, J. J., Wang, X., Kopher, R. A. Biomechanics of craniofacial sutures: orthopedic implications. Angle Orthodontist. 73 (2), 128-135 (2003).
- Shayani, A., Sandoval Vidal, P., Garay Carrasco, I., Merino Gerlach, M. Midpalatal suture maturation method for the assessment of maturation before maxillary expansion: a systematic review. Diagnostics (Basel). 12 (11), 2774 (2022).
- Suzuki, H., et al. Miniscrew-assisted rapid palatal expander (MARPE): the quest for pure orthopedic movement. Dental Press Journal Of Orthodontics. 21 (4), 17-23 (2016).
- Yu, M., et al. Cranial suture regeneration mitigates skull and neurocognitive defects in craniosynostosis. Cell. 184 (1), 243-256 (2021).
- Roth, D. M., Souter, K., Graf, D. Craniofacial sutures: Signaling centres integrating mechanosensation, cell signaling, and cell differentiation. European Journal of Cell Biology. 101 (3), 151258 (2022).
- Zhao, H., et al. The suture provides a niche for mesenchymal stem cells of craniofacial bones. Nature Cell Biology. 17 (4), 386-396 (2015).
- Jing, D., et al. Response of Gli1(+) suture stem cells to mechanical force upon suture expansion. Journal of Bone And Mineral Research. 37 (7), 1307-1320 (2022).
- Xu, Y., Malladi, P., Chiou, M., Longaker, M. T. Isolation and characterization of posterofrontal/sagittal suture mesenchymal cells in vitro. Plastic and Reconstructive Surgery. 119 (3), 819-829 (2007).
- Kong, L., et al. Isolation and characterization of human suture mesenchymal stem cells in vitro. International Journal of Stem Cells. 13 (3), 377-385 (2020).
- Ikegame, M., et al. Tensile stress induces bone morphogenetic protein 4 in preosteoblastic and fibroblastic cells, which later differentiate into osteoblasts leading to osteogenesis in the mouse calvariae in organ culture. Journal of Bone And Mineral Research. 16 (1), 24-32 (2001).
- Liu, S. S., Opperman, L. A., Buschang, P. H. Effects of recombinant human bone morphogenetic protein-2 on midsagittal sutural bone formation during expansion. American Journal of Orthodontics And Dentofacialorthopedics. 136 (6), 768-769 (2009).
- Liang, W., Ding, P., Li, G., Lu, E., Zhao, Z. Hydroxyapatite nanoparticles facilitate osteoblast differentiation and bone formation within sagittal suture during expansion in rats. Drug Design Development and Therapy. 15, 905-917 (2021).
- Morinobu, M., et al. Osteopontin expression in osteoblasts and osteocytes during bone formation under mechanical stress in the calvarial suture in vivo. Journal of Bone And Mineral Research. 18 (9), 1706-1715 (2003).
- Hwang, S., Chung, C. J., Choi, Y. J., Kim, T., Kim, K. H. The effect of cetirizine, a histamine 1 receptor antagonist, on bone remodeling after calvarial suture expansion. Korean Journal of Orthodontics. 50 (1), 42-51 (2020).
- Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).
- Jing, D., et al. Tissue clearing and its application to bone and dental tissues. Journal of Dental Research. 98 (6), 621-631 (2019).
- Luo, W., et al. Investigation of postnatal craniofacial bone development with tissue clearing-based three-dimensional imaging. Stem Cells Development. 28 (19), 1310-1321 (2019).
