Summary
يقدم هذا البروتوكول نموذجا موحدا لفأر توسيع الخياطة وطريقة تصور 3-D لدراسة التغيرات الميكانيكية البيولوجية للخياطة وإعادة تشكيل العظام تحت تحميل قوة الشد.
Abstract
تلعب الغرز القحفية الوجهية دورا حاسما يتجاوز كونها مفاصل ليفية تربط العظام القحفية الوجهية. كما أنها بمثابة المكانة الأساسية لنمو عظام الجلجلة والوجه ، حيث تحتوي على الخلايا الجذعية الوسيطة وأسلاف العظام. نظرا لأن معظم العظام القحفية الوجهية تتطور من خلال التعظم داخل الغشاء ، فإن المناطق الهامشية للخيوط تعمل كنقاط بدء. نظرا لهذه الأهمية ، أصبحت هذه الغرز أهدافا مثيرة للاهتمام في علاجات العظام مثل توسيع قبو الجمجمة بمساعدة الربيع ، والتوسع السريع في الفك العلوي ، وإطالة الفك العلوي. تحت قوة تتبع العظام ، يتم تنشيط الخلايا الجذعية الغرز بسرعة ، لتصبح مصدرا ديناميكيا لإعادة تشكيل العظام أثناء التوسع. على الرغم من أهميتها ، لا تزال التغيرات الفسيولوجية خلال فترات إعادة تشكيل العظام غير مفهومة بشكل جيد. طرق التقسيم التقليدية ، في المقام الأول في الاتجاه السهمي ، لا تلتقط التغييرات الشاملة التي تحدث في جميع أنحاء الخيط بأكمله. أنشأت هذه الدراسة نموذجا قياسيا للفأر لتوسيع خياطة السهمي. لتصور تغييرات إعادة تشكيل العظام بشكل كامل بعد توسع الخياطة ، تم دمج طريقة إزالة الأنسجة PEGASOS مع تلطيخ EdU الكامل والملصقات المزدوجة المخلبة بالكالسيوم. سمح ذلك بتصور الخلايا المتكاثرة للغاية وتكوين عظام جديدة عبر عظام الجلاد بأكملها بعد التوسع. يقدم هذا البروتوكول نموذجا موحدا لفأر توسيع خياطة وطريقة تصور 3-D ، مما يلقي الضوء على التغيرات الميكانيكية البيولوجية في الغرز وإعادة تشكيل العظام تحت تحميل قوة الشد.
Introduction
الغرز القحفية الوجهية هي أنسجة ليفية تربط العظام القحفية الوجهية وتلعب أدوارا أساسية في نمو وإعادة تشكيل العظام القحفية الوجهية. يشبه هيكل الخيط النهر ، حيث يوفر تدفقا لموارد الخلايا لتغذية وبناء "ضفة النهر" ، والمعروفة باسم الجبهات العظمية ، والتي تساهم في تكوين العظام القحفية الوجهية عن طريق تكوين العظم داخل الغشاء1.
كان الاهتمام بالخيوط القحفية الوجهية مدفوعا بالاحتياجات السريرية لفهم الإغلاق المبكر للخيوط القحفية وخلل خياطة الوجه ، مما قد يؤدي إلى تشوهات قحفية وجهية وحتى حالات تهدد حياة الأطفال. يستخدم استئصال الخياطة المفتوحة بشكل روتيني في العلاج السريري ، لكن المتابعة طويلة المدى أظهرت تكرار إعادة التعظم غير الكامل في بعض المرضى2. قد يوفر حج القحف طفيف التوغل بمساعدة نوابض التمدد أو استئصال القحف الشريطي بالمنظار طريقة أكثر أمانا للحفاظ على الخيط المحتمل بدلا من التخلص من الأنسجة3. وبالمثل ، تم استخدام علاجات العظام مثل أقنعة الوجه وأجهزة التوسيع على نطاق واسع لعلاج نقص تنسج الفك العلوي السهمي أو الأفقي ، مع بعض الدراسات التي تمدد الحد العمري لعلاج المرضى البالغين عبر موسعات حنكية صغيرة بمساعدة اللولب4،5،6. بالإضافة إلى ذلك ، فإن تجديد خياطة الجمجمة بالخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) جنبا إلى جنب مع المواد القابلة للتحلل هو علاج محتمل في المستقبل ، ويقدم اتجاها جديدا لعلاج الأمراض ذات الصلة7. ومع ذلك ، فإن عملية الوظيفة أو الآلية التنظيمية للخيوط الجراحية لا تزال بعيدة المنال.
تتكون إعادة تشكيل العظام بشكل أساسي من التوازن بين تكوين العظام الذي تجريه بانيات العظم وارتشاف العظام الذي تجريه الخلايا الآكلة للعظم ، حيث يلعب التمايز العظمي للخلايا الجذعية التي تحفزها الإشارات الميكانيكية دورا مهما. بعد عقود من البحث ، وجد أن الغرز القحفية الوجهية عبارة عن منافذ للخلايا الجذعية الوسيطة عالية البلاستيك8. الخلايا الجذعية المخيطة (SuSCs) هي مجموعة غير متجانسة من الخلايا الجذعية ، تنتمي إلى الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) أو الخلايا الجذعية العظمية (SSCs). يتم تصنيف SuSCs في الجسم الحي بأربع علامات ، بما في ذلك Gli1 و Axin2 و Prrx1 و Ctsk. Gli1 + SuSCs ، على وجه الخصوص ، تحققت بدقة من الخصائص البيولوجية للخلايا الجذعية ، ليس فقط إظهار تعبير عال عن علامات MSC النموذجية ولكن أيضا إظهار إمكانات عظمية وغضروفية ممتازة9. أظهرت الأبحاث السابقة أن Gli1 + SuSCs تساهم بنشاط في تكوين عظام جديدة تحت قوة الشد ، وتحديدها على أنها مصدر الخلايا الجذعية للخياطة التي تدعم تكوين العظم10.
في الماضي ، تمت دراسة الخصائص الميكانيكية الواسعة للخلايا الجذعية في المختبر عبر Flexcell ، والانحناء رباعي النقاط ، ونظام تحميل المغناطيس الدقيق ، وغيرها. على الرغم من أنه تم تحديد خلايا اللحمة المتوسطة المشتقة من خياطة الجمجمة للفأر في المختبر11 ، كما تم عزل الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية مؤخرا12 ، إلا أن الاستجابة الميكانيكية الحيوية لخلايا الخياطة لا تزال غير واضحة في النظام في المختبر. لمزيد من التحقيق في عملية إعادة تشكيل العظام ، تم إنشاء نموذج تمدد خياطة يعتمد على ثقافة أعضاء كالفاريا المعزولة ، مما يمهد الطريق لإنشاء نموذج مفيد لتوسيع خياطة الجسم الحي 1،13. كانت الأرانب14 والفئران15 أكثر استخداما في الأبحاث الأساسية لتوسيع الخياطة. ومع ذلك ، فإن الفئران هي نماذج حيوانية مفضلة لاستكشاف الأمراض البشرية بسبب جينومها المتماثل للغاية مع البشر ، والعديد من خطوط تعديل الجينات ، وقدرة التهجين الإنجابية القوية. تعتمد نماذج الماوس الحالية لتوسيع خياطة الجمجمة عادة على أسلاك زنبركية تقويم الأسنان المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ لتطبيق قوة الشد على الخيط السهمي16,17. في هذه النماذج ، يتم عمل فتحتين في كل جانب من العظام الجدارية لإصلاح جهاز التمدد ، ويتم تضمين الأسلاك تحت الجلد ، مما قد يؤثر على وضع تنشيط الخلية.
فيما يتعلق بطريقة التصور ، تم اعتماد الملاحظة ثنائية الأبعاد للشرائح في الاتجاه السهمي بشكل عام لعقود. ومع ذلك ، بالنظر إلى أن إعادة تشكيل العظام هي عملية ديناميكية ثلاثية الأبعاد معقدة ، أصبح الحصول على معلومات ثلاثية الأبعاد كاملة حاجة ملحة. ظهرت تقنية شفافية الأنسجة PEGASOS لتلبية هذا المطلب18,19. إنه يوفر مزايا فريدة لشفافية الأنسجة الصلبة والرخوة ، مما يتيح إعادة إنتاج عملية إعادة تشكيل العظام الكاملة في مساحة ثلاثية الأبعاد.
للحصول على فهم أعمق وأكثر شمولا للتغيرات الفسيولوجية في فترات إعادة تشكيل العظام ، تم إنشاء نموذج فأر قياسي لتوسيع خياطة السهمي مع إعداد زنبركي بين حاملات مصنوعة يدويا10. من خلال إجراء النقش والترابط الحمضي القياسي ، يمكن ربط جهاز التمدد بقوة بعظم الجمجمة ، مما يولد قوة شد عمودية على الخيط السهمي. علاوة على ذلك ، تم تطبيق طريقة PEGASOS لإزالة الأنسجة بعد وضع العلامات المزدوجة على العظام المعدنية بعد التمدد لتصور تغييرات نمذجة العظام بشكل كامل بعد تمدد الخياطة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع الإجراءات التجريبية الموضحة هنا من قبل لجنة رعاية في مستشفى الشعب التاسع في شنغهاي ، كلية الطب بجامعة شنغهاي جياو تونغ (SH9H-2023-A616-SB). تم استخدام الفئران الذكور C57BL / 6 البالغة من العمر 4 أسابيع في هذه الدراسة. تم تعقيم جميع الأدوات المستخدمة قبل الإجراء.
1. إعداد نموذج توسيع خياطة
- إعداد اثنين من أصحاب الاحتفاظ.
- استخدم سلك أسترالي 0.014 بوصة أو سلك فولاذي مقاوم للصدأ (انظر جدول المواد) لعمل حلقة حلزونية باستخدام كماشة سلكية خفيفة. قطر الحلقة 2 مم ، والذيل 1 مم محجوز على الجانبين (الشكل 1 أ).
- تعقيم الأسلاك وحوامل الجراحة في الأوتوكلاف أو معقم البلازما أو معقم بارد مناسب (مثل الجلوتارالدهيد).
- تحضير الينابيع.
- تحضير نوابض مخصصة من الفولاذ المقاوم للصدأ.
ملاحظة: تم استخدام زنبرك الضغط بقطر سلك 0.2 مم وقطر خارجي 1.5 مم ومساحة فاصلة 1 مم وطول 7 مم في هذه الدراسة (الشكل 1 ب). حصل كل ضغط زنبركي 1 مم على قوة دفع تبلغ حوالي 30 جم. - قطع الربيع إلى طول متاح قبل الإعداد. تأكيد قوة الربيع المتخصصة قبل التجربة.
ملاحظة: تختلف أحجام الينابيع طالما أن حجم القوة هو نفسه في التجارب المتوازية. يتم قياس القوة بواسطة أداة اختبار أحادية المحور منضدية أو مقياس ديناميكي إلكتروني صغير (انظر جدول المواد) إذا كانت الحالة محدودة. يتم تقييم تغير الطول إلى حجم القوة (الشكل 1C-E). والجدير بالذكر أنه من الضروري تغيير قيمة تحميل قوة الزنبرك بناء على العمر والحالة العظمية للفأر وكائنات البحث. - قم بإعداد سلك أسترالي مستقيم أو سلك فولاذي مستقيم بطول 7 مم ، واصنع قطعتين من الورق بقطر 2 مم لاستخدامهما كحواجز (الشكل 1F).
- تحضير نوابض مخصصة من الفولاذ المقاوم للصدأ.
2. جراحة توسيع خياطة السهمي
- التخدير: تخدير الفئران بالتيلتامين (25 ملغ/كغ) وزولازيبام (25 ملغ/كغ) وزيلازين (10 ملغ/كغ). في الوقت نفسه ، ضع مرهم عيني معقم على العينين لمنع جفاف القرنية. الحكم على عمق تخدير الفئران عن طريق قرصة إصبع القدم.
ملاحظة: تشير الخصائص التالية إلى أن الفأر قد تم تخديره بشكل صحيح: التنفس البطيء والثابت ، وضعف الأطراف ، واسترخاء العضلات ، واختفاء منعكس الوخز بالإبر الجلدية ومنعكس الجفن ، وكذلك ضعف منعكس القرنية. - إزالة الفراء والتطهير: إزالة الفراء بعناية في الجزء العلوي من الرأس مع كريم إزالة الشعر. تجنب لمس العينين. بعد فترة وجيزة ، استخدم جولات متناوبة من اليودوفور و 75٪ كحول لتطهير موقع الجراحة. تطبيق ميلوكسيكام (1 ملغ/ كغ) كمسكن للفئران عن طريق الحقن تحت الجلد.
- تثبيت وضع الجسم: ضع الماوس مستلقيا على المقدمة واستخدم الأشرطة الجراحية لتثبيت الأطراف على طاولة العمليات.
- سديلة فروة الرأس المفتوحة: استخدم المقص الجراحي لإجراء سديلة مقوسة على طول فروة الرأس بالقرب من عنق الفأر ، مما يؤدي إلى كشف الخيط السهمي والجمجمة المحيطة به بالكامل. بعد ذلك ، قم بإصلاح رفرف فروة الرأس بخياطة 6-0 على طاولة العمليات.
- اربط حاملات الاحتفاظ بعد النقش الحمضي.
- جفف الجمجمة وحفرها بحمض الفوسفوريك بنسبة 37٪ لمدة 20 ثانية ، واستخدم محلول ملحي عادي لتنظيف النقش الحمضي (الشكل 2 أ). ستظهر بقايا طباشيرية بعد تجفيف الجمجمة باستخدام لمبة الماصة المطاطية.
- قم بتدعيم الحاملين (المحضر في الخطوة 1.1) على جانبي العظام الجدارية على بعد 3 مم من الغرز السهمية بمادة لاصقة خفيفة المعالجة (الشكل 2 ب).
- إعادة ضبط رفرف فروة الرأس.
- أعد رفرف فروة الرأس يدويا (الشكل 2 ج). قم بتسمية موضع حامليها ، وقم بقطع فتحتين صغيرتين في فروة الرأس في الموضع المقابل لحاملي الاحتفاظ الثنائيين ، ثم أعد ضبط فروة الرأس المرفرفة.
- في الوقت نفسه ، قم بتمرير الحلقات الصغيرة عبر الثقوب لفضح سطح الجلد. خياطة شق منحني مع خياطة 6-0 (الشكل 2D). يسمح بيوم إلى ثلاثة أيام لاستعادة الجلد. يتم تطبيق ميلوكسيكام (1 ملغ/كغ) لدى الفئران عن طريق الحقن تحت الجلد كل 24 ساعة لمدة 1-3 أيام.
ملاحظة: بعد الجراحة ، تحقق يوميا من نشاط فروة رأس الفأر وما إذا كان حاملوها يسقطون. هناك أنواع مختلفة من الجلد في مسألة اللون والسماكة. ستحافظ فروة الرأس الصحية على اللون الأصلي ، وسوف تندمج حواف الجلد تدريجيا معا بعد الخياطة. إذا تم العثور على عدوى في فروة الرأس ، أو إذا سقط الجهاز الجراحي ، فقم بإزالة الماوس من الدراسة والقتل الرحيم.
- تثبيت الربيع وتوجيه الأسلاك.
- قطع الربيع 1 مم أطول من المسافة بين الحاملين.
- ضغط زنبرك الضغط المحدد ووضعه بين الملفات الصغيرة على كلا الجانبين.
- مرر سلك الفولاذ المقاوم للصدأ عبر الملفات الصغيرة والزنبرك ، وحرر الزنبرك للحصول على دفعة أولية تبلغ حوالي 30 جم.
- تأكد من أن فروة الرأس الموجودة أسفل منطقة الزنبرك للماوس بدون أي ضغط.
- بعد التأكد من أن الترابط ثابت دون أي رخاوة ، قم بربط قصاصتين من الورق بين الزنبرك والحوامل بمادة لاصقة خفيفة المعالجة من أجل إقامة حواجز على طرفي الزنبرك (الشكل 2E ، F).
3. وضع العلامات المزدوجة للعظام المعدنية
- إعداد حل الأسهم.
- تحضير محلول تخفيف بالماء المقطر يحتوي على 0.9٪ كلوريد الصوديوم و 2٪ NaHCO3.
- استخدم المحلول المخفف لتحضير 20 ملغم/مل من ثنائي هيدرات مركب أليزارين و10 ملغ/مل من الكالسيين (انظر جدول المواد).
- اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 باستخدام جهاز قياس الأس الهيدروجيني. اغسل مسبار الأس الهيدروجيني بين القياسات لضمان قراءات دقيقة.
- ضع الصبغة في وعاء معقم وقم بتخزينها في الثلاجة على حرارة 4 درجات مئوية ؛ يستخدم احباط لإبعاد الضوء.
- تحضير حل العمل. قبل الحقن ، قم بتخفيف محلول المرق إلى 1 مجم / مل للكالسيوم و 2 مجم / مل لثنائي هيدرات مركب أليزارين باستخدام محلول ذوبان.
- حقن داخل الصفاق 5 ملغ / كغ من الكالسيين الأخضر و 20 ملغ / كغ من الأحمر Alizarin في نقطتين زمنيتين لتسمية العظام المعدنية وتحليل التغيرات بين مرتين. بشكل عام ، اجمع العينات بعد 12-14 ساعة من الحقن.
ملاحظة: قم بتسخين الأصباغ قبل الحقن ، وتأكد من أن وقت الحقن لا يقل عن 3 دقائق. يعتمد الفاصل الزمني للحقن على وقت التوسع. في هذه الدراسة ، تم حقن Alizarin الأحمر والأخضر Calcein بين عشية وضحاها (O / N) قبل التوسع و O / N قبل الجمع ، على التوالي. - اجمع عظام كلفاري كاملة معدة لإجراء إزالة الأنسجة بعد يوم من الحقن الثاني.
4. تلطيخ EdU
- الحقن داخل الصفاق: حقن EdU داخل الصفاق 2 ساعة قبل القتل الرحيم للفئران (باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا). الجرعة هي 1 ملغ / 10 غرام من وزن الجسم.
- تحضير كوكتيل الوسم: مزيج محلول ملحي مخزن تريس (100 مليمول / لتر نهائي ، درجة حموضة 7.6) ، CuSO4 (4 مليمول / لتر نهائي) ، سلفو سيانين 3 أزيد (2-5 ميكرومول / لتر نهائي) وأسكوربات الصوديوم (100 مليمول / لتر نهائي ، طازج في كل استخدام) (انظر جدول المواد).
- تلطيخ EdU الكامل: بعد خطوة إزالة لون الأنسجة في طريقة إزالة الأنسجة PEGASOS (الخطوة 7) ، ضع عينات في كوكتيل الملصقات لمدة 1 يوم في درجة حرارة الغرفة (RT).
5. التصوير المقطعي المحوسب الدقيق
- تثبيت الأنسجة وتخزينها: ثبت عظام الجلفاري في 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) عند 4 درجات مئوية O / N وقم بتخزينها في 0.5٪ PFA قبل المسح.
- المسح والتحليل: امسح العينات ضوئيا باستخدام نظام تصوير مقطعي دقيق (μCT) بدقة عالية وحجم فوكسل يبلغ 7 ميكرومتر.
6. إعداد حل العمل لإزالة الأنسجة PEGASOS
- 4٪ بولي فورمالدهايد (PFA): قم بإذابة 4 جم من مسحوق PFA في 1× PBS إلى 100 مل.
- محلول التروية القلبية: 0.02 ٪ الهيبارين ، وهذا هو ، 20 ملغ مسحوق الهيبارين المذاب في 1× PBS إلى 100 مل. بدلا من ذلك ، استخدم 0.05 مول / لتر EDTA ، أي 0.05 مول من حمض رباعي الأسيتيك ثنائي أمين الإيثيلين (EDTA) (انظر جدول المواد) ، مذاب في محلول مائي منزوع الأيونات إلى حجم إجمالي قدره 1 لتر.
- محلول إزالة الألياس: 0.5 مول / لتر EDTA ، أي 0.5 مول من حمض رباعي أسيتيك ثنائي أمين الإيثيلين (EDTA) ، مذاب في محلول مائي منزوع الأيونات إلى حجم إجمالي قدره 1 لتر.
- محلول إزالة اللون: 25٪ كوادرول ، وهو 250 مل من كوادرول (N ، N ، N '، N '- Tetrakis (2-Hydroxypropyl) ethylenediamine) (انظر جدول المواد) المذاب في الماء منزوع الأيونات إلى حجم إجمالي قدره 1 لتر.
ملاحظة: نظرا لزوجة Quadrol ، يمكن تسخينه إلى 60 درجة مئوية لزيادة سيولته قبل التكوين. - محلول إزالة الشحوم: 30٪ ، 50٪ ، 70٪ ثلاثي البيوتانول (TB) (انظر جدول المواد) ، محضر بالماء حسب الكسر الحجمي.
ملاحظة: بالنظر إلى أن السل النقي بلوري في درجة حرارة الغرفة ، يجب تسخينه إلى 60 درجة مئوية حتى يذوب قبل استخدامه. بعد ذلك ، يضاف 3٪ إلى 5٪ (v / v) ثلاثي إيثانولامين (TEA) لتنظيم درجة الحموضة في المحلول >9.5. - محلول التجفيف: محلول TB-PEG ، 70٪ تيرابايت + 27٪ PEG-MMA + 3٪ كوادرول (v / v) ، حيث يكون PEG-MMA عبارة عن بولي (جلايكول إيثيلين) ميثيل إيثر ميثاكريلات بمتوسط وزن جزيئي يبلغ 500 (بولي (جلايكول الإيثيلين) ميثاكريلات 500 ، PEG-MMA 500) (انظر جدول المواد).
- حل شفاف: محلول BB-PEG ، 75٪ BB + 22٪ PEG-MMA + 3٪ كوادرول (v / v) ، حيث BB هو بنزوات البنزيل (BB).
7. شفافية العظام الكالفارية بطريقة PEGASOS
- تخدير الفأر عن طريق الحقن داخل الصفاق للمخدر (الخطوة 2.1) ، والحكم على عمق تخدير الفأر من خلال رد فعل القرص لضمان عدم وجود رد فعل مقاومة قبل التروية القلبية.
- أداء نضح القلب والتثبيت.
- امسك بطن الفأر لأعلى ، وقم بإصلاح الأطراف بشريط لاصق ، وقم بقصه بعناية على طول محيط الصدر لفضحه بالكامل.
- مباشرة بعد إجراء قطع صغير في الأذين الأيمن بمقص العيون ، أدخل إبرة نضح 22 G في قمة البطين الأيسر.
ملاحظة: يتم إدخال طرف الإبرة فقط لتجنب إتلاف صمام القلب من خلال الإدخال المفرط. خلاف ذلك ، سوف يدخل سائل التروية القلبية إلى الدورة الدموية الرئوية ، مما يؤثر على تأثير التروية للدورة الدموية الجهازية. - ادفع سائل التروية القلبية 30-50 مل (الخطوة 6.2) في المحقنة. يمكن ملاحظة أن الكبد يتحول تدريجيا إلى لون باهت من اللون الأحمر الفاتح.
- بعد أن يصبح سائل التدفق الخارجي من الأذين الأيمن واضحا تماما ، قم ببث محلول PFA بنسبة 4٪ في حجم متساو. يتم تشغيل نضح PFA في غطاء محرك السيارة جيد التهوية.
- تشريح وفصل الأنسجة والأعضاء ، وتثبيتها طوال الليل مع 4 ٪ PFA عند 4 درجات مئوية.
- إزالة الكلس من الأنسجة: بالنسبة للعينات التي تتم معالجتها بواسطة تلطيخ EdU ، ضع الأنسجة الصلبة الثابتة في محلول 0.5 مول / لتر EDTA (درجة الحموضة 7.0) (10 مل) في طاولة اهتزاز عند 37 درجة مئوية لمدة يومين تقريبا ، وقم بتغيير السائل يوميا.
ملاحظة: تخطي عملية إزالة الكلس في طريقة PEGASOS الطبيعية للعظام الموسومة بعامل مخلب الكالسيوم للحفاظ على الإشارات بالكامل. مطلوب إزالة الكلسات لعلاج العظام لتصور التألق الداخلي أو الإشارات المناعية الكاملة. - إزالة لون الأنسجة: ضع عظام الجلاداري الثابتة في محلول كوادرول 25٪ (20 مل) في طاولة اهتزاز عند 37 درجة مئوية لمدة 1 يوم ، وقم بتغيير السائل مرة واحدة.
ملاحظة: يرتبط وقت إزالة اللون بمحتوى الهيم في الأنسجة. راقب لون سائل المعالجة ، حيث يمثل عمق اللون الحاجة إلى مواصلة العلاج باستبدال السوائل. - تلطيخ EdU: شطف العينات في 1× PBS لمدة 5 دقائق (ثلاث مرات) ، ثم غمرها في كوكتيل وضع العلامات لمدة يوم واحد. بعد ذلك ، شطف العينات في 1× PBS لمدة 1 ساعة (ثلاث مرات).
- إزالة الشحوم والجفاف من الأنسجة
- ضع الأنسجة في محاليل 30٪ TB و 50٪ TB و 70٪ TB بالتسلسل لإجراء تناقص التدرج على طاولة الاهتزاز عند 37 درجة مئوية. ضع في كل تركيز لمدة 2 ساعة.
- بعد ذلك ، قم بتجفيف العينات في محلول TB-PEG لمدة 6 ساعات على طاولة اهتزاز عند 37 درجة مئوية.
ملاحظة: يمكن زيادة وقت المعالجة أعلاه أو تقليله اعتمادا على عدد الأنسجة.
- شفافية الأنسجة: ضع الأنسجة المجففة تماما في محلول BB-PEG على طاولة الهز عند 37 درجة مئوية (2-4 ساعات) حتى تصبح شفافة. حاليا ، يمكن تخزين العينات لمدة تصل إلى 1-2 سنوات.
ملاحظة: بعد التطهير الكامل تقريبا ، افتح غطاء الأنبوب لتعريض العينات والوسائط للهواء مع الاهتزاز مما سيزيد من تحسين الشفافية. هذه الطريقة مناسبة لتحسين شفافية الأنسجة والأعضاء الفردية ، وكذلك كامل رأس وجسم الفئران الصغيرة. ومع ذلك ، من أجل شفافية الجسم كله من الفئران البالغة ، يجب تنفيذ الخطوات المذكورة أعلاه باستخدام طريقة نضح دورة كاملة.
8. التصوير
ملاحظة: تم استخدام المجهر متحد البؤر لتصور 3-D للأنسجة الشفافة في هذه الدراسة. الفحص المجهري للصفائح الضوئية مناسب أيضا لهذا البروتوكول. تم التحقق من العديد من أنظمة التشغيل كما كانت متوفرة من قبل. هنا ، يتم أخذ نظام تشغيل المجهر البؤري بالليزر كمثال (انظر جدول المواد).
- وفقا لدليل المستخدم ، اتبع الخطوات الصحيحة لفتح واجهة تشغيل الليزر متحد البؤر و LAS AF. قم بتشغيل الليزر المطلوب في قنوات التصوير المختلفة ، واضبط الطاقة. اضبط المسار البصري والطول الموجي المقابل ، 561 نانومتر لأحمر Alizarin و 488 نانومتر ل Calcein green ، يتم استخدام أي منها لإشارة EdU وفقا لكوكتيل وضع العلامات.
- ضع العينات الشفافة في طبق بتري الزجاجي المقعر الذي يمكن أن يحمل عينات سميكة أو صناديق تضمين أو أجهزة وضع ذاتية الصنع مثل الغراء المقاوم للماء لغمر العينات الشفافة في سائل شفاف.
- حدد عدسة موضوعية منخفضة الطاقة لتحديد موقع العينة بسرعة. قم بعمل نظرة عامة على الأنسجة الكلفارية بأكملها باستخدام وظيفة المسح السريع ، وابحث عن منطقة الاهتمام للتصوير.
- اضبط طاقة الإخراج ، وحدد وضع المسح ، واضبط أولا معاملات التصوير (الدقة ، وسرعة المسح ، وعامل التكبير / التصغير ، وجودة الصورة ، ومتوسط ضوضاء الخلفية ، وما إلى ذلك).
ملاحظة: بشكل عام ، يتراوح Smart Gain من 500 إلى 800 (كل من الإشارة وتغيير الضوضاء) ؛ الإزاحة الذكية قريبة من 0 قدر الإمكان مع ضمان جودة الصورة (لتقليل ضوضاء الخلفية). عندما يكون كسب PMT أعلى من 800 ، أو يكون كسب HyD أكبر من 100٪ ، ولا يزال السطوع غير كاف ، يمكن زيادة شدة الليزر بشكل مناسب ، ولكن من حيث المبدأ ، كلما انخفض ، كان ذلك أفضل. - اضبط المسافة المحورية Z والخطوة Z ، والتي يتم حفرها لأسفل من الجانب الضحل للمنظمة الشفافة ؛ وهذا هو ، تعيين أعمق الجوانب وضحلها.
ملاحظة: تأكد من التصنيف ومسافة العمل لكل عدسة. اضبط نطاق Z بعناية ، ولا تقم بتشغيل مسافة العمل التي تتجاوز حد العدسة المحددة. يمكن اختيار "z-Galvo" عند الحاجة إلى تنظيم جيد. - اضبط معلمات التصوير مرة أخرى ، وابدأ التصوير. بعد الانتهاء ، قم بدمج الصور ومعالجتها من خلال الوحدة متعددة الوظائف. أخيرا ، قم بتخزين وإغلاق الأداة بالترتيب المشار إليه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باستخدام هذا البروتوكول ، تم إنشاء نموذج ماوس لتوسيع خياطة السهمي (الشكل 1-2). لتصور 3-D من تغييرات نمذجة العظام بعد توسيع خياطة ، تم تطبيق طريقة PEGASOS لإزالة الأنسجة على عظام calvarial بأكملها بعد التوسع. بعد التروية ، تم فصل عظام الجلاد (الشكل 3 أ) ، واستمرت عملية PEGASOS المناسبة (الجدول 1 والجدول 2). ومن اللافت للنظر أن العظام الكلفارية أصبحت شفافة تقريبا بعد عملية PEGASOS الكاملة ، بغض النظر عما إذا كان قد تم إجراء إزالة الكلس (الشكل 3B ، C).
لتصور التغييرات بسرعة بعد التمدد ، تم استخدام μCT على العينات التي تم جمعها وثابتة. بالمقارنة مع المجموعة الضابطة (الشكل 4 أ) ، توسعت خياطة الجمجمة تدريجيا وبشكل ملحوظ بعد تطبيق القوة لمدة 1 يوم (الشكل 4 ب). بحلول اليوم الخامس ، ظهرت نتوءات عظمية رقيقة على حافة العظم (الشكل 4C).
من أجل التصور ثلاثي الأبعاد لمعدل تجاور التمعدن في الخيط بأكمله بعد التمدد ، تم استخدام طريقة وضع العلامات المزدوجة جنبا إلى جنب مع تقنية PEGASOS الفعالة ، حتى على عظام الكالفاري غير منزوعة الكلس (الشكل 5). في ظل الظروف الفسيولوجية ، كانت هناك تغييرات طفيفة بين إشارات وضع العلامات السابقة (الشكل 5 أ) ، بينما أدى التحميل القسري إلى تنشيط تكوين العظم بشكل كبير. اتسع النمط المتعرج للعظام المعدنية حديثا ، المسمى بعلامة صفراء خضراء واحدة من الكالسيوم ، بعد التوسع لمدة 7 أيام (الشكل 5B ، C). في التصور ثلاثي الأبعاد عالي الدقة ، أشارت تغييرات نمط العظام الهامشية إلى عملية إعادة تشكيل العظام بعد تمدد الخيط ، واختلفت درجة العظام المشكلة حديثا على جانبي الغرز (الشكل 5C).
علاوة على ذلك ، لتصور معدل تكاثر الخلايا عند تمدد الخيط ، تمت محاولة دمج EdU الكامل باستخدام طريقة إزالة الأنسجة PEGASOS مع عملية تكلس. بنجاح ، كان وضع العلامات فعالا ومحفوظا جيدا في الأنسجة التي تم تطهيرها. في المجموعة الضابطة ، تم توزيع العديد من خلايا EdU + بشكل منتشر في جميع أنحاء الغرز (الشكل 6A) ، والتي قد تكون مهمة لإعادة تشكيل العظام الفسيولوجية وربما يتم تجاهلها في تقسيم 2-D. عند التوسع لمدة 1 يوم ، بلغت الخلايا المتكاثرة ذروتها في منتصف وحواف الغرز (الشكل 6 ب). مع اتساع الخيط ، انخفض عدد الخلايا المتكاثرة بمرور الوقت ، ليصل إلى اليوم 7 (الشكل 6C). كانت الخلايا المميزة عبارة عن خلايا صغيرة مستديرة في نخاع العظم ، مما يشير إلى خلايا الدم ، والتي تختلف عن خلايا خياطة EdU + (الشكل 6C).
الشكل 1: تم تحضير المواد الحيوية للجراحة. كانت حوامل الاحتفاظ مصنوعة من أسلاك الفولاذ المقاوم للصدأ. كانت أقطارها 2 مم ، وتم حجز ذيول 1 مم على الجانبين (أ). تم تطبيق زنبرك الضغط بقطر سلك 0.2 مم ، قطر خارجي 1.5 مم ، مساحة فاصل 1 مم (B). تم الكشف عن قوة الشد بواسطة مقياس ديناميكي (C ، D). حصل كل ضغط زنبركي 1 مم على قوة دفع تبلغ حوالي 30 جم (E) في هذه التجربة. تم قطع قصاصات الورق على شكل طائرات ورقية بأقطار 2 مم لاستخدامها كحواجز (F). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: العملية الجراحية لنموذج الفأر الموسع للخياطة. بعد قلب رفرف الكالفاري ، تم إجراء النقش الحمضي (A) وكذلك الترابط (B) في الموضع الذي سيتم فيه تعريض حاملي الاحتفاظ. بعد إعادة ضبط رفرف فروة الرأس (C) ، تم الكشف عن الحوامل في الموضع المحدد (D). تم وضع زنبرك بين حاملين لممارسة قوة التمدد على الخيط الكالفاري ، وتم تثبيت قصاصتين من الورق عند طرفي الزنبرك كحواجز (E ، F) بعد التأكد من أن الحاملين مرتبطون بإحكام. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تم تطبيق إجراء إزالة الأنسجة PEGASOS على عظمتين كلديتين مع أو بدون إزالة الكلس. بعد التروية ، تم فصل عظام الجلجلة ، مع بعض الأنسجة الملطخة بالدم والرخوة (A). كانت العظام الكلفارية التي شهدت عملية إزالة الكلس (B) أو مع عدم إزالة الكلس (C) شفافة تماما تقريبا بعد عملية PEGASOS بأكملها. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: توسعت الغرز الكالفارية تدريجيا بعد بذل قوة الشد. صور μCT للخياطة السهمية بدون تحميل القوة (A) وبعد التحميل القسري لمدة 1 يوم و 5 أيام (B ، C). شريط المقياس: 100 ميكرومتر. Exp = التوسع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تنشيط تكون العظم بعد توسع الخياطة في صور 3-D. (A-C) تصور ثلاثي الأبعاد للخيوط السهمية ذات العلامات المزدوجة التي تم تطهيرها بواسطة طريقة PEGASOS. تم حقن الأليزارين الأحمر والكالسيين الأخضر داخل الصفاق بين عشية وضحاها قبل التمدد وقبل القتل الرحيم بعد التمدد لمدة 7 أيام (B ، C) ، على التوالي ، مقارنة مع المجموعة الضابطة بدون تحميل ميكانيكي في نفس النقاط الزمنية (A). تم استخدام عدسة 5x للحصول على صور خياطة كاملة بكفاءة (A ، B) ، وتم تكبير صورة الصندوق في (B) في (C ، C '، C'') المصورة بعدسة 10x. شريط المقياس في A ، B: 100 ميكرومتر ، C: 150 ميكرومتر. Exp = التوسع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: خلايا خياطة تكاثرت بشكل كبير عند تحميل قوة الشد في صور 3-D. عرضت مقايسات الدمج الكاملة جنبا إلى جنب مع طريقة إزالة الأنسجة PEGASOS الخلايا المتكاثرة في الخيط بأكمله عندما تكون في هدوء (A) أو بعد تحميل القوة لمدة 1 يوم و 7 أيام (B ، C). تم تصويره بعدسة 10x. تحدد خطوط الشرطة حافتين للخيوط السهمية. شريط المقياس: 100 ميكرومتر. Exp = التوسع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| العمليات | محاليل | الوقت ودرجة الحرارة |
| 1. الحقن داخل الصفاق | 1 ملغ/ 10 غ من الإديد | 2 ساعة قبل القتل الرحيم للفئران |
| 2. التروية | 0.02٪ هيبارين و 0.05 مول / لتر EDTA | / |
| 3. التثبيت | 4٪ PFA | O / N، 4 °C |
| 4. إزالة الكلالة | 10٪ EDTA | 2 أيام, 37 °C |
| 5. إزالة اللون | 25٪ كوادرول | 1 يوم, 37 °C |
| 6. تلطيخ EdU | تسمية كوكتيل | 1 يوم ، RT |
| 7. إزالة الشحوم | 30٪ ثلاثي البيوتانول | 2 ساعة ، 37 درجة مئوية |
| 50٪ ثلاثي البيوتانول | 2 ساعة ، 37 درجة مئوية | |
| 70٪ ثلاثي البيوتانول | 2 ساعة ، 37 درجة مئوية | |
| 8. الجفاف | حل TB-PEG | 3 ساعات * 2 ، 37 درجة مئوية |
| 9. المقاصة | حل BB-PEG | 2 ساعة ، 37 درجة مئوية |
الجدول 1: إجراء إزالة الأنسجة PEGASOS للعظام القلوية مع تلطيخ EdU.
| العمليات | محاليل | الوقت ودرجة الحرارة |
| 1. الحقن داخل الصفاق | 20 ملغ/كغ أليزارين الأحمر | بين عشية وضحاها قبل التوسع |
| 2. الحقن داخل الصفاق | 5 ملغ/ كغ كالسيين | بين عشية وضحاها قبل جمع |
| 3. التروية | 0.02٪ هيبارين و 0.05 مول / لتر EDTA | / |
| 4. التثبيت | 4٪ PFA | O / N، 4 °C |
| 5. إزالة اللون | 25٪ كوادرول | 1 يوم, 37 °C |
الجدول 2: إجراء إزالة الأنسجة PEGASOS للعظام القلوية مع وضع علامات مزدوجة على العظام المعدنية بواسطة Calcein Green و Alizarin red.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
قمنا بتطبيق نموذج ماوس تمدد خياطة قياسي لمراقبة التغيرات المورفولوجية المنتظمة التي تحدث كل أسبوع خلال دورة إعادة العرض10 التي تستغرق شهرا كاملا. هذا النموذج مفيد للبحث في إعادة تشكيل العظام القلوية وتجديدها عن طريق توسيع الغرز الكالفارية ، وكذلك لدراسة خلايا خياطة مختلفة في الجسم الحي. لتقديم نتائج هذا البحث بشكل كامل ، هناك حاجة إلى تصور ثلاثي الأبعاد للأنسجة الملطخة. لذلك ، تم دمج تقنية PEGASOS ، المعروفة بكفاءتها في إزالة الأنسجة الصلبة19,20 ، مع وضع العلامات المزدوجة وتلطيخ EdU للكشف عن معدلات التمعدن الموسعة وتكاثر الخلايا أثناء عملية التوسع.
فيما يتعلق بجراحة توسيع الخياطة ، فإن إحدى الخطوات الرئيسية هي ربط حلقة الاحتفاظ. لضمان وجود رابطة قوية مع سطح العظم ، قمنا بتوحيد عملية النقش والترابط الحمضي في الجزء السفلي من حلقة التجنيب. يجب أن تكون الحلقات الصغيرة على حلقة التجنيب متعامدة مع سطح العظم وتتوافق مع الثقوب الصغيرة في فروة الرأس. بعد خياطة فروة الرأس ، يجب أن تتعرض الحلقات الصغيرة لسطح الجلد من خلال ثقوب صغيرة في حالة طبيعية ومتوازنة لتجنب انهيار حلقة الاحتفاظ أثناء تركيب الزنبرك المطبق بقوة وسلك التوجيه ، مما قد يؤدي إلى فشل الجراحة. بالإضافة إلى ذلك ، يعد اختيار زنبرك مناسب لتطبيق القوة أمرا حيويا لإجراء عملية جراحية ناجحة ، لأنه يجعل تثبيت الزنبرك أسهل مع منع حلقة الاحتجاز من السقوط وتحقيق تطبيق القوة المقصود.
بالمقارنة مع النماذج السابقة ، يوفر هذا النموذج العديد من المزايا. أولا ، يمنع تكوين عيوب عظمية دائرية في العظم الجداري ، مع الحفاظ على وضع تنشيط الخلية. علاوة على ذلك ، يمكن إزالة القوة في أي وقت عن طريق تفكيك الزنبرك ، مما يجعلها مناسبة لإنشاء نموذج تكرار بعد تمدد الإجهاد. تضمن راحة تفكيك الزنبرك أيضا الحد الأدنى من الضرر الثانوي لحيوانات التجارب. علاوة على ذلك ، يمكن تعديل الحجم الميكانيكي لإجهاد الشد بسهولة عن طريق تغيير قوة الزنبرك. الأهم من ذلك ، يحافظ هذا النموذج على البيئة الفسيولوجية الطبيعية حول خياطة الجمجمة ، وبالتالي ضمان دقة النتائج التجريبية.
ومع ذلك ، هناك بعض القيود على نموذج التوسع هذا. أولا ، هناك خطر سقوط حلقة الاحتفاظ إذا كانت القوة مفرطة. يجب على المبتدئين إجراء تمارين أولية في تركيب الربيع للتخفيف من هذا الخطر. ثانيا ، هناك خطر الإصابة بالعدوى عند فتح فروة الرأس وكشف الجمجمة ، لذا فإن تطهير الأدوات ضروري ، وتقصير مدة الجراحة مفيد للشفاء. الإفراط في التخدير قد يؤدي أيضا إلى موت الفئران.
فيما يتعلق بطريقة PEGASOS السلبية ، فهي قابلة للتطبيق لتحقيق الشفافية في الأنسجة والأعضاء الفردية ، وكذلك كامل رأس وجسم الفئران الصغيرة. على الرغم من كفاءتها للعظام الكلفارية الكاملة ، إلا أن وقت المعالجة الأطول مطلوب للعينات الأكبر ، خاصة لأنسجة العظام الكاملة أو أنسجة العظام الطويلة السائبة ذات المفاصل. من المهم ملاحظة أنه لا ينبغي إجراء إزالة الكلس من الأنسجة عند استخدام بروتوكول وضع العلامات المزدوجة ، لأنه يتداخل مع عملية التلطيخ. تتميز طريقة إزالة الأنسجة PEGASOS بالمرونة أيضا ، مما يسمح بالجمع بين طرق وضع العلامات المختلفة ، على سبيل المثال لا الحصر دمج EdU أو وضع العلامات المزدوجة على الكالسيوم ، ولكن أيضا التألق الداخلي في نماذج الفئران المعدلة وراثيا أو صبغة التثبيت الكامل أو تلطيخ الأجسام المضادة ، وكل ذلك مع مضان محفوظ جيدا.
مع تأثيرات مستقرة وقابلية عالية للتكرار ، فإن نموذج توسيع الخياطة هذا مناسب لسلالات مختلفة من الفئران المعدلة وراثيا من مختلف الأعمار. تتيح القدرة على ضبط حجم إجهاد الشد وسحب القوة في أي وقت إجراء بحث مناسب عن التكرار بعد تحفيز الإجهاد. من خلال الجمع بين طريقة وضع العلامات المزدوجة للعظام المعدنية مع تقنية إزالة الأنسجة PEGASOS ، يمكننا ملاحظة التوزيع الزماني المكاني ثلاثي الأبعاد للخلايا الجذعية لخياطة الجمجمة أثناء إعادة تشكيل العظام ، مما يتيح مزيدا من الاستكشاف للعلاقة بين SUSCs والإجهاد الميكانيكي ، بالإضافة إلى آلياته المحددة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
نشكر منصة المختبر ومساعدة معهد الأذن ، كلية الطب بجامعة شنغهاي جياوتونغ. تم دعم هذا العمل من قبل برنامج شنغهاي بوجيانغ (22PJ1409200) ؛ المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 11932012) ؛ مؤسسة البحث العلمي لما بعد الدكتوراه في مستشفى الشعب التاسع في شنغهاي ، كلية الطب بجامعة شنغهاي جياو تونغ ؛ تمويل برنامج البحوث الأساسية لمستشفى الشعب التاسع التابع لكلية الطب بجامعة شنغهاي جياو تونغ (JYZZ154).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37% Acid etching | Xihubiom | E10-02/1807011 | |
| Alizarin red | Sigma-Aldrich | A3882 | |
| AUSTRALIAN WIRE | A.J.WILCOCK | 0.014'' | |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | B6630 | |
| Calcein green | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Copper(II) sulfate, anhydrous | Sangon Biotech | A603008 | |
| Dynamometer | Sanliang | SF-10N | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| EdU | Invitrogen | E104152 | |
| Laser Confocal Microscope | Leica | SP8 | |
| PBS | Sangon Biotech | E607008 | |
| PEG-MMA 500 | Sigma-Aldrich | 447943 | |
| PFA | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| pH Meters | Mettler Toledo | S220 | |
| Quadrol | Sigma-Aldrich | 122262 | |
| Sodium Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| Sodium bicarbonate | Sangon Biotech | A500873 | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A610476 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Spring | TAOBAO | 0.2*1.5*1*7 | |
| Sulfo-Cyanine3 azide | Lumiprobe | A1330 | |
| tert-Butanol | Sigma-Aldrich | 360538 | Protect from light. Do not freeze. |
| Transbond MIP Moisture Insensitive Primer |
3M Unitek | 712-025 | |
| Transbond XT Light Cure Adhesive Paste |
3M Unitek | 712-035 | |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | V900257 | |
| Tris-buffered saline | Sangon Biotech | A500027 |
References
- Opperman, L. A. Cranial sutures as intramembranous bone growth sites. Developmental Dynamics. 219 (4), 472-485 (2000).
- Thenier-Villa, J. L., Sanromán-Álvarez, P., Miranda-Lloret, P., Plaza Ramírez, M. E. Incomplete reossification after craniosynostosis surgery-incidence and analysis of risk factors: a clinical-radiological assessment study. Journal Of Neurosurgery-pediatrics. 22 (2), 120-127 (2018).
- Markiewicz, M. R., Recker, M. J., Reynolds, R. M. Management of sagittal and lambdoid craniosynostosis: open cranial vault expansion and remodeling. Oral And Maxillofacial Surgery Clinics Of North America. 34 (3), 395-419 (2022).
- Mao, J. J., Wang, X., Kopher, R. A. Biomechanics of craniofacial sutures: orthopedic implications. Angle Orthodontist. 73 (2), 128-135 (2003).
- Shayani, A., Sandoval Vidal, P., Garay Carrasco, I., Merino Gerlach, M. Midpalatal suture maturation method for the assessment of maturation before maxillary expansion: a systematic review. Diagnostics (Basel). 12 (11), 2774 (2022).
- Suzuki, H., et al. Miniscrew-assisted rapid palatal expander (MARPE): the quest for pure orthopedic movement. Dental Press Journal Of Orthodontics. 21 (4), 17-23 (2016).
- Yu, M., et al. Cranial suture regeneration mitigates skull and neurocognitive defects in craniosynostosis. Cell. 184 (1), 243-256 (2021).
- Roth, D. M., Souter, K., Graf, D. Craniofacial sutures: Signaling centres integrating mechanosensation, cell signaling, and cell differentiation. European Journal of Cell Biology. 101 (3), 151258 (2022).
- Zhao, H., et al. The suture provides a niche for mesenchymal stem cells of craniofacial bones. Nature Cell Biology. 17 (4), 386-396 (2015).
- Jing, D., et al. Response of Gli1(+) suture stem cells to mechanical force upon suture expansion. Journal of Bone And Mineral Research. 37 (7), 1307-1320 (2022).
- Xu, Y., Malladi, P., Chiou, M., Longaker, M. T. Isolation and characterization of posterofrontal/sagittal suture mesenchymal cells in vitro. Plastic and Reconstructive Surgery. 119 (3), 819-829 (2007).
- Kong, L., et al. Isolation and characterization of human suture mesenchymal stem cells in vitro. International Journal of Stem Cells. 13 (3), 377-385 (2020).
- Ikegame, M., et al. Tensile stress induces bone morphogenetic protein 4 in preosteoblastic and fibroblastic cells, which later differentiate into osteoblasts leading to osteogenesis in the mouse calvariae in organ culture. Journal of Bone And Mineral Research. 16 (1), 24-32 (2001).
- Liu, S. S., Opperman, L. A., Buschang, P. H. Effects of recombinant human bone morphogenetic protein-2 on midsagittal sutural bone formation during expansion. American Journal of Orthodontics And Dentofacialorthopedics. 136 (6), 768-769 (2009).
- Liang, W., Ding, P., Li, G., Lu, E., Zhao, Z. Hydroxyapatite nanoparticles facilitate osteoblast differentiation and bone formation within sagittal suture during expansion in rats. Drug Design Development and Therapy. 15, 905-917 (2021).
- Morinobu, M., et al. Osteopontin expression in osteoblasts and osteocytes during bone formation under mechanical stress in the calvarial suture in vivo. Journal of Bone And Mineral Research. 18 (9), 1706-1715 (2003).
- Hwang, S., Chung, C. J., Choi, Y. J., Kim, T., Kim, K. H. The effect of cetirizine, a histamine 1 receptor antagonist, on bone remodeling after calvarial suture expansion. Korean Journal of Orthodontics. 50 (1), 42-51 (2020).
- Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).
- Jing, D., et al. Tissue clearing and its application to bone and dental tissues. Journal of Dental Research. 98 (6), 621-631 (2019).
- Luo, W., et al. Investigation of postnatal craniofacial bone development with tissue clearing-based three-dimensional imaging. Stem Cells Development. 28 (19), 1310-1321 (2019).
