Summary
Dieses Protokoll stellt ein standardisiertes Nahtexpansions-Mausmodell und eine 3D-Visualisierungsmethode vor, um die mechanobiologischen Veränderungen der Naht und des Knochenumbaus unter Zugkraftbelastung zu untersuchen.
Abstract
kraniofaziale Nähte spielen eine entscheidende Rolle, die nicht nur fibröse Gelenke sind, die kraniofaziale Knochen verbinden. Sie dienen auch als primäre Nische für das Wachstum von Schädel- und Gesichtsknochen und beherbergen mesenchymale Stammzellen und Osteoprogenitoren. Da sich die meisten kraniofazialen Knochen durch intramembranöse Ossifikation entwickeln, fungieren die Randregionen der Nähte als Initiationspunkte. Aufgrund dieser Bedeutung sind diese Nähte zu faszinierenden Zielen in orthopädischen Therapien wie der federunterstützten Schädelgewölbeerweiterung, der schnellen Oberkiefererweiterung und der Oberkieferprotraktion geworden. Unter orthopädischer Rückverfolgungskraft werden die Stammzellen der Naht schnell aktiviert und werden zu einer dynamischen Quelle für den Knochenumbau während der Expansion. Trotz ihrer Bedeutung sind die physiologischen Veränderungen während des Knochenumbaus nach wie vor unzureichend verstanden. Herkömmliche Schnittmethoden, vor allem in sagittaler Richtung, erfassen nicht die umfassenden Veränderungen, die über die gesamte Naht auftreten. In dieser Studie wurde ein Standard-Mausmodell für die sagittale Nahtexpansion etabliert. Um die Veränderungen des Knochenumbaus nach der Nahtexpansion vollständig sichtbar zu machen, wurde die PEGASOS-Methode zur Gewebereinigung mit einer Whole-Mount-EdU-Färbung und einer Calcium-Chelat-Doppelmarkierung kombiniert. Dies ermöglichte die Visualisierung von stark proliferierenden Zellen und die Neubildung von Knochen über den gesamten Schädelknochen nach der Expansion. Dieses Protokoll bietet ein standardisiertes Nahtexpansionsmodell und eine 3D-Visualisierungsmethode, die Aufschluss über die mechanobiologischen Veränderungen in Nähten und den Knochenumbau unter Zugkraftbelastung gibt.
Introduction
kraniofaziale Nähte sind fibröse Gewebe, die kraniofaziale Knochen verbinden und eine wesentliche Rolle beim Wachstum und Umbau kraniofazialer Knochen spielen. Die Struktur der Naht ähnelt einem Fluss und sorgt für einen Fluss von Zellressourcen, um das "Flussufer" zu nähren und aufzubauen, die als osteogene Fronten bekannt sind und über intramembranöse Osteogenese zur Bildung kraniofazialer Knochen beitragen1.
Das Interesse an kraniofazialen Nähten wurde durch die klinische Notwendigkeit vorangetrieben, den vorzeitigen Verschluss von Schädelnähten und die Dysfunktion der Gesichtsnähte zu verstehen, die zu kraniofazialen Deformitäten und sogar lebensbedrohlichen Zuständen bei Kindern führen können. Die offene Nahtektomie wird routinemäßig in der klinischen Behandlung eingesetzt, aber die Langzeitnachsorge hat bei einigen Patienten ein unvollständiges Rezidiv der Reossifikation gezeigt2. Die minimalinvasive Kraniotomie mit Hilfe von Dehnungsfedern oder die endoskopische Streifenkraniektomie kann einen sichereren Ansatz zur Erhaltung der potenziellen Naht bieten, anstatt das Gewebe zu verwerfen3. In ähnlicher Weise wurden orthopädische Therapien wie Gesichtsmasken und Expansionsapparaturen häufig zur Behandlung von sagittaler oder horizontaler Oberkieferhypoplasie eingesetzt, wobei einige Studien die Altersbeschränkung auf die Behandlung erwachsener Patienten mit Minischrauben-assistierten Gaumenexpandern ausweiteten 4,5,6. Darüber hinaus ist die Regeneration von Schädelnähten mit mesenchymalen Stammzellen (MSCs) in Kombination mit biologisch abbaubaren Materialien eine potenzielle Therapie in der Zukunft, die eine neue Richtung für die Behandlung verwandter Krankheiten bietet7. Der Funktionsprozess oder der Regulationsmechanismus von Nähten bleibt jedoch schwer fassbar.
Der Knochenumbau besteht hauptsächlich aus einem Gleichgewicht zwischen der Knochenbildung durch Osteoblasten und der Knochenresorption durch Osteoklasten, wobei die osteogene Differenzierung von Stammzellen, die durch mechanische Signale stimuliert wird, eine wichtige Rolle spielt. Nach jahrzehntelanger Forschung wurde festgestellt, dass kraniofaziale Nähte hochplastische mesenchymale Stammzellnischen sind8. Nahtstammzellen (SuSCs) sind eine heterogene Gruppe von Stammzellen, die zu mesenchymalen Stammzellen (MSCs) oder Knochenstammzellen (SSCs) gehören. SuSCs werden in vivo durch vier Marker markiert, darunter Gli1, Axin2, Prrx1 und Ctsk. Insbesondere Gli1+ SuSCs haben die biologischen Eigenschaften von Stammzellen streng verifiziert und zeigen nicht nur eine hohe Expression typischer MSC-Marker, sondern auch ein hervorragendes osteogenes und chondrogenes Potenzial9. Frühere Forschungen haben gezeigt, dass Gli1+ SuSCs aktiv zur Knochenneubildung unter Zugkraft beitragen und sie als Nahtstammzellquelle identifizieren, die die Distraktionsosteogenese unterstützt10.
In der Vergangenheit wurden umfangreiche mechanische Eigenschaften von Stammzellen in vitro mit Flexcell, Vier-Punkt-Biegung, Mikromagnet-Belastungssystem und anderen untersucht. Obwohl in vitro mesenchymale Zellen aus der Schädelnaht von Mäusen identifiziert wurden 11 und auch mesenchymale Stammzellen aus menschlichem Naht kürzlich isoliert wurden12, bleibt die biomechanische Reaktion von Nahtzellen im In-vitro-System unklar. Um den Knochenumbauprozess weiter zu untersuchen, wurde ein Nahtexpansionsmodell auf der Grundlage isolierter Calvaria-Organkulturen etabliert, das den Weg für die Etablierung eines nützlichen in vivo Nahtexpansionsmodells ebnet 1,13. Kaninchen14 und Ratten15 sind die am häufigsten verwendeten Tiere in der Grundlagenforschung für die Nahterweiterung. Mäuse sind jedoch aufgrund ihres hochgradig homologen Genoms mit dem Menschen, zahlreicher Genmodifikationslinien und ihrer starken reproduktiven Hybridisierungsfähigkeit bevorzugte Tiermodelle für die Erforschung menschlicher Krankheiten. Bestehende Mausmodelle der kranialen Nahterweiterung stützen sich typischerweise auf kieferorthopädische Federdrähte aus Edelstahl, um Zugkraft auf die sagittale Naht auszuüben16,17. Bei diesen Modellen werden zwei Löcher in jede Seite der Scheitelknochen gebohrt, um das Expansionsgerät zu fixieren, und die Drähte sind unter der Haut eingebettet, was den Zellaktivierungsmodus beeinträchtigen kann.
Was die Visualisierungsmethode betrifft, so hat sich die zweidimensionale Betrachtung von Schichten in sagittaler Richtung seit Jahrzehnten durchgesetzt. In Anbetracht der Tatsache, dass der Knochenumbau ein komplexer dreidimensionaler dynamischer Prozess ist, ist es jedoch dringend erforderlich, vollständige dreidimensionale Informationen zu erhalten. Um diese Anforderung zu erfüllen, wurde die PEGASOS-Technik der Gewebetransparenz entwickelt18,19. Es bietet einzigartige Vorteile für die Transparenz von Hart- und Weichgewebe und ermöglicht es, den gesamten Knochenumbauprozess im dreidimensionalen Raum zu reproduzieren.
Um ein tieferes und umfassenderes Verständnis der physiologischen Veränderungen in den Knochenumbauperioden zu erlangen, wurde ein Standard-Sagittal-Nahtexpansions-Mausmodell mit einer Federeinstellung zwischen den handgefertigten Haltern etabliert10. Mit einem standardisierten Säureätz- und Klebeverfahren konnte die Expansionsvorrichtung fest mit dem Schädelknochen verbunden werden, wodurch eine Zugkraft senkrecht zur sagittalen Naht erzeugt wurde. Darüber hinaus wurde die PEGASOS-Methode zur Gewebereinigung nach doppelter Markierung des mineralisierten Knochens nach der Expansion angewendet, um die Veränderungen der Knochenmodellierung nach der Nahtexpansion vollständig sichtbar zu machen.
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Protocol
Alle hier beschriebenen experimentellen Verfahren wurden vom Animal Care Committee des Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (SH9H-2023-A616-SB) genehmigt. In dieser Studie wurden 4 Wochen alte männliche C57BL/6-Mäuse verwendet. Alle verwendeten Instrumente wurden vor dem Eingriff sterilisiert.
1. Erstellung des Nahtaufweitungsmodells
- Vorbereitung von zwei Retentionshaltern.
- Verwenden Sie 0,014'' australischen Draht oder Edelstahldraht (siehe Materialtabelle), um mit einer leichten Drahtzange eine spiralförmige Schlaufe herzustellen. Der Durchmesser der Schlaufe beträgt 2 mm, und 1 mm Schwanz ist auf zwei Seiten reserviert (Abbildung 1A).
- Sterilisieren Sie die Drähte und Halterungen für die Operation in einem Autoklaven, Plasmasterilisator oder einem geeigneten Kaltsterilisationsmittel (z. B. Glutaraldehyd).
- Vorbereitung der Federn.
- Bereiten Sie kundenspezifische Federn aus Edelstahl vor.
HINWEIS: In dieser Studie wird die Druckfeder mit 0,2 mm Drahtdurchmesser, 1,5 mm Außendurchmesser, 1 mm Zwischenraum und 7 mm Länge verwendet (Abbildung 1B). Jede 1 mm Federkompression erhielt einen Schub von ca. 30 g. - Schneiden Sie die Feder vor dem Einsetzen auf eine verfügbare Länge. Bestätigen Sie die Kraft für die spezielle Feder vor dem Experiment.
ANMERKUNG: Die Größen der Federn werden variiert, solange die Kraftgröße in parallelen Experimenten gleich ist. Die Kraft wird mit einem uniaxialen Tischprüfgerät oder einem kleinen elektronischen Leistungsprüfstand (siehe Werkstofftabelle) gemessen, wenn der Zustand begrenzt ist. Die Längenänderung wird auf die Kraftgröße ausgewertet (Abbildung 1C-E). Insbesondere ist es notwendig, den Wert der Federkraftbelastung basierend auf dem Alter, dem Knochenzustand der Maus und den Forschungsobjekten zu ändern. - Bereiten Sie einen geraden australischen Draht oder geraden Stahldraht von 7 mm Länge vor und stellen Sie zwei Blätter Papier mit einem Durchmesser von 2 mm her, die als Barrieren verwendet werden (Abbildung 1F).
- Bereiten Sie kundenspezifische Federn aus Edelstahl vor.
2. Sagittale Nahterweiterungsoperation
- Anästhesie: Betäuben Sie die Mäuse mit Tiletamin (25 mg/kg), Zolazepam (25 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg). Tragen Sie gleichzeitig eine sterile Augensalbe auf die Augen auf, um ein Austrocknen der Hornhaut zu verhindern. Beurteilen Sie die Narkosetiefe der Mäuse durch eine Zehenkneife.
HINWEIS: Die folgenden Merkmale deuten darauf hin, dass die Maus richtig betäubt ist: langsame und gleichmäßige Atmung, Schwäche der Gliedmaßen, Muskelentspannung, Verschwinden des Hautakupunkturreflexes und des Augenlidreflexes sowie schwächerer Hornhautreflex. - Fellentfernung und Desinfektion: Entfernen Sie das Fell am Oberkopf vorsichtig mit Haarentfernungscreme; Vermeiden Sie es, die Augen zu berühren. Kurz darauf abwechselnd Jodophor und 75%igen Alkohol verwenden, um die Operationsstelle zu desinfizieren. Verabreichen Sie den Mäusen Meloxicam (1 mg/kg) als Analgesie durch subkutane Injektion.
- Fixierung der Körperposition: Legen Sie die Maus auf die Vorderseite und fixieren Sie die Gliedmaßen mit chirurgischen Bändern auf dem Operationstisch.
- Offenen Kopfhautlappen: Verwenden Sie eine chirurgische Schere, um einen bogenförmigen Lappen entlang der Kopfhaut in der Nähe des Halses der Maus durchzuführen, der die sagittale Naht und den umgebenden Schädel vollständig freilegt. Danach fixieren Sie den Kopfhautlappen mit einer 6-0-Naht auf dem Operationstisch.
- Verkleben Sie die Retentionshalter nach dem Säureätzen.
- Trocknen Sie den Schädel und ätzen Sie ihn 20 Sekunden lang mit 37%iger Phosphorsäure und verwenden Sie normale Kochsalzlösung, um die Säureätzung zu reinigen (Abbildung 2A). Nach dem Trocknen des Schädels mit dem Gummipipettenkolben sind kalkhaltige Rückstände sichtbar.
- Zementieren Sie die beiden Halter (vorbereitet in Schritt 1.1) auf beiden Seiten der Scheitelknochen 3 mm von den sagittalen Nähten entfernt mit einem lichthärtenden Klebstoff (Abbildung 2B).
- Setzen Sie die Kopfhautklappe zurück.
- Setzen Sie den Kopfhautlappen manuell wieder ein (Abbildung 2C). Beschriften Sie die Position der Halter, schneiden Sie zwei kleine Löcher in die Kopfhaut an der entsprechenden Position der beidseitigen Retentionshalter und setzen Sie dann die flatternde Kopfhaut zurück.
- Führen Sie gleichzeitig die kleinen Schlaufen durch die Löcher, um die Hautoberfläche freizulegen. Vernähen Sie den gekrümmten Schnitt mit einer 6-0-Naht (Abbildung 2D). Für die Regeneration der Haut sind ein bis drei Tage vorgesehen. Meloxicam (1 mg/kg) wird den Mäusen 1 bis 3 Tage lang alle 24 h subkutan injiziert.
HINWEIS: Überprüfen Sie nach der Operation täglich die Aktivität der Mäusekopfhaut und ob die Halter abfallen. Es gibt verschiedene Hauttypen in Bezug auf Farbe und Dicke; Die gesunde Kopfhaut behält die ursprüngliche Farbe bei, und die Hautränder verschmelzen nach dem Nähen allmählich miteinander. Wenn eine Infektion der Kopfhaut festgestellt wird oder wenn das chirurgische Gerät abgefallen ist, entfernen Sie die Maus aus der Studie und euthanasieren Sie sie.
- Bringen Sie die Feder und den Führungsdraht an.
- Schneiden Sie die Feder 1 mm länger als den Abstand zwischen den beiden Haltern.
- Drücken Sie die gewählte Druckfeder zusammen und platzieren Sie sie zwischen den kleinen Windungen auf beiden Seiten.
- Führen Sie den Edelstahldraht durch die kleinen Windungen und die Feder und lassen Sie die Feder los, um einen Anfangsschub von etwa 30 g zu erhalten.
- Vergewissern Sie sich, dass die Kopfhaut unter dem Federbereich der Maus nicht komprimiert ist.
- Nachdem Sie sich vergewissert haben, dass die Verklebung fest und locker ist, kleben Sie zwei Papierschnipsel zwischen der Feder und den Haltern mit einem lichthärtenden Klebstoff, um an beiden Enden der Feder Barrieren zu errichten (Abbildung 2E,F).
3. Doppelte Markierung von mineralisierten Knochen
- Herstellung der Stammlösung.
- Bereiten Sie eine Verdünnungslösung mit destilliertem Wasser vor, die 0,9 % NaCl und 2 % NaHCO3 enthält.
- Verwenden Sie die Verdünnungslösung, um 20 mg/ml Alizarin-Komplex-Dihydrat und 10 mg/ml Calcein herzustellen (siehe Materialtabelle).
- Stellen Sie den pH-Wert mit einem pH-Messgerät auf 7,4 ein. Spülen Sie die pH-Sonde zwischen den Messungen, um genaue Messwerte zu gewährleisten.
- Geben Sie den Farbstoff in einen sterilen Behälter und lagern Sie ihn im Kühlschrank bei 4 °C. Folie wird verwendet, um Licht abzuhalten.
- Bereiten Sie die Arbeitslösung vor. Vor der Injektion wird die Stammlösung mit einer Auflösungslösung auf 1 mg/ml für Calcium und 2 mg/ml für Alizarin-Komplex-Dihydrat verdünnt.
- Intraperitoneal injizieren Sie 5 mg/kg Calceingrün und 20 mg/kg Alizarinrot zu zwei Zeitpunkten, um die mineralisierten Knochen zu markieren und die Veränderungen zwischen zwei Zeitpunkten zu analysieren. Im Allgemeinen werden die Proben 12-14 Stunden nach der Injektion entnommen.
HINWEIS: Erwärmen Sie die Farbstoffe vor der Injektion und stellen Sie sicher, dass die Injektionszeit nicht weniger als 3 Minuten beträgt. Das Injektionsintervall hängt vom Zeitpunkt der Ausdehnung ab. In dieser Studie wurden Alizarinrot und Calceingrün über Nacht (O/N) vor der Expansion bzw. O/N vor der Entnahme injiziert. - Entnahme ganzer Schädelknochen, die für die Gewebereinigung vorbereitet sind, einen Tag nach der zweiten Injektion.
4. EdU-Färbung
- Intraperitoneale Injektion: Intraperitoneale Injektion von EdU 2 h vor der Euthanasie der Mäuse (gemäß institutionell anerkannten Protokollen). Die Dosis beträgt 1 mg/10 g Körpergewicht.
- Zubereitung des Etikettiercocktails: Mischung von Tris-gepufferter Kochsalzlösung (100 mmol/L final, pH 7,6), CuSO4 (4 mmol/L final), Sulfo-Cyanin-3-Azid (2-5 μmol/L final) und Natriumascorbat (100 mmol/L final, bei jedem Gebrauch frisch gemacht) (siehe Materialtabelle).
- EdU-Whole-Mount-Färbung: Nach dem Schritt der Gewebeentfärbung bei der PEGASOS-Gewebereinigungsmethode (Schritt 7) werden die Proben für 1 Tag bei Raumtemperatur (RT) in den Markierungscocktail gegeben.
5. Mikro-Computertomographie-Bildgebung
- Gewebefixierung und -lagerung: Fixieren Sie die Schädelknochen in 4 % Paraformaldehyd (PFA) bei 4 °C O/N und lagern Sie sie vor dem Scannen in 0,5 % PFA.
- Scannen und Analysieren: Scannen Sie die Proben mit einem Mikro-Computertomographen (μCT)-Bildgebungssystem mit hoher Auflösung und einer Voxelgröße von 7 μm.
6. Herstellung der Arbeitslösung für die PEGASOS-Gewebereinigung
- 4% Polyformaldehyd (PFA): 4 g PFA-Pulver in 1× PBS auf 100 ml auflösen.
- Kardiale Perfusionslösung: 0,02% Heparin, dh 20 mg Heparinpulver, gelöst in 1× PBS bis 100 ml; alternativ können 0,05 mol/l EDTA, d. h. 0,05 mol Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) (siehe Materialtabelle), gelöst in einer entionisierten wässrigen Lösung zu einem Gesamtvolumen von 1 l, verwendet werden.
- Entkalkungslösung: 0,5 mol/L EDTA, d. h. 0,5 mol Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), gelöst in einer deionisierten wässrigen Lösung zu einem Gesamtvolumen von 1 L.
- Entfärbungslösung: 25% Quadrol, das sind 250 ml Quadrol (N, N, N', N' - Tetrakis (2-Hydroxypropyl)ethylendiamin) (siehe Materialtabelle), gelöst in entionisiertem Wasser zu einem Gesamtvolumen von 1 l.
HINWEIS: Aufgrund der Viskosität von Quadrol kann es vor der Konfiguration auf 60 °C erhitzt werden, um seine Fließfähigkeit zu erhöhen. - Entfettungslösung: 30 %, 50 %, 70 % tert-Butanol (tB) (siehe Materialtabelle), hergestellt mit Wasser nach Volumenanteil.
HINWEIS: In Anbetracht der Tatsache, dass reines TB bei Raumtemperatur kristallin ist, muss es auf 60 °C erhitzt werden, bis es sich aufgelöst hat, bevor es verwendet werden kann. Anschließend werden 3 % bis 5 % (v/v) Triethanolamin (TEA) zugegeben, um den pH-Wert der Lösung >9,5 zu regulieren. - Dehydratisierungslösung: TB-PEG-Lösung, 70 % tB + 27 % PEG-MMA + 3 % Quadrol (v/v), wobei PEG-MMA Poly(ethylenglykol)methylethermethacrylat mit einem mittleren Molekulargewicht von 500 (Poly(ethylenglykol)methacrylat 500, PEG-MMA 500) ist (siehe Materialtabelle).
- Transparente Lösung: BB-PEG-Lösung, 75 % BB + 22 % PEG-MMA + 3 % Quadrol (v/v), wobei BB Benzylbenzoat (BB) ist.
7. Transparenz von Schädelknochen mit der PEGASOS-Methode
- Anästhesie der Maus durch intraperitoneale Injektion von Anästhetika (Schritt 2.1) und Beurteilung der Anästhesietiefe der Maus durch die Kneifreaktion, um sicherzustellen, dass es vor der kardialen Perfusion keine Resistenzreaktion gibt.
- Führen Sie eine kardiale Perfusion und Fixierung durch.
- Halten Sie den Bauch der Maus nach oben, fixieren Sie die Gliedmaßen mit Klebeband und schneiden Sie vorsichtig entlang des Umfangs des Brustkorbs, um ihn vollständig freizulegen.
- Unmittelbar nach einem kleinen Schnitt im rechten Vorhof mit einer Augenschere eine Perfusionsnadel 22 G an der Spitze des linken Ventrikels einführen.
HINWEIS: Es wird nur die Nadelspitze eingeführt, um eine Beschädigung der Herzklappe durch übermäßiges Einführen zu vermeiden. Andernfalls gelangt kardiale Perfusionsflüssigkeit in den Lungenkreislauf und beeinträchtigt die Perfusionswirkung des systemischen Kreislaufs. - Schieben Sie die 30-50 ml kardiale Perfusionsflüssigkeit (Schritt 6.2) in die Spritze. Es ist zu sehen, dass die Leber allmählich von einem hellen Rot blass wird.
- Nachdem die ausströmende Flüssigkeit aus dem rechten Vorhof vollständig klar geworden ist, infundieren Sie 4%ige PFA-Lösung in gleichem Volumen. Der Betrieb der PFA-Perfusion erfolgt in einer belüfteten Haube.
- Sezieren und trennen Sie die Gewebe und Organe und fixieren Sie sie über Nacht mit 4% PFA bei 4 °C.
- Gewebeentkalkung: Bei Proben, die durch EdU-Färbung verarbeitet wurden, wird das fixierte Hartgewebe etwa 2 Tage lang in eine 0,5 mol/l EDTA-Lösung (pH 7,0) (10 ml) auf einem Rütteltisch bei 37 °C gelegt und die Flüssigkeit täglich gewechselt.
HINWEIS: Überspringen Sie den Entkalkungsprozess bei der normalisierten PEGASOS-Methode für Kalzium-Chelatbildner-markierte Knochen, um die Signalübertragung vollständig zu erhalten. Eine Entkalkung ist erforderlich, um die Knochen zu behandeln, um die endogene Fluoreszenz oder die immungefärbten Signale des gesamten Mounts sichtbar zu machen. - Gewebeentfärbung: Legen Sie die fixierten Schädelknochen 1 Tag lang in 25%ige Quadrollösung (20 ml) auf einen Rütteltisch bei 37 °C und wechseln Sie die Flüssigkeit einmal.
HINWEIS: Die Entfärbungszeit hängt mit dem Hämgehalt im Gewebe zusammen. Beobachten Sie die Farbe der Behandlungsflüssigkeit, da die Farbtiefe die Notwendigkeit darstellt, die Flüssigkeitsersatzbehandlung fortzusetzen. - EdU-Färbung: Spülen Sie die Proben 5 Minuten lang (dreimal) in 1× PBS und tauchen Sie sie dann 1 Tag lang in den Markierungscocktail ein. Danach spülen Sie die Proben in 1× PBS für 1 h (dreimal).
- Entfettung und Dehydrierung des Gewebes
- Die Gewebe werden nacheinander in Lösungen mit 30 % tB, 50 % tB und 70 % tB eingelegt, um die Gradientenabnahme auf einem Rütteltisch bei 37 °C durchzuführen. In jeder Konzentration für ca. 2 h geben.
- Anschließend werden die Proben in TB-PEG-Lösung für 6 h auf einem Rütteltisch bei 37 °C dehydriert.
HINWEIS: Die oben genannte Verarbeitungszeit kann je nach Anzahl des Gewebes verlängert oder verkürzt werden.
- Gewebetransparenz: Legen Sie das vollständig dehydrierte Gewebe in BB-PEG-Lösung auf einen Schütteltisch bei 37 °C (2-4 h), bis es transparent ist. Derzeit können Proben bis zu 1-2 Jahre gelagert werden.
HINWEIS: Öffnen Sie nach fast vollständiger Reinigung den Röhrchendeckel, um die Proben und das Medium der Luft auszusetzen, indem Sie sie schütteln, um die Transparenz weiter zu verbessern. Diese Methode eignet sich, um die Transparenz einzelner Gewebe und Organe sowie des gesamten Kopfes und Körpers junger Mäuse zu verbessern. Für die Transparenz des gesamten Körpers erwachsener Mäuse sollten die oben genannten Schritte jedoch mit einer Perfusionsmethode über den gesamten Zyklus durchgeführt werden.
8. Bildgebung
HINWEIS: In dieser Studie wurde die konfokale Mikroskopie für die 3D-Visualisierung von transparentem Gewebe verwendet. Auch die Lichtblattmikroskopie ist für dieses Protokoll geeignet. Mehrere Betriebssysteme wurden bereits als verfügbar verifiziert. Hier wird ein konfokales Lasermikroskop-Betriebssystem als Beispiel genommen (siehe Materialtabelle).
- Befolgen Sie gemäß dem Benutzerhandbuch die richtigen Schritte, um die konfokale Laser- und LAS-AF-Bedienoberfläche zu öffnen. Schalten Sie den gewünschten Laser in verschiedenen Aufnahmekanälen ein und passen Sie die Leistung an. Stellen Sie den Strahlengang und die entsprechende Wellenlänge ein, 561 nm für Alizarinrot und 488 nm für Calceingrün, die je nach Markierungscocktail für das EdU-Signal verwendet werden.
- Legen Sie die transparenten Proben in die konkave Petrischale aus Glas, die dicke Proben, Einbettboxen oder selbstgebaute Platzierungsvorrichtungen wie wasserfesten Kleber aufnehmen kann, um die transparenten Proben in eine transparente Flüssigkeit zu tauchen.
- Wählen Sie ein Objektiv mit geringem Stromverbrauch, um die Probe schnell zu lokalisieren. Verschaffen Sie sich mit der Schnellscanfunktion einen Überblick über das gesamte Schädeldachgewebe und finden Sie den gewünschten Bereich für die Bildgebung.
- Stellen Sie die Ausgangsleistung ein, wählen Sie den Scanmodus und passen Sie zunächst die Aufnahmekoeffizienten (Auflösung, Scangeschwindigkeit, Zoomfaktor, Bildqualität, durchschnittliches Hintergrundrauschen usw.) an.
HINWEIS: Im Allgemeinen reicht Smart Gain von 500 bis 800 (sowohl Signal- als auch Rauschänderung); Smart Offset ist so nah wie möglich an 0 und stellt gleichzeitig die Bildqualität sicher (um Hintergrundrauschen zu reduzieren). Wenn die PMT-Verstärkung höher als 800 oder die HyD-Verstärkung größer als 100 % ist und die Helligkeit immer noch unzureichend ist, kann die Laserintensität entsprechend erhöht werden, aber im Prinzip gilt: Je niedriger, desto besser. - Legen Sie den axialen Abstand Z-Bereich und den Z-Schritt fest, der von der flachsten Seite der transparenten Organisation aus aufgerissen wird. Das heißt, setze die tiefsten und flachsten Seiten.
HINWEIS: Bestätigen Sie die Klassifizierung und den Arbeitsabstand für jedes Objektiv. Stellen Sie den Z-Bereich sorgfältig ein und überschreiten Sie nicht den Arbeitsabstand des ausgewählten Objektivs. Der "z-Galvo" kann gewählt werden, wenn eine Feinregulierung erforderlich ist. - Stellen Sie die Aufnahmeparameter erneut ein und beginnen Sie mit der Aufnahme. Nach Fertigstellung werden die Bilder über das Multifunktionsmodul zusammengeführt und verarbeitet. Zum Schluss lagern und schalten Sie das Gerät in der angegebenen Reihenfolge aus.
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Representative Results
Mit Hilfe dieses Protokolls wurde ein Mausmodell für die sagittale Nahtexpansion etabliert (Abbildung 1-2). Für die 3-D-Visualisierung von Knochenmodellierungsveränderungen nach Nahtexpansion wurde die PEGASOS-Tissue-Clearing-Methode auf den gesamten Schädelknochen nach der Expansion angewendet. Nach der Perfusion wurden die Schädelknochen separiert (Abbildung 3A) und der entsprechende PEGASOS-Prozess fortgesetzt (Tabelle 1 und Tabelle 2). Bemerkenswert ist, dass die Schädelknochen nach dem vollständigen PEGASOS-Prozess nahezu transparent wurden, unabhängig davon, ob eine Entkalkung durchgeführt wurde (Abbildung 3B,C).
Um die Veränderungen nach der Expansion schnell sichtbar zu machen, wurde μCT an den gesammelten und fixierten Proben verwendet. Im Vergleich zur Kontrollgruppe (Abbildung 4A) dehnte sich die Schädelnaht nach 1 Tag Krafteinwirkung allmählich und signifikant aus (Abbildung 4B). Am fünften Tag traten flauschige knöcherne Ausstülpungen am Knochenrand auf (Abbildung 4C).
Für die dreidimensionale Visualisierung der Mineralisierungsnebeneinander in der gesamten Naht nach der Expansion wurde die duale Markierungsmethode zusammen mit der effizienten PEGASOS-Technik auch an nicht entkalkten Schädelknochen eingesetzt (Abbildung 5). Unter physiologischen Bedingungen gab es geringfügige Veränderungen zwischen den Vorher-Post-Markierungssignalen (Abbildung 5A), während die Kraftbelastung die Osteogenese signifikant aktivierte. Das Zickzackmuster des neu mineralisierten Knochens, der mit einem einzelnen gelb-grünen Kalziummarker markiert war, verbreiterte sich nach 7 Tagen Ausdehnung (Abbildung 5B, C). In der hochauflösenden dreidimensionalen Visualisierung zeigten die Musteränderungen der marginalen Knochen den Knochenumbauprozess nach der Nahtexpansion an, und der Grad der neu gebildeten Knochen variierte auf zwei Seiten der Nähte (Abbildung 5C).
Um die Proliferationsrate von Zellen bei der Nahtexpansion sichtbar zu machen, wurde außerdem versucht, EdU mit der PEGASOS-Gewebereinigungsmethode mit einem Kalzifizierungsprozess zu inkorporieren. Erfolgreich war die Markierung effizient und gut konserviert in gereinigten Geweben. In der Kontrollgruppe waren mehrere EdU+-Zellen diffus über die Nähte verteilt (Abbildung 6A), was für den physiologischen Knochenumbau wichtig sein könnte und bei 2-D-Schnitten möglicherweise übersehen wird. Nach der Ausdehnung für 1 Tag erreichten die proliferierenden Zellen in der Mitte und an den Rändern der Nähte ihren Höhepunkt (Abbildung 6B). Mit zunehmender Verbreiterung der Naht nahm die Anzahl der proliferierenden Zellen im Laufe der Zeit ab und erreichte Tag 7 (Abbildung 6C). Bei den markierten Zellen handelte es sich um kleine runde Zellen im Knochenmark, die auf Blutzellen hindeuteten, die sich von den EdU+-Nahtzellen unterschieden (Abbildung 6C).
Abbildung 1: Vitalmaterialien wurden für die Operation vorbereitet. Die Halterungen wurden aus Edelstahldraht gefertigt. Ihr Durchmesser betrug 2 mm, und 1 mm Schwänze waren auf zwei Seiten reserviert (A). Es wurde die Druckfeder mit 0,2 mm Drahtdurchmesser, 1,5 mm Außendurchmesser, 1 mm Zwischenraum aufgebracht (B). Die Zugkraft wurde mit einem Dynameter (C,D) erfasst. Jede 1 mm Federkompression erhielt in diesem Experiment einen Schub von etwa 30 g (E). Papierschnipsel wurden in die Form von Drachen mit einem Durchmesser von 2 mm geschnitten, um sie als Barrieren zu verwenden (F). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Der chirurgische Prozess für das nahtexpandierende Mausmodell. Nach dem Umklappen des Schädeldachlappens wurden sowohl das Säureätzen (A) als auch das Kleben (B) an der Stelle durchgeführt, an der die Retentionshalter freigelegt werden sollten. Nach dem Zurücksetzen des Kopfhautlappens (C) wurden die Halter an der markierten Position (D) freigelegt. Eine Feder wurde zwischen zwei Halterungen gesetzt, um eine Expansionskraft auf die Schädelnaht auszuüben, und zwei Papierfetzen wurden an beiden Enden der Feder als Barrieren (E,F) befestigt, nachdem bestätigt worden war, dass die Halter fest verbunden waren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Das PEGASOS-Gewebereinigungsverfahren wurde für zwei Schädelknochen mit oder ohne Entkalkung angewendet. Nach der Perfusion wurden die Schädelknochen abgetrennt, wobei einige blutbefleckte und weiche Gewebe anhafteten (A). Schädelknochen, die den Entkalkungsprozess (B) oder mit Nicht-Entkalkung (C) durchlaufen haben, waren nach dem gesamten Prozess von PEGASOS fast vollständig transparent. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Kalvarialnähte dehnten sich nach Zugkrafteinwirkung allmählich aus. μCT-Bilder der sagittalen Naht ohne Kraftbelastung (A) und nach Kraftbelastung für 1 Tag und 5 Tage (B,C). Maßstab: 100 μm. Exp = Ausdehnung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Osteogenese aktiviert nach Nahtexpansion in 3-D-Bildern. (A-C) Dreidimensionale Visualisierung von doppelt markierten sagittalen Nähten, die mit der PEGASOS-Methode geklärt wurden. Alizarinrot und Calceingrün wurden über Nacht vor der Expansion bzw. vor der Euthanasie nach der Expansion für 7 Tage intraperitoneal injiziert (B,C), verglichen mit der Kontrollgruppe ohne mechanische Belastung zu den gleichen Zeitpunkten (A). Die 5-fache Linse wurde verwendet, um die gesamten Nahtbilder effizient zu erfassen (A,B), und das Boxbild in (B) wurde vergrößert in (C, C', C''), das mit einer 10-fach-Linse aufgenommen wurde. Maßstabsbalken in A,B: 100 μm, C: 150 μm. Exp = Ausdehnung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Nahtzellen, die bei Zugkraftbelastung in 3-D-Bildern stark proliferiert sind. Whole-Mount-Inkorporationsassays in Kombination mit der PEGASOS-Gewebe-Clearing-Methode zeigten die proliferierenden Zellen in der gesamten Naht in Ruhe (A) oder nach Zwangsbelastung für 1 Tag und 7 Tage (B,C). Aufgenommen mit einem 10-fach-Objektiv. Gestrichelte Linien umreißen zwei Kanten für sagittale Nähte. Maßstab: 100 μm. Exp = Ausdehnung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Abläufe | Lösungen | Zeit & Temperatur |
| 1. Intraperitoneale Injektion | 1 mg/10 g EdU | 2 h vor dem Einschläfern der Mäuse |
| 2. Durchblutung | 0,02% Heparin & 0,05 mol/L EDTA | / |
| 3. Fixierung | 4% PFA | O/N, 4 °C |
| 4. Entkalkung | 10% EDTA | 2 Tage, 37 °C |
| 5. Entfärbung | 25% Quadrol | 1 Tag, 37 °C |
| 6. EdU-Färbung | Etikettier-Cocktail | 1 Tag, RT |
| 7. Entfetten | 30% tert-Butanol | 2 h, 37 °C |
| 50% tert-Butanol | 2 h, 37 °C | |
| 70% tert-Butanol | 2 h, 37 °C | |
| 8. Dehydrierung | TB-PEG-Lösung | 3 h*2, 37 °C |
| 9. Verrechnung | BB-PEG-Lösung | 2 h, 37 °C |
Tabelle 1: PEGASOS-Gewebereinigungsverfahren für Schädelknochen mit EdU-Färbung.
| Abläufe | Lösungen | Zeit & Temperatur |
| 1. Intraperitoneale Injektion | 20 mg/kg Alizarin rot | Über Nacht vor der Erweiterung |
| 2. Intraperitoneale Injektion | 5 mg/kg Calcein | Übernachtung vor der Abholung |
| 3. Durchblutung | 0,02% Heparin & 0,05 mol/L EDTA | / |
| 4. Fixierung | 4% PFA | O/N, 4 °C |
| 5. Entfärbung | 25% Quadrol | 1 Tag, 37 °C |
Tabelle 2: PEGASOS-Gewebereinigungsverfahren für Schädelknochen mit doppelter Markierung der mineralisierten Knochen durch Calceingrün und Alizarinrot.
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Discussion
Wir wandten ein Standard-Nahtexpansions-Mausmodell an, um die regelmäßigen morphologischen Veränderungen zu beobachten, die jede Woche während des gesamten einmonatigen Remodellierungszyklus auftreten10. Dieses Modell ist nützlich für die Erforschung des Umbaus und der Regeneration des Schädelknochens durch die Erweiterung von Schädelknochennähten sowie für die Untersuchung verschiedener Nahtzellen in vivo. Um die Ergebnisse dieser Forschung vollständig darstellen zu können, ist eine dreidimensionale Visualisierung von gefärbtem Gewebe erforderlich. Daher wurde die PEGASOS-Technologie, die für ihre Effizienz bei der Klärung von Hartgewebebekannt ist 19,20, mit doppelter Markierung und EdU-Färbung kombiniert, um erweiterte Mineralisierungsraten und proliferierende Zellen während des Expansionsprozesses aufzudecken.
Bei der Nahtdehnungschirurgie ist einer der wichtigsten Schritte die Verklebung des Sicherungsrings. Um eine feste Verbindung mit der Knochenoberfläche zu gewährleisten, haben wir den Säureätz- und Klebeprozess an der Unterseite des Retainerrings standardisiert. Die kleinen Schlaufen am Haltering sollten senkrecht zur Knochenoberfläche stehen und kleinen Löchern auf der Kopfhaut entsprechen. Nach dem Vernähen der Kopfhaut sollten die kleinen Schlaufen durch kleine Löcher in einem natürlichen und ausgewogenen Zustand an der Hautoberfläche freigelegt werden, um zu vermeiden, dass der Haltering während der Installation der kraftaufbringenden Feder und des Führungsdrahtes zusammenbricht, was zu einem Operationsversagen führen könnte. Darüber hinaus ist die Auswahl einer geeigneten Kraftaufbringungsfeder für eine erfolgreiche Operation von entscheidender Bedeutung, da sie die Installation der Feder erleichtert und gleichzeitig verhindert, dass der Sicherungsring abfällt und die beabsichtigte Krafteinleitung erreicht wird.
Im Vergleich zu den Vorgängermodellen bietet dieses Modell mehrere Vorteile. Erstens verhindert es die Bildung von kreisförmigen Knochendefekten im Scheitelknochen und bewahrt so den Zellaktivierungsmodus. Darüber hinaus kann die Kraft jederzeit durch Demontage der Feder entfernt werden, wodurch sie sich für die Erstellung eines Wiederholungsmodells nach dem Spannungsdehnen eignet. Die bequeme Demontage der Feder sorgt zudem für minimale Folgeschäden bei den Versuchstieren. Darüber hinaus kann die mechanische Größe der Zugspannung durch Änderung der Federkraft leicht eingestellt werden. Wichtig ist, dass dieses Modell die natürliche physiologische Umgebung um die Schädelnaht herum aufrechterhält und so die Genauigkeit der experimentellen Ergebnisse gewährleistet.
Es gibt jedoch einige Einschränkungen bei diesem Erweiterungsmodell. Zum einen besteht die Gefahr, dass der Haltering abfällt, wenn die Kraft zu groß ist. Anfänger sollten Vorübungen für den Federeinbau durchführen, um dieses Risiko zu mindern. Zweitens besteht beim Öffnen der Kopfhaut und Freilegen des Schädels ein Infektionsrisiko, daher ist die Desinfektion des Instruments unerlässlich und eine Verkürzung der Operationsdauer ist für die Heilung von Vorteil. Eine Übernarkose kann auch zum Tod von Mäusen führen.
In Bezug auf die passive PEGASOS-Methode ist sie anwendbar, um Transparenz in einzelnen Geweben und Organen sowie im gesamten Kopf und Körper junger Mäuse zu erreichen. Während es für ganze Schädelknochen effizient ist, ist für größere Proben eine längere Verarbeitungszeit erforderlich, insbesondere für ganzes Knochengewebe oder voluminöses langes Knochengewebe mit Gelenken. Es ist wichtig zu beachten, dass bei Verwendung des Doppelmarkierungsprotokolls keine Gewebeentkalkung durchgeführt werden sollte, da dies den Färbeprozess stört. Die PEGASOS-Gewebereinigungsmethode ist auch flexibel und ermöglicht die Kombination mit verschiedenen Markierungsmethoden, die nicht auf die EdU-Inkorporation oder die Kalzium-Doppelmarkierung beschränkt sind, sondern auch auf die endogene Fluoreszenz in transgenen Mausmodellen oder die Ganzkörperfarbstoff- oder Antikörperfärbung, alles mit gut erhaltener Fluoreszenz.
Mit stabilen Effekten und hoher Wiederholbarkeit eignet sich dieses Nahtexpansionsmodell für verschiedene Stämme transgener Mäuse unterschiedlichen Alters. Die Möglichkeit, die Größe der Zugspannung und die Rückzugskraft jederzeit anzupassen, ermöglicht eine komfortable Erforschung des Wiederauftretens nach Spannungsstimulation. Durch die Kombination der doppelten Markierungsmethode von mineralisierten Knochen mit der PEGASOS-Gewebereinigungstechnik können wir die dreidimensionale räumlich-zeitliche Verteilung von kranialen Nahtstammzellen während des Knochenumbaus beobachten, was eine weitere Untersuchung der Beziehung zwischen SUSCs und mechanischer Belastung sowie ihrer spezifischen Mechanismen ermöglicht.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken für die Laborplattform und die Unterstützung des Ear Institute, Shanghai Jiaotong University School of Medicine. Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Shanghai Pujiang Program (22PJ1409200); Nationale Naturwissenschaftliche Stiftung Chinas (Nr. 11932012); Postdoktoranden-Stiftung für wissenschaftliche Forschung des Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine; Finanzierung des Ninth People's Hospital, das an die Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (JYZZ154) angegliedert ist.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37% Acid etching | Xihubiom | E10-02/1807011 | |
| Alizarin red | Sigma-Aldrich | A3882 | |
| AUSTRALIAN WIRE | A.J.WILCOCK | 0.014'' | |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | B6630 | |
| Calcein green | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Copper(II) sulfate, anhydrous | Sangon Biotech | A603008 | |
| Dynamometer | Sanliang | SF-10N | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| EdU | Invitrogen | E104152 | |
| Laser Confocal Microscope | Leica | SP8 | |
| PBS | Sangon Biotech | E607008 | |
| PEG-MMA 500 | Sigma-Aldrich | 447943 | |
| PFA | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| pH Meters | Mettler Toledo | S220 | |
| Quadrol | Sigma-Aldrich | 122262 | |
| Sodium Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| Sodium bicarbonate | Sangon Biotech | A500873 | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A610476 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Spring | TAOBAO | 0.2*1.5*1*7 | |
| Sulfo-Cyanine3 azide | Lumiprobe | A1330 | |
| tert-Butanol | Sigma-Aldrich | 360538 | Protect from light. Do not freeze. |
| Transbond MIP Moisture Insensitive Primer |
3M Unitek | 712-025 | |
| Transbond XT Light Cure Adhesive Paste |
3M Unitek | 712-035 | |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | V900257 | |
| Tris-buffered saline | Sangon Biotech | A500027 |
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