Summary
이 프로토콜은 인장력 하중 하에서 봉합사 및 뼈 리모델링의 기계적 생물학적 변화를 연구하기 위해 표준화된 봉합사 확장 마우스 모델과 3D 시각화 방법을 제시합니다.
Abstract
두개안면 봉합사는 두개안면 뼈를 연결하는 섬유성 관절을 넘어 중요한 역할을 합니다. 그들은 또한 종변 및 안면 뼈 성장을 위한 주요 틈새 시장 역할을 하며, 중간엽 줄기 세포와 골전구 세포를 수용합니다. 대부분의 두개안면골은 막내 골화를 통해 발달하기 때문에 봉합사의 가장자리 영역이 시작 지점 역할을 합니다. 이러한 중요성으로 인해 이러한 봉합사는 스프링 보조 두개골 금고 확장, 빠른 상악 확장 및 상악 연장과 같은 정형외과 치료에서 흥미로운 표적이 되었습니다. 정형외과적 추적력에 따라 봉합사 줄기세포가 빠르게 활성화되어 확장 중 뼈 리모델링을 위한 동적 소스가 됩니다. 그 중요성에도 불구하고 뼈 리모델링 기간 동안의 생리학적 변화는 잘 이해되지 않고 있습니다. 주로 시상 방향의 전통적인 절편 방법은 전체 봉합사에서 발생하는 포괄적인 변화를 포착하지 못합니다. 이 연구는 시상 봉합사 확장을 위한 표준 마우스 모델을 확립했습니다. 봉합사 확장 후 뼈 리모델링 변화를 완전히 시각화하기 위해 PEGASOS 조직 투명화 방법을 전체 마운트 EdU 염색 및 칼슘 킬레이트 이중 라벨링과 결합했습니다. 이를 통해 고도로 증식하는 세포와 확장 후 전체 종골 뼈에 걸쳐 새로운 뼈 형성을 시각화할 수 있었습니다. 이 프로토콜은 표준화된 봉합사 확장 마우스 모델과 3D 시각화 방법을 제공하여 인장력 하중 하에서 봉합사 및 뼈 리모델링의 기계적 생물학적 변화를 밝힙니다.
Introduction
두개안면 봉합사는 두개안면골을 연결하고 두개안면골의 성장과 리모델링에 필수적인 역할을 하는 섬유 조직입니다. 봉합사의 구조는 강을 닮았으며, 골형성 전선(osteogenic fronts)으로 알려진 "강둑"에 영양을 공급하고 구축하기 위한 세포 자원의 흐름을 제공하며, 이는 골막내 골형성(intraembranous osteogenesis)을 통해 두개안면골의 형성에 기여한다1.
두개안면 봉합사에 대한 관심은 두개안면 봉합사의 조기 폐쇄 및 안면 봉합사 기능 장애를 이해하려는 임상적 요구에 의해 주도되었으며, 이는 두개안면 기형과 어린이의 생명을 위협하는 상태로 이어질 수 있습니다. 개복 봉합 절제술은 임상 치료에 일상적으로 사용되지만, 일부 환자에서는 장기 추적 관찰 결과 불완전한 재골화가 재발하는 것으로 나타났다2. 확장 스프링이나 내시경 줄무늬 두개골 절제술을 이용한 최소 침습적 개두술은 조직을 폐기하는 것보다 잠재적인 봉합사를 보존하는 더 안전한 방법을 제공할 수 있다3. 마찬가지로, 안면 마스크 및 확장 장치와 같은 정형외과 치료법은 시상 또는 수평 상악 형성 부전을 치료하는 데 널리 사용되어 왔으며, 일부 연구에서는 미니 스크류 보조 구개 확장기를 통해 성인 환자를 치료할 수 있도록 연령 제한을 연장했습니다 4,5,6. 또한 생분해성 물질과 결합된 중간엽 줄기세포(MSC)를 사용한 두개골 봉합사 재생은 관련 질병 치료에 대한 새로운 방향을 제시하는 미래의 잠재적인 치료법입니다7. 그러나 봉합사의 기능 과정이나 조절 메커니즘은 여전히 파악하기 어렵습니다.
골리모델링은 주로 조골세포에 의한 골 형성과 파골세포에 의한 골흡수 사이의 균형으로 이루어지며, 기계적 신호에 의해 자극된 줄기세포의 골형성 분화가 중요한 역할을 합니다. 수십 년간의 연구 끝에 두개안면 봉합사는 매우 가소성 중간엽 줄기세포 틈새라는 것이 밝혀졌다8. 봉합사 줄기 세포(SuSC)는 중간엽 줄기 세포(MSC) 또는 뼈 줄기 세포(SSC)에 속하는 이종 줄기 세포 그룹입니다. SuSC는 in vivo 에서 Gli1, Axin2, Prrx1 및 Ctsk를 포함한 4가지 마커로 표지됩니다. 특히 Gli1+ SuSC는 줄기세포의 생물학적 특성을 엄격하게 검증하여 전형적인 MSC 마커의 발현이 높을 뿐만 아니라 우수한 골형성 및 연골 가능성을 입증했습니다9. 이전 연구에 따르면 Gli1+ SuSC는 인장력 하에서 새로운 뼈 형성에 적극적으로 기여하여 산만 골형성을 지원하는 봉합사 줄기 세포 공급원으로 확인되었습니다10.
과거에는 Flexcell, 4점 굽힘, 미세 자석 로딩 시스템 등을 통해 줄기세포의 광범위한 기계적 특성을 시험관 내에서 연구했습니다. 쥐 두개골 봉합사 유래 중간엽 세포가 in vitro11에서 확인되었고, 인간 봉합사 중간엽 줄기 세포도 최근12 분리되었지만, in vitro 시스템에서 봉합사 세포의 생체역학적 반응은 여전히 불분명하다. 뼈 리모델링 과정을 더 자세히 조사하기 위해 분리된 종골변 장기 배양을 기반으로 한 봉합사 확장 모델이 확립되어 유용한 생체 내 봉합사 확장 모델 1,13을 확립할 수 있는 길을 열었습니다. 토끼(14)와 쥐(15)는 봉합사 확장을 위한 기초 연구에서 가장 널리 사용되는 동물이다. 그러나 마우스는 인간과의 높은 상동 게놈, 수많은 유전자 변형 라인 및 강력한 생식 교잡 능력으로 인해 인간 질병을 탐구하는 데 선호되는 동물 모델입니다. 두개골 봉합사 확장의 기존 마우스 모델은 전형적으로 시상 봉합사(16,17)에 인장력을 가하기 위해 스테인리스강 교정 스프링 와이어에 의존한다. 이 모델에서는 확장 장치를 고정하기 위해 정수리 뼈의 양쪽에 두 개의 구멍을 만들고 와이어를 피부 아래에 매립하여 세포 활성화 모드에 영향을 줄 수 있습니다.
시각화 방법과 관련하여 시상 방향의 슬라이스를 2차원으로 관찰하는 것은 수십 년 동안 일반적으로 채택되어 왔습니다. 그러나 뼈 리모델링이 복잡한 3차원 동적 과정이라는 점을 고려할 때 완전한 3차원 정보를 얻는 것이 시급한 과제가 되었습니다. PEGASOS 조직 투명성 기술은 이 요구 사항18,19을 충족하기 위해 등장했습니다. 그것은 단단한 조직과 연약한 조직의 투명도를 위한 유일한 이점을 제안해, 완전한 뼈 개조 과정이 3차원 공간에서 재생되는 것을 가능하게 하.
뼈 리모델링 기간의 생리적 변화를 보다 심층적이고 포괄적으로 이해하기 위해, 핸드메이드 홀더 사이에 스프링 설정이 있는 표준 시상 봉합사 확장 마우스 모델을 구축하였다10. 표준화된 산 에칭 및 접착 절차를 통해 팽창 장치를 두개골에 단단히 접착하여 시상 봉합사에 수직인 인장력을 생성할 수 있습니다. 또한, 봉합사 확장 후 뼈 모델링 변화를 완전히 시각화하기 위해 확장 후 광물화된 뼈의 이중 표지 후 PEGASOS 조직 투명화 방법을 적용했습니다.
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Protocol
여기에 설명된 모든 실험 절차는 상하이 자오퉁 대학교 의과대학 상하이 제9인민병원 동물 관리 위원회(SH9H-2023-A616-SB)의 승인을 받았습니다. 이 연구에서는 4주 된 C57BL/6 수컷 마우스를 사용했습니다. 사용된 모든 기구는 시술 전에 멸균되었습니다.
1. 봉합사 확장 모델 준비
- 두 개의 고정 홀더 준비.
- 0.014'' 호주 와이어 또는 스테인리스 스틸 와이어( 재료 표 참조)를 사용하여 가벼운 와이어 플라이어로 나선형 루프를 만듭니다. 루프의 직경은 2mm이고 1mm 테일은 양쪽에 예약되어 있습니다(그림 1A).
- 수술을 위한 와이어와 홀더를 오토클레이브, 플라즈마 멸균기 또는 적절한 저온 멸균제(예: 글루타르알데히드)로 멸균합니다.
- 스프링의 준비.
- 맞춤형 스테인리스 스틸 스프링을 준비합니다.
참고: 이 연구에서는 와이어 직경 0.2mm, 외경 1.5mm, 간격 공간 1mm 및 길이 7mm의 압력 스프링을 사용합니다(그림 1B). 각 1mm 스프링 압축은 약 30g의 추력을 얻었습니다. - 설정하기 전에 스프링을 사용 가능한 길이로 자릅니다. 실험 전에 특수 스프링의 힘을 확인하십시오.
알림: 스프링의 크기는 병렬 실험에서 힘 크기가 동일하다면 다양합니다. 힘은 조건이 제한적인 경우 탁상용 단축 시험기 또는 소형 전자 동력계(재료 표 참조)로 측정됩니다. 길이 변화는 힘의 크기로 평가됩니다(그림 1C-E). 특히, 스프링력 하중 값은 마우스의 나이, 뼈 상태 및 연구 대상에 따라 변경해야 합니다. - 길이가 7mm인 직선 호주 와이어 또는 직선 강선 1개를 준비하고 장벽으로 사용할 직경 2mm의 종이 두 장을 만듭니다(그림 1F).
- 맞춤형 스테인리스 스틸 스프링을 준비합니다.
2. 시상 봉합 확장 수술
- 마취: 틸레타민(25mg/kg), 졸라제팜(25mg/kg) 및 자일라진(10mg/kg)으로 마우스를 마취합니다. 동시에 멸균 안과 연고를 눈에 발라 각막이 건조해지는 것을 방지한다. 발가락 꼬집을 통해 쥐의 마취 깊이를 판단합니다.
알림: 느리고 꾸준한 호흡, 팔다리 약화, 근육 이완, 피부 침술 반사 및 눈꺼풀 반사의 소실, 약한 각막 반사와 같은 특징은 마우스가 적절하게 마취되었음을 나타냅니다. - 모피 제거 및 소독: 제모 크림으로 머리 꼭대기의 털을 조심스럽게 제거합니다. 눈을 만지지 마십시오. 수술 직후 요오드포와 75% 알코올을 번갈아 가며 사용하여 수술 부위를 소독합니다. 멜록시캠(1mg/kg)을 진통제로 마우스에 피하주사로 투여한다.
- 신체 위치 고정: 마우스를 앞쪽에 눕히고 수술용 테이프를 사용하여 팔다리를 수술대에 고정합니다.
- 두피 플랩 열기: 수술용 가위를 사용하여 쥐의 목 근처 두피를 따라 아치형 플랩을 수행하여 시상 봉합사와 주변 두개골을 완전히 노출시킵니다. 그런 다음 수술대에서 6-0 봉합사로 두피 플랩을 고정합니다.
- 산성 에칭 후 고정 홀더를 접착합니다.
- 두개골을 건조시키고 20초 동안 37% 인산으로 에칭하고 생리식염수를 사용하여 산 에칭을 청소합니다(그림 2A). 백악질 잔류물은 고무 피펫 전구로 두개골을 건조시킨 후 분명합니다.
- 시상 봉합사에서 3mm 떨어진 정수리 뼈의 양쪽에 있는 두 개의 홀더(1.1단계에서 준비)를 광경화 접착제로 접합합니다(그림 2B).
- 두피 플랩을 재설정합니다.
- 두피 플랩을 수동으로 다시 끼웁니다(그림 2C). 홀더의 위치에 라벨을 붙이고 양측 고정 홀더의 해당 위치에서 두피에 두 개의 작은 구멍을 뚫은 다음 플랩된 두피를 재설정합니다.
- 동시에 작은 고리를 구멍에 통과시켜 피부 표면을 노출시킵니다. 6-0 봉합사로 구부러진 절개 부위를 봉합합니다(그림 2D). 피부 회복에는 1-3일이 소요됩니다. 멜록시캠(meloxicam, 1mg/kg)을 1-3일 동안 24시간마다 피하주사하여 마우스에 투여한다.
알림: 수술 후 마우스 두피의 활동과 홀더가 떨어지는지 매일 확인하십시오. 피부에는 색상과 두께의 문제에 따라 다양한 유형이 있습니다. 건강한 피부 두피는 원래 색상을 유지하고 봉합 후 피부 가장자리가 서서히 융합됩니다. 두피의 감염이 발견되거나 수술 장치가 떨어진 경우 연구에서 쥐를 제거하고 안락사시킵니다.
- 스프링과 가이드 와이어를 설치합니다.
- 스프링을 두 홀더 사이의 거리보다 1mm 더 길게 자릅니다.
- 선택한 압력 스프링을 압축하여 양쪽의 작은 코일 사이에 놓습니다.
- 스테인리스 강선을 작은 코일과 스프링에 통과시키고 스프링을 풀어 약 30g의 시작 추력을 얻습니다.
- 마우스의 스프링 부분 아래 두피가 압박되지 않았는지 확인하십시오.
- 접착이 느슨하지 않고 단단한지 확인한 후 스프링과 홀더 사이에 두 개의 종이 조각을 광경화 접착제로 접착하여 스프링의 양쪽 끝에 장벽을 설정합니다(그림 2E,F).
3. 광물화된 뼈의 이중 라벨링
- 원액의 준비.
- 0.9 % NaCl 및 2 % NaHCO3 를 포함하는 증류수로 희석 용액을 준비합니다.
- 희석액을 사용하여 20mg/mL의 Alizarin 복합 이수화물과 10mg/mL의 Calcein을 준비합니다( 재료 표 참조).
- pH 측정 장치를 사용하여 pH를 7.4로 조정합니다. 정확한 판독을 위해 측정 사이에 pH 프로브를 세척하십시오.
- 염료를 멸균 용기에 넣고 4 °C의 냉장고에 보관하십시오. 호일은 빛을 차단하는 데 사용됩니다.
- 작업 솔루션을 준비합니다. 주입하기 전에 용해 용액을 사용하여 원액을 칼슘의 경우 1mg/mL, 알리자린 복합 이수화물의 경우 2mg/mL로 희석합니다.
- 복강내로 칼세인 그린 5mg/kg과 알리자린 레드 20mg/kg을 두 시점에 주사하여 미네랄화된 뼈에 라벨을 붙이고 두 시간 사이의 변화를 분석합니다. 일반적으로 주입 후 12-14시간 후에 샘플을 수집합니다.
알림: 주입하기 전에 염료를 따뜻하게 하고 주입 시간이 3분 이상인지 확인하십시오. 주입 간격은 팽창 시간에 따라 다릅니다. 이 연구에서 Alizarin red와 Calcein green은 각각 확장 전 밤새 주입(O/N)하고 수집 전 O/N을 주입했습니다. - 두 번째 주사 후 하루 동안 조직 청소 절차를 위해 준비된 전체 종아리뼈를 수집합니다.
4. EdU 염색
- 복강 내 주사: 마우스를 안락사시키기 2시간 전에 EdU를 복강 내 주사합니다(기관에서 승인된 프로토콜에 따름). 복용량은 체중 1mg/10g입니다.
- 라벨링 칵테일 준비: 트리스 완충 식염수(100mmol/L 최종, pH 7.6), CuSO4 (4mmol/L 최종), 설포-시아닌 3 아지드화물(2-5μmol/L 최종) 및 아스코르브산 나트륨(100mmol/L 최종, 매번 신선하게 제조)을 혼합합니다( 재료 표 참조).
- EdU 전체 마운트 염색: PEGASOS 조직 투명화 방법(7단계)에서 조직 탈색 단계 후 샘플을 실온(RT)에서 1일 동안 라벨링 칵테일에 넣습니다.
5. 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 영상
- 조직 고정 및 보관: 4°C O/N에서 4% 파라포름알데히드(PFA)로 종아리뼈를 고정하고 스캔하기 전에 0.5% PFA에 보관합니다.
- 스캐닝 및 분석: 고해상도와 7μm의 복셀 크기를 가진 마이크로 컴퓨터 단층 촬영(μCT) 이미징 시스템으로 샘플을 스캔합니다.
6. PEGASOS 조직 투명화를 위한 작업 솔루션 준비
- 4% 폴리포름알데히드(PFA): PFA 분말 4g을 1× PBS에서 100mL에 녹입니다.
- 심장 관류 용액 : 0.02 % 헤파린, 즉 1× PBS에서 100mL에 용해 된 20 mg 헤파린 분말; 또는 0.05 mol/L EDTA, 즉 0.05 mol의 에틸렌 디아민 테트라아세트산(EDTA)( 재료 표 참조)을 탈이온화 수용액에 총 부피 1L로 용해시켜 사용합니다.
- 석회질 제거 용액: 0.5 mol/L EDTA, 즉 0.5 mol의 에틸렌 디아민 테트라아세트산(EDTA)을 탈이온화 수용액에 총 부피 1L로 용해시킵니다.
- 탈색 용액 : 25 % Quadrol, 이는 250 mL의 Quadrol (N, N, N ', N '-Tetrakis (2- Hydroxypropyl) 에틸렌 디아민) ( 재료 표 참조)을 탈이온수에 용해 총 부피 1 L.
알림: Quadrol의 점도로 인해 구성 전에 유동성을 높이기 위해 60°C로 가열할 수 있습니다. - 탈지 용액 : 30 %, 50 %, 70 % tert- 부탄올 (tB) ( 재료 표 참조), 부피 분율로 물로 준비.
참고: 순수 tB는 실온에서 결정질이므로 용해될 때까지 60°C로 가열해야 사용할 수 있습니다. 이어서, 3% 내지 5%(v/v)의 트리에탄올아민(TEA)을 첨가하여 용액의 pH(>9.5)를 조절한다. - 탈수 용액: TB-PEG 용액, 70% tB + 27% PEG-MMA + 3% Quadrol (v/v), 여기서 PEG-MMA는 평균 분자량이 500 (Poly (ethylene glycol) Methacrylate 500, PEG-MMA 500) ( 재료 표 참조).
- 투명 용액 : BB-PEG 용액, 75 % BB + 22 % PEG-MMA + 3 % Quadrol (v / v), 여기서 BB는 벤질 벤조 에이트 (BB)입니다.
7. PEGASOS 방법을 사용한 종골골의 투명성
- 마취제의 복강내 주사로 마우스를 마취하고(2.1단계), 핀치 반응을 통해 마우스의 마취 깊이를 판단하여 심장 관류 전에 저항 반응이 없는지 확인합니다.
- 심장 관류 및 고정을 수행합니다.
- 쥐의 복부를 위로 잡고 팔다리를 접착 테이프로 고정하고 흉부 둘레를 따라 조심스럽게 잘라 완전히 노출시킵니다.
- 안과 가위로 우심방을 작게 자른 직후 좌심실 정점에 관류 22G 바늘을 삽입합니다.
알림: 과도한 삽입으로 인한 심장 판막 손상을 방지하기 위해 바늘 끝만 삽입됩니다. 그렇지 않으면 심장 관류액이 폐 순환으로 들어가 전신 순환의 관류 효과에 영향을 미칩니다. - 30-50mL 심장 관류액(6.2단계)을 주사기에 밀어 넣습니다. 간이 밝은 빨간색에서 점차 창백해지는 것을 볼 수 있습니다.
- 우심방의 유출액이 완전히 맑아지면 4% PFA 용액을 같은 부피로 주입합니다. PFA 관류의 작동은 환기 된 후드에서 수행됩니다.
- 조직과 장기를 해부하고 분리한 후 4°C에서 4% PFA로 하룻밤 동안 고정합니다.
- 조직 석회질 제거: EdU 염색으로 처리된 샘플의 경우 고정된 경조직을 37°C의 진탕 테이블에 있는 0.5mol/L EDTA(pH 7.0) 용액(10mL)에 약 2일 동안 넣고 매일 액체를 교체합니다.
알림: 신호 전달을 완전히 보존하기 위해 칼슘 킬레이트제로 표지된 뼈에 대한 정규화된 PEGASOS 방법에서 석회질 제거 과정을 건너뜁니다. 석회질 제거는 내인성 형광 또는 전체 마운트 면역염색 신호를 시각화하기 위해 뼈를 치료하는 데 필요합니다. - 조직 탈색: 고정 종아리뼈를 37°C의 진탕 테이블에 25% Quadrol 용액(20mL)에 1일 동안 넣고 유체를 한 번 교체합니다.
알림: 탈색 시간은 조직의 헴 함량과 관련이 있습니다. 색상의 깊이는 유체 교체 처리를 계속해야 할 필요성을 나타내므로 처리 액체의 색상을 관찰하십시오. - EdU 염색: 샘플을 1× PBS에서 5분(3회) 동안 헹구고 라벨링 칵테일에 1일 동안 담그십시오. 그 후, 샘플을 1× PBS에서 1시간(3회) 동안 헹굽니다.
- 조직 탈지 및 탈수
- 조직을 30% tB, 50% tB 및 70% tB 용액에 순서대로 넣어 37°C의 쉐이킹 테이블에서 그래디언트 감소를 수행합니다. 각 농도에 약 2시간 동안 둡니다.
- 그 후, 37°C의 쉐이킹 테이블에서 TB-PEG 용액에서 샘플을 6시간 동안 탈수합니다.
알림: 위의 처리 시간은 조직의 수에 따라 증가하거나 감소할 수 있습니다.
- 조직 투명도: BB-PEG 용액에 완전히 탈수된 조직을 투명해질 때까지 37°C(2-4시간)의 쉐이킹 테이블 위에 놓습니다. 현재 샘플은 최대 1-2년 동안 보관할 수 있습니다.
알림: 거의 완전히 투명화된 후 튜브 뚜껑을 열어 샘플을 노출시키고 흔들면서 매체를 공기에 노출시키면 투명도가 더욱 향상됩니다. 이 방법은 어린 쥐의 머리와 몸 전체뿐만 아니라 개별 조직과 기관의 투명도를 향상시키는 데 적합합니다. 그러나 성체 마우스의 전신의 투명도를 위해 위의 단계는 전체 주기 관류 방법을 사용하여 수행해야 합니다.
8. 이미징
참고: 이 연구에서는 투명 조직의 3D 시각화를 위해 공초점 현미경을 사용했습니다. 광시트 현미경도 이 프로토콜에 적합합니다. 여러 운영 체제가 이전에 사용 가능한 것으로 확인되었습니다. 여기서는 레이저 컨포칼 현미경 운영 체제를 예로 들어 설명합니다( 재료 표 참조).
- 사용 설명서에 따라 올바른 단계에 따라 레이저 공초점 및 LAS AF 작동 인터페이스를 엽니다. 다른 촬영 채널에서 필요한 레이저를 켜고 전원을 조정하십시오. 광학 경로와 해당 파장을 Alizarin 빨간색의 경우 561nm, Calcein 녹색의 경우 488nm로 설정하며, 이 중 하나는 라벨링 칵테일에 따라 EdU 신호에 사용됩니다.
- 두꺼운 표본, 임베딩 상자 또는 방수 접착제와 같은 자체 제작 배치 장치를 운반할 수 있는 오목한 유리 페트리 접시에 투명한 샘플을 넣어 투명한 샘플을 투명한 액체에 담그십시오.
- 샘플을 빠르게 찾을 수 있도록 저배율 대물 렌즈를 선택하십시오. 고속 스캔 기능으로 전체 종골 조직을 전체적으로 살펴보고 이미징을 위한 관심 영역을 찾습니다.
- 출력 전력을 설정하고 스캔 모드를 선택한 다음 먼저 촬영 계수(해상도, 스캔 속도, 줌 비율, 이미지 품질, 평균 배경 노이즈 등)를 조정합니다.
알림: 일반적으로 Smart Gain 범위는 500에서 800 사이입니다(신호 및 노이즈 변화 모두). 스마트 오프셋은 가능한 한 0에 가깝고 이미지 품질을 보장합니다(배경 노이즈를 줄이기 위해). PMT 게인이 800보다 높거나 HyD 게인이 100%보다 크고 밝기가 여전히 부족한 경우 레이저 강도를 적절하게 높일 수 있지만 원칙적으로 낮을수록 좋습니다. - 투명 조직의 가장 얕은 쪽에서 드릴다운되는 축 거리 Z 범위와 Z 단계를 설정합니다. 즉, 가장 깊고 얕은 면을 설정합니다.
참고: 각 렌즈의 분류와 working distance를 확인하십시오. Z 범위를 신중하게 설정하고 선택한 렌즈의 한계를 초과하여 working distance를 조작하지 마십시오. "z-Galvo"는 미세 조절이 필요할 때 선택할 수 있습니다. - 촬영 매개변수를 다시 설정하고 촬영을 시작합니다. 완료 후 다기능 모듈을 통해 이미지를 병합하고 처리합니다. 마지막으로 표시된 순서대로 기기를 보관하고 종료하십시오.
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Representative Results
이 프로토콜을 사용하여 시상 봉합사 확장을 위한 마우스 모델이 설정되었습니다(그림 1-2). 봉합사 확장 후 뼈 모델링 변화의 3D 시각화를 위해 PEGASOS 조직 투명화 방법을 확장 후 전체 종골 뼈에 적용했습니다. 관류 후, 종골골을 분리하고(그림 3A), 적절한 PEGASOS 과정을 계속하였다(표 1 및 표 2). 놀랍게도, 종아리뼈는 석회질 제거 수술 여부와 관계없이 완전한 PEGASOS 과정 후에 거의 투명해졌습니다(그림 3B,C).
팽창 후의 변화를 빠르게 시각화하기 위해 수집 및 고정 샘플에 μCT를 사용했습니다. 대조군(그림 4A)과 비교했을 때, 두개골 봉합사는 1일 동안 힘을 가한 후 점진적으로 크게 확장되었습니다(그림 4B). 5일째 되던 날, 뼈 가장자리에 푹신푹신한 뼈 돌출부가 나타났다(그림 4C).
확장 후 전체 봉합사에서 광물화 병치 속도를 3차원으로 시각화하기 위해 석회질이 제거되지 않은 종아리뼈에서도 효율적인 PEGASOS 기술과 함께 이중 표지 방법을 사용했습니다(그림 5). 생리학적 조건 하에서 사전-사후 라벨링 신호 사이에는 약간의 변화가 있었지만 (그림 5A) 포스 로딩은 골형성을 크게 활성화했습니다. 단일 칼슘 황록색 마커로 표지된 새로 광물화된 뼈의 지그재그 패턴은 7일 동안 확장된 후 넓어졌습니다(그림 5B,C). 고해상도 3차원 시각화에서 가장자리 뼈의 패턴 변화는 봉합사 확장 후 뼈 리모델링 과정을 나타내며 새로 형성된 뼈의 정도는 봉합사의 양면에 따라 다릅니다(그림 5C).
또한, 봉합사 확장 시 세포의 증식 속도를 시각화하기 위해 석회화 과정과 함께 PEGASOS 조직 투명화 방법을 사용하여 전체 마운트 EdU 통합을 시도했습니다. 성공적으로 라벨링은 투명한 조직에서 효율적이고 잘 보존되었습니다. 대조군에서는 여러 개의 EdU+ 세포가 봉합사 전체에 확산되어 분포되어 있었는데(그림 6A), 이는 생리학적 뼈 리모델링에 중요할 수 있지만 2D 절편에서는 간과될 수 있습니다. 1일 동안 확장했을 때, 증식하는 세포는 봉합사의 중간과 가장자리에서 최고조에 달했습니다(그림 6B). 봉합사가 넓어짐에 따라 증식하는 세포의 수는 시간이 지남에 따라 감소하여 7일째에 도달했습니다(그림 6C). 강조 표시된 세포는 골수에 있는 작고 둥근 세포로, EdU+ 봉합사 세포와 다른 혈액 세포를 나타냅니다(그림 6C).
그림 1: 수술을 위해 중요한 재료가 준비되었습니다. 고정 홀더는 스테인리스 스틸 와이어로 만들어졌습니다. 직경은 2mm이고 1mm 꼬리는 양면(A)에 예약되어 있습니다. 와이어 직경 0.2mm, 외경 1.5mm, 간격 공간 1mm의 압력 스프링을 적용하였다(B). 인장력은 다이나미터(C,D)에 의해 감지되었습니다. 이 실험에서 각 1mm 스프링 압축은 약 30g(E)의 추력을 얻었습니다. 종이 조각을 지름 2mm의 연 모양으로 잘라 장벽(F)으로 사용했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 봉합사 확장 마우스 모델의 수술 과정. 칼바리알 플랩을 뒤집은 후 고정 홀더가 노출되는 위치에서 산 에칭(A)과 본딩(B)을 수행했습니다. 두피 플랩(C)을 재설정한 후 홀더를 표시된 위치(D)에 노출시켰습니다. 두 홀더 사이에 스프링을 설치하여 종아리 봉합사에 팽창력을 가하고, 홀더가 단단히 접착된 것을 확인한 후 스프링 양쪽 끝에 두 장의 종이 조각을 배리어(E,F)로 고정했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 석회질 제거 유무에 관계없이 두 개의 종골 뼈에 PEGASOS 조직 투명화 절차가 적용되었습니다. 관류 후, 종골뼈를 분리하고, 일부 혈액 얼룩과 연조직을 부착하였다(A). 석회질 제거 과정(B)을 경험한 종아리뼈 또는 석회질 제거가 없는 뼈(C)는 PEGASOS의 전체 과정 후에 거의 완전히 투명했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 종아리 봉합사는 인장력을 가한 후 점진적으로 팽창했습니다. 힘 하중이 없는 시상 봉합사(A)와 1일 및 5일 동안의 힘 하중 후(B,C)의 μCT 이미지. 기준자: 100 μm. Exp = 확장. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 3D 이미지에서 봉합사 확장 후 활성화된 골형성. (A-C) PEGASOS 방법으로 투명화된 이중 표지 시상 봉합사의 3차원 시각화. 알리자린 레드(Alizarin red)와 칼세인 그린(Calcein green)을 각각 7일간(B,C) 확장 전 밤새 복강내 주사하고, 동일한 시점(A)에서 기계적 부하가 없는 대조군과 비교했다. 전체 봉합사 이미지(A,B)를 효율적으로 획득하기 위해 5x 렌즈를 사용하였고, (B)의 박스 이미지를 10x 렌즈로 이미지화한 (C, C', C'')에서 확대하였다. A,B의 스케일 바: 100 μm, C: 150 μm. Exp = 확장. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 3D 이미지에서 인장력 하중 시 고도로 증식된 봉합사 세포. PEGASOS 조직 투명화 방법과 결합된 전체 마운트 통합 분석은 조용할 때(A) 또는 1일 및 7일 동안(B,C) 강제 로딩 후 전체 봉합사에서 증식하는 세포를 표시했습니다. 10x 렌즈로 촬영한 이미지. 점선은 시상 봉합사를 위한 두 가장자리의 윤곽을 그립니다. 기준자: 100 μm. Exp = 확장. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 프로세스 | 솔루션 | 시간 & 온도 |
| 1. 복강내 주사 | 1mg/10g EdU | 쥐를 안락사시키기 2시간 전 |
| 2. 관류 | 0.02% 헤파린 & 0.05 mol/L EDTA | / |
| 3. 고정 | PFA 4% 함유 | O/N, 4 °C |
| 4. 석회질 제거 | 10% 이디타 | 2일, 37 °C |
| 5. 탈색 | 25% 쿼드롤 | 1일, 37 °C |
| 6. EdU 염색 | 라벨링 칵테일 | 1일, RT |
| 7. 탈지 | 30% tert-부탄올 | 2 시간, 37 °C |
| 50% tert-부탄올 | 2 시간, 37 °C | |
| 70% tert-부탄올 | 2 시간, 37 °C | |
| 8. 탈수 | TB-PEG 솔루션 | 3시간*2, 37°C |
| 9. 청산 | BB-PEG 솔루션 | 2 시간, 37 °C |
표 1: EdU 염색을 사용한 종아리골에 대한 PEGASOS 조직 투명화 절차.
| 프로세스 | 솔루션 | 시간 & 온도 |
| 1. 복강내 주사 | 20 mg/kg 알리자린 레드 | 확장 전 하룻밤 |
| 2. 복강내 주사 | 칼세인 5mg/kg | 수거 전날 밤새 |
| 3. 관류 | 0.02% 헤파린 & 0.05 mol/L EDTA | / |
| 4. 고정 | PFA 4% 함유 | O/N, 4 °C |
| 5. 탈색 | 25% 쿼드롤 | 1일, 37 °C |
표 2: Calcein green 및 Alizarin red로 광물화된 뼈의 이중 표지를 사용한 종골 뼈에 대한 PEGASOS 조직 투명화 절차.
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Discussion
표준 봉합사 확장 마우스 모델을 적용하여 한 달간의 전체 리모델링 주기 동안 매주 발생하는 규칙적인 형태학적 변화를 관찰했습니다10. 이 모델은 종변 봉합사를 확장하여 종아리골 리모델링 및 재생을 연구하고 생체 내에서 다양한 봉합사 세포를 연구하는 데 유용합니다. 이러한 연구 결과를 완전히 제시하기 위해서는 염색된 조직의 3차원 시각화가 필요합니다. 따라서 경질 조직19,20을 투명화하는 효율성으로 알려진 PEGASOS 기술은 이중 표지 및 EdU 염색과 결합되어 확장 과정에서 확장된 광물화 속도 및 증식하는 세포를 드러냈습니다.
봉합사 확장 수술과 관련하여 중요한 단계 중 하나는 고정 링의 접착입니다. 뼈 표면과의 단단한 결합을 보장하기 위해 리테이너 링 바닥에서 산 에칭 및 접착 공정을 표준화했습니다. 리테이너 링의 작은 고리는 뼈 표면에 수직이어야 하며 두피의 작은 구멍과 일치해야 합니다. 두피를 봉합한 후 작은 고리를 자연스럽고 균형 잡힌 상태로 작은 구멍을 통해 피부 표면에 노출시켜 힘을 가하는 스프링과 가이드 와이어를 설치하는 동안 고정 링이 무너져 수술 실패로 이어질 수 있는 것을 방지해야 합니다. 또한 적절한 힘을 가하는 스프링을 선택하는 것은 고정 링이 떨어지는 것을 방지하고 의도한 힘을 가하는 것을 방지하면서 스프링을 더 쉽게 설치할 수 있기 때문에 성공적인 수술에 매우 중요합니다.
이전 모델에 비해 이 모델은 몇 가지 이점을 제공합니다. 첫째, 정수리 뼈에 원형 뼈 결손이 형성되는 것을 방지하여 세포 활성화 모드를 유지합니다. 또한 스프링을 분해하여 언제든지 힘을 제거할 수 있어 응력 스트레칭 후 재귀 모델 구축에 적합합니다. 스프링을 분해할 수 있어 실험 동물의 2차 손상을 최소화할 수 있습니다. 또한 인장 응력의 기계적 크기는 스프링 힘을 변경하여 쉽게 조정할 수 있습니다. 중요한 것은 이 모델이 두개골 봉합사 주변의 자연스러운 생리학적 환경을 유지하여 실험 결과의 정확성을 보장한다는 것입니다.
그러나 이 확장 모델에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 첫째, 힘이 과도하면 고정 링이 떨어질 위험이 있습니다. 초보자는 이러한 위험을 완화하기 위해 봄 설치에서 예비 연습을 수행해야 합니다. 둘째, 두피를 열고 두개골을 노출할 경우 감염의 위험이 있기 때문에 기구 소독이 필수이며, 수술 시간을 단축하는 것이 치유에 도움이 됩니다. 과마취는 쥐의 죽음으로 이어질 수도 있습니다.
패시브 페가소스(passive PEGASOS) 방법은 어린 쥐의 머리와 몸 전체뿐만 아니라 개별 조직과 장기의 투명성을 달성하는 데 적용할 수 있습니다. 전체 종골 뼈에는 효율적이지만 더 큰 샘플, 특히 전체 뼈 조직 또는 관절이 있는 벌크 긴 뼈 조직의 경우 처리 시간이 더 오래 걸립니다. 조직 석회질 제거는 염색 과정을 방해하므로 이중 라벨링 프로토콜을 사용할 때 수행해서는 안 된다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. PEGASOS 조직 투명화 방법도 유연하여 EdU 통합 또는 칼슘 이중 라벨링에 국한되지 않고 형질전환 마우스 모델의 내인성 형광 또는 전체 마운트 염료 또는 항체 염색 등 다양한 라벨링 방법과 결합할 수 있으며, 모두 형광이 잘 보존되어 있습니다.
안정적인 효과와 높은 반복성을 갖춘 이 봉합사 확장 모델은 다양한 연령대의 형질전환 마우스의 다양한 균주에 적합합니다. 인장 응력의 크기를 조절하고 언제든지 힘을 빼낼 수 있어 응력 자극 후 재발에 대한 편리한 연구가 가능합니다. 광물화된 뼈의 이중 표지 방법과 PEGASOS 조직 투명화 기술을 결합하여 뼈 리모델링 중 두개골 봉합사 줄기 세포의 3차원 시공간 분포를 관찰할 수 있으므로 SUSC와 기계적 스트레스 간의 관계와 특정 메커니즘을 추가로 탐구할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개할 것이 없습니다.
Acknowledgments
Shanghai Jiaotong University School of Medicine의 Ear Institute의 실험실 플랫폼과 지원에 감사드립니다. 이 작업은 Shanghai Pujiang Program(22PJ1409200)의 지원을 받았습니다. 중국 국립 자연 과학 재단 (No.11932012); 상하이 제9인민병원, 상하이 자오퉁 대학교 의과대학 박사후 과학 연구 재단; 상하이 자오퉁 대학교 의과대학(JYZZ154) 부속 제9인민병원의 기초 연구 프로그램 자금 지원.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37% Acid etching | Xihubiom | E10-02/1807011 | |
| Alizarin red | Sigma-Aldrich | A3882 | |
| AUSTRALIAN WIRE | A.J.WILCOCK | 0.014'' | |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | B6630 | |
| Calcein green | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Copper(II) sulfate, anhydrous | Sangon Biotech | A603008 | |
| Dynamometer | Sanliang | SF-10N | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| EdU | Invitrogen | E104152 | |
| Laser Confocal Microscope | Leica | SP8 | |
| PBS | Sangon Biotech | E607008 | |
| PEG-MMA 500 | Sigma-Aldrich | 447943 | |
| PFA | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| pH Meters | Mettler Toledo | S220 | |
| Quadrol | Sigma-Aldrich | 122262 | |
| Sodium Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| Sodium bicarbonate | Sangon Biotech | A500873 | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A610476 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Spring | TAOBAO | 0.2*1.5*1*7 | |
| Sulfo-Cyanine3 azide | Lumiprobe | A1330 | |
| tert-Butanol | Sigma-Aldrich | 360538 | Protect from light. Do not freeze. |
| Transbond MIP Moisture Insensitive Primer |
3M Unitek | 712-025 | |
| Transbond XT Light Cure Adhesive Paste |
3M Unitek | 712-035 | |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | V900257 | |
| Tris-buffered saline | Sangon Biotech | A500027 |
References
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