Summary
Данный протокол представляет собой стандартизированную мышиную модель расширения шовного материала и метод 3-D визуализации для изучения механобиологических изменений шва и ремоделирования кости при растягивающей силе.
Abstract
Черепно-лицевые швы играют решающую роль, помимо того, что они являются фиброзными суставами, соединяющими черепно-лицевые кости; Они также служат основной нишей для роста костей черепа и лица, вмещая мезенхимальные стволовые клетки и остеопредшественники. Поскольку большинство черепно-лицевых костей развиваются путем внутренней мембранозной оссификации, краевые участки швов действуют как точки инициации. Из-за этой значимости эти швы стали интригующими мишенями в ортопедической терапии, такой как пружинное расширение свода черепа, быстрое расширение верхней челюсти и протрация верхней челюсти. Под действием ортопедической силы шовные стволовые клетки быстро активируются, становясь динамическим источником для ремоделирования кости во время расширения. Несмотря на их важность, физиологические изменения в периоды ремоделирования костной ткани остаются малоизученными. Традиционные методы секционирования, в первую очередь в сагиттальном направлении, не охватывают комплексных изменений, происходящих по всему шву. В этом исследовании была создана стандартная мышиная модель расширения сагиттального шва. Чтобы полностью визуализировать изменения ремоделирования костной ткани после расширения шва, метод очистки тканей PEGASOS был объединен с окрашиванием EdU и двойным мечением хелатированием кальция. Это позволило визуализировать высокопролиферирующие клетки и образование новой костной ткани по всей костной кости после расширения. Этот протокол предлагает стандартизированную мышиную модель расширения шовного материала и метод 3-D визуализации, проливающий свет на механобиологические изменения в швах и ремоделирование кости при растягивающей силе.
Introduction
Черепно-лицевые швы представляют собой волокнистые ткани, которые соединяют черепно-лицевые кости и играют важную роль в росте и ремоделировании черепно-лицевых костей. Структура шва напоминает реку, обеспечивая приток клеточных ресурсов для питания и построения «берега реки», известного как остеогенные фронты, которые способствуют формированию черепно-лицевых костей посредством интрамембранозного остеогенеза1.
Интерес к черепно-лицевым швам был обусловлен клиническими потребностями в понимании преждевременного закрытия черепных швов и дисфункции лицевых швов, которые могут привести к черепно-лицевым деформациям и даже опасным для жизни состояниям у детей. Открытая шовная хирургия обычно используется в клиническом лечении, но длительное наблюдение показало неполный рецидив повторного окостенения у некоторых пациентов2. Минимально инвазивная трепанация черепа с помощью расширительных пружин или эндоскопическая полосковая краниэктомия может обеспечить более безопасный подход к сохранению потенциального шва, а не к отбрасыванию тканей3. Аналогичным образом, ортопедические методы лечения, такие как маски для лица и расширительные устройства, широко используются для лечения сагиттальной или горизонтальной гипоплазии верхней челюсти, при этом некоторые исследования расширяют возрастные ограничения для лечения взрослых пациентов с помощью минивинтовых расширителей неба 4,5,6. Кроме того, регенерация краниальных швов с помощью мезенхимальных стволовых клеток (МСК) в сочетании с биоразлагаемыми материалами является потенциальной терапией в будущем, предлагая новое направление для лечения родственных заболеваний7. Тем не менее, функциональный процесс или регуляторный механизм швов остается неуловимым.
Ремоделирование костной ткани в основном состоит из баланса между костным образованием, осуществляемым остеобластами, и костной резорбцией, проводимой остеокластами, где важную роль играет остеогенная дифференцировка стволовых клеток, стимулируемая механическими сигналами. После десятилетий исследований было установлено, что черепно-лицевые швы представляют собой высокопластичные ниши мезенхимальных стволовых клеток8. Шовные стволовые клетки (SuSC) представляют собой гетерогенную группу стволовых клеток, принадлежащих к мезенхимальным стволовым клеткам (МСК) или костным стволовым клеткам (SSC). SuSC мечаются in vivo четырьмя маркерами, включая Gli1, Axin2, Prrx1 и Ctsk. В частности, SuSC Gli1+ строго верифицировали биологические характеристики стволовых клеток, не только демонстрируя высокую экспрессию типичных маркеров МСК, но и демонстрируя превосходный остеогенный и хондрогенный потенциал9. Предыдущие исследования показали, что SuSC Gli1+ активно способствуют формированию новой костной ткани под действием растягивающей силы, что позволяет идентифицировать их как источник шовных стволовых клеток, поддерживающий дистракционный остеогенез10.
В прошлом обширные механические характеристики стволовых клеток изучались in vitro с помощью Flexcell, четырехточечного изгиба, системы микромагнитной нагрузки и других. Несмотря на то, что мезенхимальные клетки, полученные из черепного шва мышей, были идентифицированы in vitro11, а мезенхимальные стволовые клетки человеческого шовного материала также были выделены недавно12, биомеханический ответ шовных клеток в системе in vitro остается неясным. Для дальнейшего изучения процесса ремоделирования костной ткани была создана модель расширения шва, основанная на изолированной культуре органов кальварии, что проложило путь к созданию полезной модели расширения шовного материала in vivo 1,13. Кролики14 и крысы15 были наиболее широко используемыми животными в фундаментальных исследованиях для расширения шва. Тем не менее, мыши являются предпочтительными животными моделями для изучения болезней человека из-за их высокогомологичного генома с человеческим, многочисленных линий модификации генов и сильной способности к репродуктивной гибридизации. Существующие мышиные модели расширения черепного шва обычно полагаются на ортодонтические пружинные проволоки из нержавеющей стали для приложения растягивающего усилия к сагиттальному шву 16,17. В этих моделях с каждой стороны теменных костей проделываются по два отверстия для фиксации расширительного устройства, а провода встроены под кожу, что может повлиять на режим активации клеток.
Что касается метода визуализации, то двумерное наблюдение срезов в сагиттальном направлении было принято в течение десятилетий. Однако, учитывая, что ремоделирование костной ткани является сложным трехмерным динамическим процессом, получение полной трехмерной информации стало насущной необходимостью. Для удовлетворения этого требования появился метод прозрачности тканей PEGASOS18,19. Он обладает уникальными преимуществами прозрачности твердых и мягких тканей, позволяя воспроизводить весь процесс ремоделирования кости в трехмерном пространстве.
Для получения более глубокого и всестороннего понимания физиологических изменений в периоды ремоделирования костной ткани была создана стандартная модель мыши с расширением сагиттального шва с пружинной установкой между самодельными держателями10. С помощью стандартизированной процедуры кислотного травления и склеивания расширительное устройство может быть прочно прикреплено к черепной кости, создавая растягивающее усилие, перпендикулярное сагиттальному шву. Кроме того, метод очистки тканей PEGASOS был применен после двойного мечения минерализованной кости после расширения, чтобы полностью визуализировать изменения моделирования кости после расширения шва.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все экспериментальные процедуры, описанные здесь, были одобрены Комитетом по уходу за животными Шанхайской девятой народной больницы Шанхайской медицинской школы Университета Цзяо Тун (SH9H-2023-A616-SB). В этом исследовании использовались 4-недельные самцы мышей C57BL/6. Все используемые инструменты были стерилизованы перед процедурой.
1. Подготовка модели расширения шва
- Подготовка двух ретенционных держателей.
- Используйте австралийскую проволоку диаметром 0,014 дюйма или проволоку из нержавеющей стали (см. Таблицу материалов), чтобы сделать спиральную петлю с помощью легких плоскогубцев. Диаметр петли составляет 2 мм, а хвост 1 мм зарезервирован с двух сторон (рисунок 1А).
- Стерилизуйте провода и держатели для операции в автоклаве, плазменном стерилизаторе или подходящем холодном стерилизаторе (например, глутаровом альдегиде).
- Подготовка пружин.
- Подготовьте пружины из нержавеющей стали по индивидуальному заказу.
ПРИМЕЧАНИЕ: В данном исследовании используется прижимная пружина диаметром проволоки 0,2 мм, наружным диаметром 1,5 мм, интервалом 1 мм и длиной 7 мм (Рисунок 1B). На каждый 1 мм сжатия пружины получается тяга около 30 g. - Перед установкой обрежьте пружину на доступную длину. Перед экспериментом уточните усилие для специализированной пружины.
ПРИМЕЧАНИЕ: Размеры пружин варьируются до тех пор, пока величина силы одинакова в параллельных экспериментах. Усилие измеряется настольным одноосным испытательным прибором или небольшим электронным динамометром (см. Таблицу материалов), если условие ограничено. Изменение длины оценивается по величине силы (рис. 1C-E). В частности, необходимо изменять величину силы нагружения пружины в зависимости от возраста, состояния костей мыши и объектов исследования. - Подготовьте одну прямую австралийскую проволоку или прямую стальную проволоку длиной 7 мм и сделайте два листа бумаги диаметром 2 мм, чтобы использовать их в качестве барьеров (Рисунок 1F).
- Подготовьте пружины из нержавеющей стали по индивидуальному заказу.
2. Операция по расширению сагиттального шва
- Обезболивание: Обезболивайте мышей тилетамином (25 мг/кг), золазепамом (25 мг/кг) и ксилазином (10 мг/кг). Одновременно наносите на глаза стерильную офтальмологическую мазь, чтобы не допустить пересыхания роговицы. Судите о глубине анестезии мышей через щипок пальца ноги.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие характеристики указывают на то, что мышь находится под наркозом должным образом: медленное и ровное дыхание, слабость конечностей, расслабление мышц, исчезновение кожного акупунктурного рефлекса и рефлекса век, а также ослабление роговичного рефлекса. - Удаление и дезинфекция шерсти: Осторожно удалите шерсть на макушке с помощью крема для удаления волос; Избегайте прикосновений к глазам. Вскоре после этого используйте чередующиеся дозы йодофора и 75% спирта для дезинфекции места операции. Вводят мелоксикам (1 мг/кг) в качестве анальгезии мышам путем подкожной инъекции.
- Фиксация положения тела: Положите мышь лежа на переднюю сторону и с помощью хирургических лент зафиксируйте конечности на операционном столе.
- Открытый лоскут кожи головы: Используйте хирургические ножницы, чтобы выполнить дугообразный лоскут вдоль кожи головы возле шеи мыши, полностью обнажив сагиттальный шов и окружающий череп. После этого зафиксируйте лоскут волосистой части головы швом 6-0 на операционном столе.
- Склейте держатели после кислотного травления.
- Высушите череп и протравите его 37%-ной ортофосфорной кислотой в течение 20 с, а затем используйте обычный физиологический раствор для очистки кислотного травления (рис. 2А). Меловой след будет заметен после высушивания черепа резиновой колбой пипетки.
- Зацементируйте два держателя (подготовленные на шаге 1.1) с обеих сторон теменных костей на расстоянии 3 мм от сагиттальных швов световым клеем (рис. 2B).
- Сбросьте лоскут кожи головы.
- Вручную откиньте лоскут кожи головы (Рисунок 2C). Обозначьте положение держателей, вырежьте два небольших отверстия в коже головы в соответствии с положением двусторонних ретенционных держателей, а затем верните в исходное положение лоскут кожи головы.
- В то же время проденьте небольшие петли через отверстия, чтобы обнажить поверхность кожи. Зашить изогнутый разрез шовным материалом 6-0 (Рисунок 2D). На восстановление кожи отводится от одного до трех дней. Мелоксикам (1 мг/кг) вводят мышам путем подкожной инъекции каждые 24 ч в течение 1–3 дней.
ПРИМЕЧАНИЕ: После операции ежедневно проверяйте активность кожи головы мыши и не отпадают ли держатели. Существуют различные типы кожи по цвету и толщине; Здоровая кожа головы сохранит первоначальный цвет, а края кожи постепенно срастаются после наложения швов. Если обнаружена инфекция кожи головы, или если хирургическое приспособление отвалилось, удалите мышь из исследования и усыпите ее.
- Установите пружину и направляющую проволоку.
- Обрежьте пружину на 1 мм длиннее, чем расстояние между двумя держателями.
- Сожмите выбранную прижимную пружину и поместите ее между маленькими витками с обеих сторон.
- Пропустите проволоку из нержавеющей стали через маленькие витки и пружину и отпустите пружину, чтобы получить начальную тягу около 30 g.
- Убедитесь, что кожа головы под пружинной областью мыши без какого-либо сдавливания.
- Убедившись, что соединение прочное и непрочное, скрепите два клочка бумаги между пружиной и держателями световым клеем, чтобы создать барьеры на обоих концах пружины (Рисунок 2E, F).
3. Двойная маркировка минерализованных костей
- Приготовление исходного раствора.
- Приготовьте раствор для разбавления дистиллированной водой, содержащей 0,9% NaCl и 2% NaHCO3.
- С помощью раствора разбавителя получают 20 мг/мл комплексного дигидрата ализарина и 10 мг/мл кальцеина (см. таблицу материалов).
- Отрегулируйте рН до 7,4 с помощью прибора для измерения рН. Промывайте датчик pH между измерениями, чтобы обеспечить точные показания.
- Поместите краситель в стерильный контейнер и храните его в холодильнике при температуре 4 °C; Фольга используется для защиты от света.
- Приготовьте рабочий раствор. Перед инъекцией разбавляют исходный раствор до 1 мг/мл для кальция и 2 мг/мл для бигидрата комплекса ализарина с помощью раствора.
- Внутрибрюшинно вводят 5 мг/кг кальцеина зеленого и 20 мг/кг ализарина красного в двух временных точках, чтобы пометить минерализованные кости и проанализировать изменения между двумя временами. Как правило, образцы собирают через 12-14 ч после инъекции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подогрейте красители перед инъекцией и убедитесь, что время инъекции составляет не менее 3 минут. Интервал впрыска зависит от времени расширения. В этом исследовании ализарин красный и кальцеин зеленый вводили в течение ночи (O/N) перед расширением и O/N перед сбором, соответственно. - На следующий день после второй инъекции собирают целые кости пяточной кости, подготовленные для процедуры очищения тканей.
4. Окрашивание EdU
- Внутрибрюшинная инъекция: Внутрибрюшинно вводят EdU за 2 ч до эвтаназии мышей (в соответствии с утвержденными протоколами). Доза составляет 1 мг/10 г массы тела.
- Приготовление коктейля для маркировки: Микс Трис-буферный физиологический раствор (100 ммоль/л окончательный, рН 7,6), CuSO4 (4 ммоль/л конечный), Sulfo-Cyanine 3 Azide (2-5 мкмоль/л конечный) и Аскорбат натрия (100 ммоль/л окончательный, свежий при каждом использовании) (см. Таблицу материалов).
- Окрашивание EdU: После этапа обесцвечивания тканей методом очистки тканей PEGASOS (шаг 7) поместите образцы в коктейль для маркировки на 1 день при комнатной температуре (RT).
5. Микрокомпьютерная томография
- Фиксация и хранение тканей: Зафиксируйте кости черепной железы в 4% параформальдегиде (PFA) при 4 °C O/N и храните их в 0,5% PFA перед сканированием.
- Сканирование и анализ: Сканирование образцов с помощью системы микрокомпьютерной томографии (мкКТ) с высоким разрешением и размером вокселя 7 мкм.
6. Приготовление рабочего раствора для очистки тканей PEGASOS
- 4% полиформальдегид (PFA): растворите 4 г порошка PFA в 1× PBS до 100 мл.
- Раствор для сердечной перфузии: 0,02% гепарина, то есть 20 мг порошка гепарина, растворенного в 1× PBS до 100 мл; в качестве альтернативы используют 0,05 моль/л ЭДТА, то есть 0,05 моль этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) (см. таблицу материалов), растворенных в деионизированном водном растворе до общего объема 1 л.
- Раствор для декальцинации: 0,5 моль/л ЭДТА, то есть 0,5 моль этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), растворенная в деионизированном водном растворе до общего объема 1 л.
- Раствор для обесцвечивания: 25% Квадрол, который представляет собой 250 мл Квадрола (N, N, N', N'-Тетракис(2-гидроксипропил)этилендиамин) (см. таблицу материалов), растворенных в деионизированной воде до общего объема 1 л.
ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за вязкости Quadrol его можно нагреть до 60 °C, чтобы увеличить его текучесть перед конфигурацией. - Обезжиривающий раствор: 30%, 50%, 70% трет-бутанол (тБ) (см. таблицу материалов), приготовленный на воде по объемной доле.
ПРИМЕЧАНИЕ: Учитывая, что чистый tB является кристаллическим при комнатной температуре, его необходимо нагреть до 60 °C до растворения, прежде чем его можно будет использовать. Затем добавляют от 3% до 5% (v/v) триэтаноламин (TEA) для регулирования рН раствора >9,5. - Раствор для обезвоживания: раствор TB-PEG, 70% tB + 27% PEG-MMA + 3% Quadrol (v/v), где PEG-MMA представляет собой метакрилат поли (этиленгликоль) метилового эфира со средней молекулярной массой 500 (Poly (этиленгликоль) Метакрилат 500, PEG-MMA 500) (см. Таблицу материалов).
- Прозрачный раствор: раствор BB-PEG, 75% BB + 22% PEG-MMA + 3% Quadrol (v/v), где BB - бензилбензоат (BB).
7. Прозрачность костей головного мозга методом PEGASOS
- Обезболивайте мышь путем внутрибрюшинной инъекции анестетиков (шаг 2.1) и оценивайте глубину анестезии мыши по реакции сжатия, чтобы убедиться в отсутствии реакции сопротивления до сердечной перфузии.
- Выполняют перфузию и фиксацию сердца.
- Держите живот мышки вверх, фиксируйте конечности скотчем, и аккуратно разрежьте по окружности грудной клетки, чтобы полностью обнажить ее.
- Сразу после выполнения небольшого надреза в правом предсердии офтальмологическими ножницами ввести иглу перфузии 22 G на верхушку левого желудочка.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вставляется только кончик иглы, чтобы не повредить сердечный клапан чрезмерным введением. В противном случае сердечная перфузионная жидкость попадет в легочный круг кровообращения, влияя на перфузионный эффект системного кровообращения. - Протолкните 30-50 мл сердечной перфузионной жидкости (шаг 6.2) в шприц. Видно, что печень постепенно бледнеет из ярко-красной.
- После того, как жидкость оттока из правого предсердия станет полностью прозрачной, влейте 4% раствор PFA в равном объеме. Операция перфузии PFA проводится в вентилируемом колпаке.
- Препарировать и отделить ткани и органы и зафиксировать их на ночь с 4% PFA при 4 °C.
- Декальцинация тканей: Для образцов, обработанных окрашиванием EdU, поместите фиксированную твердую ткань в раствор ЭДТА (pH 7,0) (рН 7,0) (10 мл) в трясущийся стол при 37 °C примерно на 2 дня и ежедневно меняйте жидкость.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пропустите процесс декальцинации в нормализованном методе PEGASOS для костей, меченных хелатирующим агентом кальция, чтобы полностью сохранить сигнализацию. Декальцинация необходима для обработки костей с целью визуализации эндогенной флуоресценции или сигналов иммуноокрашения всего массива. - Обесцвечивание тканей: Поместите неподвижные костяшки пяточной кости в 25% раствор Quadrol (20 мл) в трясущийся стол при температуре 37 °C на 1 день и смените жидкость один раз.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время обесцвечивания связано с содержанием гема в ткани. Обратите внимание на цвет лечебной жидкости, так как глубина цвета указывает на необходимость продолжения процедуры замены жидкости. - Окрашивание EdU: Промыть образцы в 1× PBS в течение 5 мин (три раза), а затем погрузить их в коктейль для маркировки на 1 день. После этого образцы промывают в 1× ПБС в течение 1 ч (трижды).
- Обезжиривание и обезвоживание тканей
- Поместите ткани в растворы 30% tB, 50% tB и 70% tB последовательно, чтобы добиться уменьшения градиента на встряхивающем столе при 37 °C. Поместите в каждую концентрацию примерно на 2 часа.
- Затем образцы обезвоживают в растворе TB-PEG в течение 6 ч на встряхивающем столе при 37 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вышеуказанное время обработки может быть увеличено или уменьшено в зависимости от количества ткани.
- Прозрачность ткани: Поместите полностью обезвоженную ткань в раствор BB-PEG на встряхивающий стол при температуре 37 °C (2-4 ч) до прозрачности. В настоящее время образцы могут храниться до 1-2 лет.
ПРИМЕЧАНИЕ: После почти полного очищения откройте крышку пробирки, чтобы обнажить образцы, а среда проветривается встряхиванием, чтобы еще больше улучшить прозрачность. Этот метод подходит для улучшения прозрачности отдельных тканей и органов, а также всей головы и тела молодых мышей. Однако для прозрачности всего тела взрослых мышей вышеуказанные шаги следует выполнять методом перфузии полного цикла.
8. Визуализация
ПРИМЕЧАНИЕ: В данном исследовании для 3-D визуализации прозрачных тканей использовалась конфокальная микроскопия. Для этого протокола также подходит световая микроскопия. Несколько операционных систем были проверены как доступные ранее. В качестве примера взята операционная система лазерного конфокального микроскопа (см. таблицу материалов).
- В соответствии с руководством пользователя, выполните правильные действия, чтобы открыть интерфейс управления лазерной конфокальной автофокусировкой и автофокусировкой LAS. Включите необходимый лазер в разных каналах съемки, и отрегулируйте мощность. Установите оптический путь и соответствующую длину волны, 561 нм для ализарина красного и 488 нм для кальцеинового зеленого, любой из которых используется для сигнала EdU в соответствии с маркировочным коктейлем.
- Поместите прозрачные образцы в вогнутую стеклянную чашку Петри, в которой можно хранить толстые образцы, встраиваемые коробки или самодельные устройства для размещения, такие как водостойкий клей, для погружения прозрачных образцов в прозрачную жидкость.
- Выберите маломощный объектив, чтобы быстро найти образец. Сделайте обзор всей ткани черепной клетки с помощью функции быстрого сканирования и найдите интересующую область для визуализации.
- Установите выходную мощность, выберите режим сканирования и сначала отрегулируйте коэффициенты съемки (разрешение, скорость сканирования, коэффициент масштабирования, качество изображения, средний фоновый шум и т. д.).
ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, интеллектуальное усиление находится в диапазоне от 500 до 800 (изменение как сигнала, так и шума); Интеллектуальное смещение максимально близко к 0, обеспечивая при этом качество изображения (для уменьшения фонового шума). Когда коэффициент усиления ФЭУ выше 800 или коэффициент усиления HyD больше 100%, а яркость все еще недостаточна, интенсивность лазера можно соответствующим образом увеличить, но в принципе, чем ниже, тем лучше. - Задайте осевое расстояние Z диапазона и шаг Z, который углубляется вниз с самой мелкой стороны прозрачной организации; То есть установить самую глубокую и самую мелкую стороны.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подтвердите классификацию и рабочее расстояние для каждого объектива. Тщательно устанавливайте диапазон Z и не работайте на рабочем расстоянии, превышающем предел выбранного объектива. "z-Galvo" может быть выбран, когда требуется тонкая регулировка. - Снова установите параметры съемки и начните съемку. После завершения объедините и обработайте изображения через многофункциональный модуль. Наконец, сохраните и выключите прибор в указанном порядке.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
С помощью этого протокола была создана мышиная модель расширения сагиттального шва (рис. 1-2). Для 3D-визуализации изменений при моделировании костей после наложения шва метод очистки тканей PEGASOS был применен ко всей пяточной кости после расширения. После перфузии отделяли костные кости пятки (рис. 3А) и продолжали соответствующий процесс PEGASOS (табл. 1 и табл. 2). Примечательно, что голочные кости стали почти прозрачными после полного процесса PEGASOS, независимо от того, проводилась ли декальцинация (рис. 3B, C).
Для быстрой визуализации изменений после расширения использовали микроКТ на собранных и фиксированных образцах. По сравнению с контрольной группой (рис. 4А) черепной шов постепенно и значительно расширялся после приложения силы в течение 1 суток (рис. 4Б). К пятым суткам на костном крае появились пушистые костные выступы (рис. 4В).
Для трехмерной визуализации скорости сопоставления минерализации во всем шве после расширения был использован метод двойного мечения наряду с эффективным методом PEGASOS, даже на недекальцинированных костях черепной кости (рис. 5). В физиологических условиях наблюдались незначительные изменения между предшествующими сигналами мечения (рис. 5А), в то время как силовая нагрузка значительно активировала остеогенез. Зигзагообразный рисунок недавно минерализованной кости, помеченный одним кальциевым желто-зеленым маркером, расширялся после расширения в течение 7 дней (рис. 5B, C). При трехмерной визуализации с высоким разрешением изменения характера краевых костей указывали на процесс ремоделирования кости после расширения шва, а степень новообразованной кости варьировалась с двух сторон швов (рис. 5C).
Кроме того, для визуализации скорости пролиферации клеток при расширении шва была предпринята попытка полного включения EdU с использованием метода очистки тканей PEGASOS с процессом кальцификации. Успешное мечение оказалось эффективным и хорошо сохранилось в очищенных тканях. В контрольной группе несколько клеток EdU+ были диффузно распределены по швам (рис. 6A), что может быть важно для физиологического ремоделирования кости и, возможно, упущено из виду при 2-D секционировании. При расширении в течение 1 дня пролиферирующие клетки достигали пика в середине и краях швов (рис. 6B). По мере того, как шов расширялся, количество пролиферирующих клеток уменьшалось с течением времени, достигнув 7-го дня (рис. 6C). Выделенные клетки представляли собой небольшие круглые клетки в костном мозге, что указывало на клетки крови, которые отличались от шовных клеток EdU+ (рис. 6C).
Рисунок 1: Жизненно важные материалы были подготовлены для операции. Удерживающие держатели изготавливались из проволоки из нержавеющей стали. Их диаметр составлял 2 мм, а хвосты 1 мм были зарезервированы с двух сторон (А). Применялась прижимная пружина с диаметром проволоки 0,2 мм, наружным диаметром 1,5 мм, интервалом 1 мм (B). Растягивающее усилие определялось динамометром (C,D). В этом эксперименте сжатие пружины на 1 мм давало тягу около 30 g (E). Из клочков бумаги были вырезаны воздушные змеи диаметром 2 мм для использования в качестве барьеров (F). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Хирургический процесс для модели мыши с расширением шва. После переворачивания клапана кислотное травление (А), а также склеивание (В) выполнялось в том месте, где должны были быть обнажены ретенционные держатели. После сброса лоскута кожи головы (С) держатели выставлялись в отмеченном положении (D). Между двумя держателями была установлена пружина для оказания силы расширения на шов, и два клочка бумаги были закреплены на обоих концах пружины в качестве барьеров (E, F) после того, как убедились, что держатели надежно склеены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Процедура очистки тканей PEGASOS была применена для двух костей головки с декальцинацией или без нее. После перфузии были отделены костные кости пяточной железы, к которым были прикреплены некоторые окровавленные и мягкие ткани (А). Костные кости, подвергшиеся процессу декальцификации (В) или без декальцинации (С), были почти полностью прозрачными после всего процесса PEGASOS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Швы на головке постепенно расширялись после приложения растягивающей силы. МкКТ-изображения сагиттального шва без силовой нагрузки (А) и после форс-нагрузки в течение 1 суток и 5 дней (В, С). Масштабная линейка: 100 мкм. Exp = расширение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Остеогенез активируется после расширения шва на 3-D изображениях. (А-С) Трехмерная визуализация сагиттальных швов с двойной меткой, очищенных методом PEGASOS. Ализарин красный и кальцеин зеленый вводили внутрибрюшинно в течение ночи перед расширением и перед эвтаназией после расширения в течение 7 дней (В,С) соответственно по сравнению с контрольной группой без механической нагрузки в те же моменты времени (А). Для эффективного получения изображений всего шва (A,B) использовалась 5-кратная линза, а изображение коробки в (B) было увеличено в (C, C', C'') с помощью 10-кратной линзы. Масштабная линейка в A,B: 100 мкм, C: 150 мкм. Exp = расширение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Шовные клетки, сильно пролиферированные при растягивающей силе на 3-D изображениях. Анализ инкорпорирования всего тела в сочетании с методом очистки тканей PEGASOS показал пролиферирующие клетки во всей шовной нити в состоянии покоя (А) или после принудительной нагрузки в течение 1 дня и 7 дней (В, С). Снимок сделан с помощью 10-кратного объектива. Пунктирными линиями очерчиваются два края для сагиттальных швов. Масштабная линейка: 100 мкм. Exp = расширение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
| Процессов | Решения | Время и температура |
| 1. Внутрибрюшинная инъекция | 1 мг/10 г EdU | За 2 ч до усыпления мышей |
| 2. Перфузия | 0,02% гепарина и 0,05 моль/л ЭДТА | / |
| 3. Фиксация | 4% ПФА | Ночевка, 4 °C |
| 4. Декальцинация | 10% ЭДТА | 2 дня, 37 °C |
| 5. Обесцвечивание | 25% Квадрол | 1 день, 37 °C |
| 6. Окрашивание EdU | Маркировка коктейлей | 1 день, RT |
| 7. Обезжиривание | 30% трет-бутанола | 2 ч, 37 °C |
| 50% трет-бутанола | 2 ч, 37 °C | |
| 70% трет-бутанола | 2 ч, 37 °C | |
| 8. Обезвоживание | Раствор TB-PEG | 3 ч*2, 37 °C |
| 9. Клиринг | Раствор BB-PEG | 2 ч, 37 °C |
Таблица 1: Процедура очистки тканей костей железа PEGASOS с окрашиванием EdU.
| Процессов | Решения | Время и температура |
| 1. Внутрибрюшинная инъекция | 20 мг/кг ализарин красный | Ночь перед расширением |
| 2. Внутрибрюшинная инъекция | 5 мг/кг кальцеина | Ночь перед сбором |
| 3. Перфузия | 0,02% гепарина и 0,05 моль/л ЭДТА | / |
| 4. Фиксация | 4% ПФА | Ночевка, 4 °C |
| 5. Обесцвечивание | 25% Квадрол | 1 день, 37 °C |
Таблица 2: Процедура очистки тканей голцовых костей PEGASOS с двойным мечением минерализованных костей кальцеином зеленым и ализариновым красным.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы применили стандартную мышиную модель расширения шва для наблюдения за регулярными морфологическими изменениями, которые происходят каждую неделю в течение всего месячногоцикла ремоделирования. Эта модель полезна для исследования ремоделирования и регенерации костной ткани путем расширения шовных швов, а также для изучения различных шовных клеток in vivo. Чтобы в полной мере представить результаты таких исследований, необходима трехмерная визуализация окрашенных тканей. Таким образом, технология PEGASOS, известная своей эффективностью в очистке твердых тканей19,20, была объединена с двойным мечением и окрашиванием EdU, чтобы выявить расширенную скорость минерализации и пролиферацию клеток в процессе расширения.
Что касается операции по расширению шва, одним из ключевых этапов является склеивание стопорного кольца. Чтобы обеспечить прочное сцепление с поверхностью кости, мы стандартизировали процесс кислотного травления и склеивания в нижней части фиксирующего кольца. Небольшие петли на фиксирующем кольце должны быть перпендикулярны поверхности кости и соответствовать небольшим отверстиям на коже головы. После наложения швов на кожу головы небольшие петли следует выставить на поверхность кожи через небольшие отверстия в естественном и сбалансированном состоянии, чтобы избежать разрушения удерживающего кольца во время установки силовой пружины и направляющей проволоки, что может привести к неудаче операции. Кроме того, выбор подходящей пружины, прикладывающей усилие, жизненно важен для успешной операции, поскольку она упрощает установку пружины, предотвращая падение удерживающего кольца и достижение запланированного приложения усилия.
По сравнению с предыдущими моделями, эта модель имеет ряд преимуществ. Во-первых, он препятствует образованию круглых костных дефектов в теменной кости, сохраняя режим активации клеток. Кроме того, усилие может быть устранено в любое время, разобрав пружину, что делает ее пригодной для создания модели рецидива после растяжения напряжения. Удобство разборки пружины также обеспечивает минимальное вторичное повреждение подопытных животных. Кроме того, механическую величину растягивающего напряжения можно легко отрегулировать, изменив усилие пружины. Важно отметить, что эта модель поддерживает естественную физиологическую среду вокруг черепного шва, обеспечивая тем самым точность экспериментальных результатов.
Однако у этой модели расширения есть некоторые ограничения. Во-первых, существует риск падения удерживающего кольца при чрезмерном усилии. Новичкам следует провести предварительные учения при весенней установке, чтобы снизить этот риск. Во-вторых, существует риск инфицирования при вскрытии скальпа и обнажении черепа, поэтому необходима дезинфекция инструментов, а сокращение продолжительности операции полезно для заживления. Чрезмерная анестезия также может привести к гибели мышей.
Что касается пассивного метода PEGASOS, то он применим для достижения прозрачности в отдельных тканях и органах, а также во всей голове и теле молодых мышей. Несмотря на то, что он эффективен для целых костей черепной железы, требуется более длительное время обработки для более крупных образцов, особенно для цельных костных тканей или объемных длинных костных тканей с суставами. Важно отметить, что декальцинацию тканей не следует проводить при использовании протокола двойного мечения, так как это мешает процессу окрашивания. Метод очистки тканей PEGASOS также является гибким, позволяя комбинировать его с различными методами мечения, не ограничиваясь включением EdU или двойной мечением кальция, но также эндогенной флуоресценцией в трансгенных моделях мышей или окрашиванием красителем или антителами по всему массиву, все с хорошо сохраненной флуоресценцией.
Обладая стабильными эффектами и высокой повторяемостью, эта модель расширения шва подходит для различных линий трансгенных мышей разного возраста. Возможность регулировать величину растягивающего напряжения и снимать усилие в любое время позволяет удобно исследовать рецидив после стресс-стимуляции. Комбинируя метод двойного мечения минерализованных костей с техникой очистки тканей PEGASOS, мы можем наблюдать трехмерное пространственно-временное распределение стволовых клеток черепного шва во время ремоделирования кости, что позволяет в дальнейшем исследовать взаимосвязь между SUSC и механическим напряжением, а также его специфические механизмы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Благодарим за лабораторную платформу и помощь Институт уха Шанхайского университета Цзяотун на медицинском факультете. Эта работа была поддержана Шанхайской программой Пуцзян (22PJ1409200); Национальный фонд естественных наук Китая (No 11932012); Научно-исследовательский фонд Шанхайской девятой народной больницы, Медицинский факультет Шанхайского университета Цзяотун; Финансирование программы фундаментальных исследований Девятой народной больницы при Медицинской школе Шанхайского университета Цзяотун (JYZZ154).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37% Acid etching | Xihubiom | E10-02/1807011 | |
| Alizarin red | Sigma-Aldrich | A3882 | |
| AUSTRALIAN WIRE | A.J.WILCOCK | 0.014'' | |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | B6630 | |
| Calcein green | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Copper(II) sulfate, anhydrous | Sangon Biotech | A603008 | |
| Dynamometer | Sanliang | SF-10N | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| EdU | Invitrogen | E104152 | |
| Laser Confocal Microscope | Leica | SP8 | |
| PBS | Sangon Biotech | E607008 | |
| PEG-MMA 500 | Sigma-Aldrich | 447943 | |
| PFA | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| pH Meters | Mettler Toledo | S220 | |
| Quadrol | Sigma-Aldrich | 122262 | |
| Sodium Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| Sodium bicarbonate | Sangon Biotech | A500873 | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A610476 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Spring | TAOBAO | 0.2*1.5*1*7 | |
| Sulfo-Cyanine3 azide | Lumiprobe | A1330 | |
| tert-Butanol | Sigma-Aldrich | 360538 | Protect from light. Do not freeze. |
| Transbond MIP Moisture Insensitive Primer |
3M Unitek | 712-025 | |
| Transbond XT Light Cure Adhesive Paste |
3M Unitek | 712-035 | |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | V900257 | |
| Tris-buffered saline | Sangon Biotech | A500027 |
References
- Opperman, L. A. Cranial sutures as intramembranous bone growth sites. Developmental Dynamics. 219 (4), 472-485 (2000).
- Thenier-Villa, J. L., Sanromán-Álvarez, P., Miranda-Lloret, P., Plaza Ramírez, M. E. Incomplete reossification after craniosynostosis surgery-incidence and analysis of risk factors: a clinical-radiological assessment study. Journal Of Neurosurgery-pediatrics. 22 (2), 120-127 (2018).
- Markiewicz, M. R., Recker, M. J., Reynolds, R. M. Management of sagittal and lambdoid craniosynostosis: open cranial vault expansion and remodeling. Oral And Maxillofacial Surgery Clinics Of North America. 34 (3), 395-419 (2022).
- Mao, J. J., Wang, X., Kopher, R. A. Biomechanics of craniofacial sutures: orthopedic implications. Angle Orthodontist. 73 (2), 128-135 (2003).
- Shayani, A., Sandoval Vidal, P., Garay Carrasco, I., Merino Gerlach, M. Midpalatal suture maturation method for the assessment of maturation before maxillary expansion: a systematic review. Diagnostics (Basel). 12 (11), 2774 (2022).
- Suzuki, H., et al. Miniscrew-assisted rapid palatal expander (MARPE): the quest for pure orthopedic movement. Dental Press Journal Of Orthodontics. 21 (4), 17-23 (2016).
- Yu, M., et al. Cranial suture regeneration mitigates skull and neurocognitive defects in craniosynostosis. Cell. 184 (1), 243-256 (2021).
- Roth, D. M., Souter, K., Graf, D. Craniofacial sutures: Signaling centres integrating mechanosensation, cell signaling, and cell differentiation. European Journal of Cell Biology. 101 (3), 151258 (2022).
- Zhao, H., et al. The suture provides a niche for mesenchymal stem cells of craniofacial bones. Nature Cell Biology. 17 (4), 386-396 (2015).
- Jing, D., et al. Response of Gli1(+) suture stem cells to mechanical force upon suture expansion. Journal of Bone And Mineral Research. 37 (7), 1307-1320 (2022).
- Xu, Y., Malladi, P., Chiou, M., Longaker, M. T. Isolation and characterization of posterofrontal/sagittal suture mesenchymal cells in vitro. Plastic and Reconstructive Surgery. 119 (3), 819-829 (2007).
- Kong, L., et al. Isolation and characterization of human suture mesenchymal stem cells in vitro. International Journal of Stem Cells. 13 (3), 377-385 (2020).
- Ikegame, M., et al. Tensile stress induces bone morphogenetic protein 4 in preosteoblastic and fibroblastic cells, which later differentiate into osteoblasts leading to osteogenesis in the mouse calvariae in organ culture. Journal of Bone And Mineral Research. 16 (1), 24-32 (2001).
- Liu, S. S., Opperman, L. A., Buschang, P. H. Effects of recombinant human bone morphogenetic protein-2 on midsagittal sutural bone formation during expansion. American Journal of Orthodontics And Dentofacialorthopedics. 136 (6), 768-769 (2009).
- Liang, W., Ding, P., Li, G., Lu, E., Zhao, Z. Hydroxyapatite nanoparticles facilitate osteoblast differentiation and bone formation within sagittal suture during expansion in rats. Drug Design Development and Therapy. 15, 905-917 (2021).
- Morinobu, M., et al. Osteopontin expression in osteoblasts and osteocytes during bone formation under mechanical stress in the calvarial suture in vivo. Journal of Bone And Mineral Research. 18 (9), 1706-1715 (2003).
- Hwang, S., Chung, C. J., Choi, Y. J., Kim, T., Kim, K. H. The effect of cetirizine, a histamine 1 receptor antagonist, on bone remodeling after calvarial suture expansion. Korean Journal of Orthodontics. 50 (1), 42-51 (2020).
- Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).
- Jing, D., et al. Tissue clearing and its application to bone and dental tissues. Journal of Dental Research. 98 (6), 621-631 (2019).
- Luo, W., et al. Investigation of postnatal craniofacial bone development with tissue clearing-based three-dimensional imaging. Stem Cells Development. 28 (19), 1310-1321 (2019).
