Summary
Dit protocol presenteert een gestandaardiseerd muismodel voor hechtingsexpansie en een 3D-visualisatiemethode om de mechanobiologische veranderingen van de hechting en botremodellering onder trekkrachtbelasting te bestuderen.
Abstract
Craniofaciale hechtingen spelen een cruciale rol die verder gaat dan vezelige gewrichten die craniofaciale botten met elkaar verbinden; Ze dienen ook als de primaire niche voor de groei van calvariale en gezichtsbotten, met mesenchymale stamcellen en osteoprogenitors. Aangezien de meeste craniofaciale botten zich ontwikkelen door intramembraneuze ossificatie, fungeren de marginale regio's van de hechtingen als initiatiepunten. Vanwege dit belang zijn deze hechtingen intrigerende doelwitten geworden in orthopedische therapieën zoals veerondersteunde uitzetting van het schedelgewelf, snelle maxillaire expansie en maxillaire protractie. Onder orthopedische opsporingskracht worden hechtstamcellen snel geactiveerd en worden ze een dynamische bron voor botremodellering tijdens expansie. Ondanks hun belang blijven de fysiologische veranderingen tijdens botremodelleringsperioden slecht begrepen. Traditionele sectiemethoden, voornamelijk in de sagittale richting, leggen niet de uitgebreide veranderingen vast die zich voordoen gedurende de hele hechting. Deze studie stelde een standaard muismodel vast voor sagittale hechtingsexpansie. Om veranderingen in botremodellering na uitzetting van de hechting volledig te visualiseren, werd de PEGASOS-methode voor het opruimen van weefsel gecombineerd met EdU-kleuring op het hele geheel en dubbele labeling van calciumcheleren. Dit maakte de visualisatie mogelijk van sterk prolifererende cellen en nieuwe botvorming over de gehele calvariale botten na expansie. Dit protocol biedt een gestandaardiseerd muismodel voor hechtingsexpansie en een 3D-visualisatiemethode, die licht werpt op de mechanobiologische veranderingen in hechtingen en botremodellering onder trekkrachtbelasting.
Introduction
Craniofaciale hechtingen zijn vezelige weefsels die craniofaciale botten met elkaar verbinden en een essentiële rol spelen bij de groei en remodellering van craniofaciale botten. De structuur van de hechting lijkt op een rivier en zorgt voor een stroom van celbronnen om de "rivieroever" te voeden en op te bouwen, bekend als de osteogene fronten, die bijdragen aan de vorming van craniofaciale botten via intramembraneuze osteogenese1.
De belangstelling voor craniofaciale hechtingen is gedreven door klinische behoeften om voortijdige sluiting van schedelhechtingen en disfunctie van aangezichtshechtingen te begrijpen, wat kan leiden tot craniofaciale misvormingen en zelfs levensbedreigende aandoeningen bij kinderen. Open hechting wordt routinematig gebruikt bij klinische behandeling, maar follow-up op lange termijn heeft bij sommige patiënten een onvolledig re-ossificatierecidiefaangetoond2. Minimaal invasieve craniotomie met behulp van expansieveren of endoscopische streepcraniectomie kan een veiligere benadering bieden om de potentiële hechting te behouden in plaats van de weefsels weg te gooien3. Evenzo zijn orthopedische therapieën zoals gezichtsmaskers en expansieapparaten op grote schaal gebruikt om sagittale of horizontale maxillaire hypoplasie te behandelen, waarbij sommige onderzoeken de leeftijdsgrens uitbreidden om volwassen patiënten te behandelen via minischroef-geassisteerde palatinale expanders 4,5,6. Bovendien is craniale hechtdraadregeneratie met mesenchymale stamcellen (MSC's) in combinatie met biologisch afbreekbare materialen een potentiële therapie in de toekomst, die een nieuwe richting biedt voor de behandeling van gerelateerde ziekten. Het functieproces of het regulerende mechanisme van hechtingen blijft echter ongrijpbaar.
Botremodellering bestaat voornamelijk uit een balans tussen botvorming door osteoblasten en botresorptie door osteoclasten, waarbij osteogene differentiatie van stamcellen gestimuleerd door mechanische signalen een belangrijke rol speelt. Na tientallen jaren van onderzoek is gebleken dat craniofaciale hechtingen zeer plastische mesenchymale stamcelniches zijn8. Hechtstamcellen (SuSC's) zijn een heterogene groep stamcellen, behorend tot mesenchymale stamcellen (MSC's) of botstamcellen (SSC's). SuSC's worden in vivo gelabeld door vier markers, waaronder Gli1, Axin2, Prrx1 en Ctsk. Met name Gli1+ SuSC's hebben de biologische kenmerken van stamcellen strikt geverifieerd, niet alleen met een hoge expressie van typische MSC-markers, maar ook met een uitstekend osteogeen en chondrogenepotentieel. Eerder onderzoek heeft aangetoond dat Gli1+ SuSC's actief bijdragen aan de vorming van nieuw bot onder trekkracht, door ze te identificeren als de bron van hechtstamcellen die afleidingsosteogenese ondersteunt10.
In het verleden werden uitgebreide mechanische eigenschappen van stamcellen in vitro bestudeerd via Flexcell, vierpuntsbuiging, micromagneetlaadsysteem en andere. Hoewel mesenchymale cellen van schedelhechtingen van muizen in vitrozijn geïdentificeerd 11 en mesenchymale stamcellen van menselijke hechtingen onlangs ook zijn geïsoleerd12, blijft de biomechanische respons van hechtcellen onduidelijk in het in vitro systeem. Om het botremodelleringsproces verder te onderzoeken, is een hechtdraadexpansiemodel opgesteld op basis van geïsoleerde calvaria-orgaancultuur, wat de weg vrijmaakt voor het opstellen van een bruikbaar in vivo hechtdraadexpansiemodel 1,13. Konijnen14 en ratten15 zijn de meest gebruikte dieren in fundamenteel onderzoek voor hechtingsexpansie. Muizen hebben echter de voorkeur voor diermodellen voor het onderzoeken van ziekten bij de mens vanwege hun zeer homologe genoom met mensen, talrijke genmodificatielijnen en een sterk reproductief hybridisatievermogen. Bestaande muismodellen van craniale hechtdraadexpansie vertrouwen doorgaans op orthodontische veerdraden van roestvrij staal om trekkracht uit te oefenen op de sagittale hechting16,17. In deze modellen worden twee gaten gemaakt in elke kant van de pariëtale botten om het expansieapparaat te bevestigen, en de draden zijn ingebed onder de huid, wat de celactiveringsmodus kan beïnvloeden.
Wat de visualisatiemethode betreft, wordt de tweedimensionale waarneming van plakjes in de sagittale richting al tientallen jaren algemeen toegepast. Aangezien botremodellering echter een complex driedimensionaal dynamisch proces is, is het verkrijgen van volledige driedimensionale informatie een dringende behoefte geworden. De PEGASOS-weefseltransparantietechniek is ontwikkeld om aan deze eis te voldoen18,19. Het biedt unieke voordelen voor de transparantie van harde en zachte weefsels, waardoor het volledige botremodelleringsproces in een driedimensionale ruimte kan worden gereproduceerd.
Om een dieper en uitgebreider begrip te krijgen van de fysiologische veranderingen in de botremodelleringsperioden, werd een standaard sagittale hechtdraadexpansiemuismodel met een veerinstelling tussen de handgemaakte houders opgesteld10. Met een gestandaardiseerde zure ets- en hechtingsprocedure kon het expansieapparaat stevig aan het schedelbot worden gehecht, waardoor een trekkracht loodrecht op de sagittale hechting werd gegenereerd. Bovendien werd de PEGASOS-weefselreinigingsmethode toegepast na dubbele labeling van het gemineraliseerde bot na expansie om de veranderingen in de botmodellering na uitzetting van de hechting volledig te visualiseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle hier beschreven experimentele procedures zijn goedgekeurd door het Animal Care Committee van het Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (SH9H-2023-A616-SB). In dit onderzoek werden 4 weken oude C57BL/6 mannelijke muizen gebruikt. Alle gebruikte instrumenten werden voorafgaand aan de procedure gesteriliseerd.
1. Voorbereiding van het hechtdraadexpansiemodel
- Voorbereiding van twee retentiehouders.
- Gebruik 0.014'' Australische draad of roestvrij staaldraad (zie Materiaaltabel) om een spiraalvormige lus te maken met een lichtdraadtang. De diameter van de lus is 2 mm en de staart van 1 mm is aan twee zijden gereserveerd (figuur 1A).
- Steriliseer de draden en houders voor de operatie in een autoclaaf, plasmasterilisator of geschikt koud sterilisatiemiddel (bijv. glutaaraldehyde).
- Voorbereiding van de veren.
- Bereid op maat gemaakte roestvrijstalen veren voor.
OPMERKING: In dit onderzoek wordt de drukveer met een draaddiameter van 0,2 mm, een buitendiameter van 1,5 mm, een intervalruimte van 1 mm en een lengte van 7 mm gebruikt (Figuur 1B). Elke veercompressie van 1 mm verkreeg een stuwkracht van ongeveer 30 g. - Snijd de veer in een beschikbare lengte voordat u deze instelt. Bevestig de kracht voor de gespecialiseerde veer vóór het experiment.
OPMERKING: De grootte van veren is gevarieerd zolang de krachtgrootte hetzelfde is in parallelle experimenten. De kracht wordt gemeten door een uniaxiaal testinstrument op tafel of een kleine elektronische dynamometer (zie Materiaaltabel) als de toestand beperkt is. De lengteverandering wordt geëvalueerd tot de krachtgrootte (Figuur 1C-E). Het is met name noodzakelijk om de veerkrachtbelastingswaarde te wijzigen op basis van de leeftijd, de botconditie van de muis en de onderzoeksobjecten. - Maak een rechte Australische draad of rechte staaldraad van 7 mm lengte en maak twee vellen papier met een diameter van 2 mm om als barrières te gebruiken (Figuur 1F).
- Bereid op maat gemaakte roestvrijstalen veren voor.
2. Sagittale hechtingsexpansiechirurgie
- Verdoving: Verdoof de muizen met tiletamine (25 mg/kg), zolazepam (25 mg/kg) en Xylazine (10 mg/kg). Breng tegelijkertijd steriele oogzalf aan op de ogen om uitdroging van de hoornvliezen te voorkomen. Beoordeel de diepte van de anesthesie van de muizen via een teenknijp.
OPMERKING: De volgende kenmerken geven aan dat de muis goed is verdoofd: langzame en gestage ademhaling, zwakte van ledematen, spierontspanning, verdwijning van huidacupunctuurreflex en ooglidreflex, evenals zwakkere hoornvliesreflex. - Vacht verwijderen en desinfecteren: Verwijder voorzichtig de vacht op de bovenkant van het hoofd met ontharingscrème; Vermijd het aanraken van de ogen. Gebruik kort daarna afwisselend jodoforen en 75% alcohol om de operatieplaats te desinfecteren. Dien meloxicam (1 mg/kg) als analgesie toe aan de muizen door middel van subcutane injectie.
- Fixatie van de lichaamshouding: Leg de muis op de buik en gebruik chirurgische tapes om de ledematen op de operatietafel te fixeren.
- Open hoofdhuidflap: Gebruik een chirurgische schaar om een boogvormige flap langs de hoofdhuid bij de nek van de muis uit te voeren, waardoor de sagittale hechting en de omliggende schedel volledig zichtbaar worden. Bevestig daarna de hoofdhuidflap met een 6-0 hechting op de operatietafel.
- Lijm de retentiehouders na het etsen met zuur.
- Droog de schedel en ets deze gedurende 20 s met 37% fosforzuur en gebruik een normale zoutoplossing om de zuurets op te ruimen (Figuur 2A). Een kalkachtig residu zal zichtbaar zijn na het drogen van de schedel met de rubberen pipetbol.
- Cementeer de twee houders (voorbereid in stap 1.1) aan beide zijden van de pariëtale botten op 3 mm van de sagittale hechtingen met een lichtuitgeharde lijm (figuur 2B).
- Reset de hoofdhuidflap.
- Plaats de hoofdhuidflap handmatig terug (Figuur 2C). Label de positie van de houders, knip twee kleine gaatjes in de hoofdhuid op de overeenkomstige positie van de bilaterale retentiehouders en reset vervolgens de geflapte hoofdhuid.
- Steek tegelijkertijd de kleine lusjes door de gaatjes om het huidoppervlak bloot te leggen. Hecht de gebogen incisie met een 6-0 hechting (Figuur 2D). Voor het herstel van de huid is één tot drie dagen uitgetrokken. Dien meloxicam (1 mg/kg) toe aan de muizen door middel van subcutane injectie om de 24 uur gedurende 1 tot 3 dagen.
OPMERKING: Controleer na de operatie dagelijks de activiteit van de hoofdhuid van de muis en of de houders eraf vallen. Er zijn verschillende soorten huid op het gebied van kleur en dikte; De hoofdhuid van de gezonde huid behoudt de oorspronkelijke kleur en de huidranden zullen na het hechten geleidelijk samensmelten. Als er een infectie van de hoofdhuid wordt gevonden, of als het chirurgische apparaat eraf is gevallen, verwijder dan de muis uit het onderzoek en euthanaseer deze.
- Installeer de veer en de voerdraad.
- Snijd de veer 1 mm langer dan de afstand tussen de twee houders.
- Druk de geselecteerde drukveer samen en plaats deze aan beide zijden tussen de kleine spoelen.
- Leid de roestvrijstalen draad door de kleine spoelen en de veer en laat de veer los om een startstuwkracht van ongeveer 30 g te verkrijgen.
- Controleer of de hoofdhuid onder het veergebied van de muis geen compressie heeft.
- Nadat u hebt gecontroleerd of de hechting stevig is zonder enige losheid, plakt u twee stukjes papier tussen de veer en de houders met een lichtuitgeharde lijm om aan beide uiteinden van de veer barrières op te werpen (Figuur 2E,F).
3. Dubbele etikettering van gemineraliseerde botten
- Bereiding van de voorraadoplossing.
- Bereid een verdunningsoplossing met gedestilleerd water dat 0,9% NaCl en 2% NaHCO3 bevat.
- Gebruik de verdunningsoplossing voor de bereiding van 20 mg/ml alizarinecomplexdihydraat en 10 mg/ml calceïne (zie materiaaltabel).
- Stel de pH in op 7,4 met behulp van een pH-meetapparaat. Spoel de pH-sonde tussen de metingen door om nauwkeurige metingen te garanderen.
- Doe de kleurstof in een steriele container en bewaar deze in de koelkast bij 4 °C; Folie wordt gebruikt om licht buiten te houden.
- Bereid de werkoplossing voor. Verdun de stockoplossing vóór injectie met behulp van een oplossingsoplossing tot 1 mg/ml voor calcium en 2 mg/ml voor alizarinecomplexdihydraat.
- Injecteer intraperitoneaal 5 mg/kg Calceïne groen en 20 mg/kg Alizarine rood op twee tijdstippen om de gemineraliseerde botten te labelen en de veranderingen tussen twee tijdstippen te analyseren. Over het algemeen worden de monsters 12-14 uur na injectie verzameld.
NOTITIE: Verwarm de kleurstoffen vóór de injectie en zorg ervoor dat de injectietijd niet minder dan 3 minuten is. Het injectie-interval is afhankelijk van het tijdstip van expansie. In deze studie werden respectievelijk Alizarinerood en Calceïnegroen 's nachts geïnjecteerd (O/N) vóór expansie en O/N vóór verzameling. - Verzamel een dag na de tweede injectie hele calvariale botten die zijn voorbereid voor de weefselopruimprocedure.
4. EdU-kleuring
- Intraperitoneale injectie: Intraperitoneaal injecteren van EdU 2 uur voordat de muizen worden geëuthanaseerd (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen). De dosis is 1 mg/10 g lichaamsgewicht.
- Bereiding van de etiketteringscocktail: Meng Tris-gebufferde zoutoplossing (100 mmol/L definitief, pH 7,6), CuSO4 (4 mmol/L definitief), Sulfo-Cyaan 3 Azide (2-5 μmol/L definitief) en Natriumascorbaat (100 mmol/L definitief, bij elk gebruik vers gemaakt) (zie Materiaaltabel).
- EdU kleuring voor het hele lichaam: Na de weefselontkleuringsstap in de PEGASOS-weefselreinigingsmethode (stap 7), plaatst u monsters gedurende 1 dag bij kamertemperatuur (RT) in de etiketteringscocktail.
5. Micro-computertomografie beeldvorming
- Weefselfixatie en -opslag: Fixeer de calvariale botten in 4% paraformaldehyde (PFA) bij 4 °C O/N en bewaar ze in 0,5% PFA voordat ze worden gescand.
- Scannen en analyseren: Scan de monsters met een micro-computertomografie (μCT) beeldvormingssysteem met hoge resolutie en een voxelgrootte van 7 μm.
6. Bereiding van werkoplossing voor PEGASOS-weefselreiniging
- 4% polyformaldehyde (PFA): Los 4 g PFA-poeder op in 1× PBS tot 100 ml.
- Hartperfusie-oplossing: 0,02% heparine, dat wil zeggen 20 mg heparinepoeder opgelost in 1× PBS tot 100 ml; U kunt ook 0,05 mol/l EDTA gebruiken, d.w.z. 0,05 mol ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) (zie materiaaltabel), opgelost in een gedeïoniseerde waterige oplossing tot een totaal volume van 1 L.
- Ontkalkingsoplossing: 0,5 mol/L EDTA, d.w.z. 0,5 mol ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA), opgelost in een gedeïoniseerde waterige oplossing tot een totaal volume van 1 L.
- Ontkleuringsoplossing: 25% Quadrol, dat is 250 ml Quadrol (N, N, N', N' - Tetrakis (2-Hydroxypropyl) ethyleendiamine) (zie Materiaaltabel) opgelost in gedeïoniseerd water tot een totaal volume van 1 L.
NOTITIE: Vanwege de viscositeit van Quadrol kan het worden verwarmd tot 60 °C om de vloeibaarheid vóór configuratie te vergroten. - Ontvettingsoplossing: 30%, 50%, 70% tert-butanol (tB) (zie materiaaltabel), bereid met water per volumefractie.
OPMERKING: Aangezien zuiver tB bij kamertemperatuur kristallijn is, moet het worden verwarmd tot 60 °C totdat het is opgelost voordat het kan worden gebruikt. Vervolgens wordt 3% tot 5% (v/v) triethanolamine (TEA) toegevoegd om de pH van de oplossing te reguleren >9,5. - Uitdrogingsoplossing: TB-PEG-oplossing, 70% tB + 27% PEG-MMA + 3% Quadrol (v/v), waarbij PEG-MMA poly (ethyleenglycol) methylethermethacrylaat is met een gemiddeld molecuulgewicht van 500 (Poly (ethyleenglycol) Methacrylaat 500, PEG-MMA 500) (zie Materiaaltabel).
- Transparante oplossing: BB-PEG-oplossing, 75% BB + 22% PEG-MMA + 3% Quadrol (v/v), waarbij BB benzylbenzoaat (BB) is.
7. Transparantie van kuitbeenderen met de PEGASOS-methode
- Verdoof de muis door intraperitoneale injectie van anesthetica (stap 2.1) en beoordeel de diepte van de anesthesie van de muis door middel van de knijpreactie om er zeker van te zijn dat er geen weerstandsreactie is vóór de hartperfusie.
- Voer hartperfusie en fixatie uit.
- Houd de buik van de muis omhoog, bevestig de ledematen met plakband en snijd voorzichtig langs de omtrek van de thorax om deze volledig bloot te leggen.
- Onmiddellijk na het maken van een kleine snee in het rechter atrium met een oogheelkundige schaar, steekt u een perfusienaald van 22 G in de top van de linker hartkamer.
NOTITIE: Alleen de punt van de naald wordt ingebracht om beschadiging van de hartklep door overmatig inbrengen te voorkomen. Anders komt cardiale perfusievloeistof in de longcirculatie terecht, wat het perfusie-effect van de systemische circulatie beïnvloedt. - Duw de 30-50 ml hartperfusievloeistof (stap 6.2) in de spuit. Het is te zien dat de lever geleidelijk bleek wordt van felrood.
- Nadat de uitstroomvloeistof uit het rechter atrium volledig helder is geworden, laat u 4% PFA-oplossing in gelijk volume trekken. De werking van PFA-perfusie wordt uitgevoerd in een geventileerde kap.
- Ontleed en scheid de weefsels en organen en fixeer ze 's nachts met 4% PFA bij 4 °C.
- Weefselontkalking: Voor monsters die zijn verwerkt door EdU-kleuring, plaatst u het gefixeerde harde weefsel in 0,5 mol/L EDTA (pH 7,0) oplossing (10 ml) in een schudtafel bij 37 °C gedurende ongeveer 2 dagen en ververs u de vloeistof dagelijks.
OPMERKING: Sla het ontkalkingsproces over in de genormaliseerde PEGASOS-methode voor botten met calciumchelaatvormer om de signalering volledig te behouden. Ontkalking is nodig om de botten te behandelen om de endogene fluorescentie of immunogekleurde signalen van de hele berg te visualiseren. - Weefselontkleuring: Plaats de vaste calvariale botten in 25% Quadrol-oplossing (20 ml) gedurende 1 dag in een schudtafel bij 37 °C en ververs de vloeistof eenmaal.
OPMERKING: De ontkleuringstijd is gerelateerd aan het heemgehalte in het weefsel. Let op de kleur van de behandelingsvloeistof, aangezien de kleurdiepte de noodzaak aangeeft om de vloeistofvervangende behandeling voort te zetten. - EdU-kleuring: Spoel de monsters gedurende 5 minuten (drie keer) in 1× PBS en dompel ze vervolgens 1 dag onder in de etiketteringscocktail. Spoel daarna de monsters gedurende 1 uur (drie keer) in 1× PBS.
- Weefselontvetting en uitdroging
- Plaats de weefsels in achtereenvolgens in oplossingen van 30% tB, 50% tB en 70% tB om de gradiënt te verlagen op een schudtafel bij 37 °C. Plaats in elke concentratie gedurende ongeveer 2 uur.
- Dehydrateer de monsters vervolgens gedurende 6 uur in TB-PEG-oplossing op een schudtafel bij 37 °C.
OPMERKING: De bovenstaande verwerkingstijd kan worden verlengd of verkort, afhankelijk van het aantal weefsels.
- Weefseltransparantie: Plaats het volledig gedehydrateerde weefsel in BB-PEG-oplossing op een schudtafel bij 37 °C (2-4 uur) tot het transparant is. Momenteel kunnen monsters maximaal 1-2 jaar worden bewaard.
NOTITIE: Nadat het bijna volledig is opgeruimd, opent u het buisdeksel om de monsters bloot te stellen en het medium aan de lucht te brengen door te schudden zal de transparantie verder verbeteren. Deze methode is geschikt voor het verbeteren van de transparantie van individuele weefsels en organen, evenals het hele hoofd en lichaam van jonge muizen. Voor de transparantie van het hele lichaam van volwassen muizen moeten de bovenstaande stappen echter worden uitgevoerd met behulp van een perfusiemethode met volledige cyclus.
8. Beeldvorming
OPMERKING: Confocale microscopie werd in deze studie gebruikt voor 3D-visualisatie van transparante weefsels. Light-sheet microscopie is ook geschikt voor dit protocol. Verschillende besturingssystemen zijn al eerder geverifieerd als beschikbaar. Hier wordt een besturingssysteem voor een confocale lasermicroscoop als voorbeeld genomen (zie Tabel met materialen).
- Volg volgens de gebruikershandleiding de juiste stappen om de confocale laser en LAS AF-bedieningsinterface te openen. Schakel de gewenste laser in verschillende opnamekanalen in en pas het vermogen aan. Stel het optische pad en de bijbehorende golflengte in, 561 nm voor Alizarinerood en 488 nm voor Calcein-groen, die allemaal worden gebruikt voor het EdU-signaal volgens de etiketteringscocktail.
- Plaats de transparante monsters in de concave glazen petrischaal die dikke monsters, ingebedde dozen of zelfgemaakte plaatsingsapparaten zoals waterdichte lijm kan dragen om de transparante monsters onder te dompelen in een transparante vloeistof.
- Selecteer een objectieflens met laag vermogen om het monster snel te lokaliseren. Maak een overzicht van het hele calvariale weefsel met de snelscanfunctie en vind het interessegebied voor beeldvorming.
- Stel het uitgangsvermogen in, selecteer de scanmodus en pas eerst de opnamecoëfficiënten aan (resolutie, scansnelheid, zoomfactor, beeldkwaliteit, gemiddelde achtergrondruis, enz.).
OPMERKING: Over het algemeen varieert Smart Gain van 500 tot 800 (zowel signaal- als ruisverandering); Smart Offset is zo dicht mogelijk bij 0 en zorgt voor beeldkwaliteit (om achtergrondruis te verminderen). Wanneer de PMT-versterking hoger is dan 800, of de HyD-versterking groter is dan 100% en de helderheid nog steeds onvoldoende is, kan de laserintensiteit op de juiste manier worden verhoogd, maar in principe geldt: hoe lager, hoe beter. - Stel de axiale afstand Z-bereik en Z-stap in, die vanaf de ondiepste zijde van de transparante organisatie naar beneden wordt geboord; dat wil zeggen, zet de diepste en ondiepste kanten.
NOTITIE: Bevestig de classificatie en de werkafstand voor elke lens. Stel het Z-bereik zorgvuldig in en gebruik de werkafstand niet die de limiet van de geselecteerde lens overschrijdt. De "z-Galvo" kan worden geselecteerd wanneer fijnregeling nodig is. - Stel de opnameparameters opnieuw in en begin met fotograferen. Na voltooiing voegt u de afbeeldingen samen en verwerkt u ze via de multifunctionele module. Berg ten slotte het instrument op en schakel het uit in de aangegeven volgorde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van dit protocol is een muismodel voor sagittale hechtdraadexpansie opgesteld (Figuur 1-2). Voor 3D-visualisatie van veranderingen in botmodellering na uitzetting van de hechting, werd de PEGASOS-methode voor het opruimen van weefsel toegepast op de gehele calvariale botten na expansie. Na perfusie werden de calvariale botten gescheiden (figuur 3A) en werd het juiste PEGASOS-proces voortgezet (tabel 1 en tabel 2). Opmerkelijk is dat de calvariale botten bijna transparant werden na het volledige PEGASOS-proces, ongeacht of er ontkalking werd uitgevoerd (Figuur 3B,C).
Om de veranderingen na expansie snel te visualiseren, werd μCT gebruikt op de verzamelde en gefixeerde monsters. In vergelijking met de controlegroep (Figuur 4A) zette de schedelhechting geleidelijk en significant uit na het uitoefenen van kracht gedurende 1 dag (Figuur 4B). Op de vijfde dag verschenen er pluizige benige uitsteeksels op de botrand (Figuur 4C).
Voor driedimensionale visualisatie van de juxtapositiesnelheid van de mineralisatie in de gehele hechting na expansie, werd de dubbele labelmethode gebruikt samen met de efficiënte PEGASOS-techniek, zelfs op niet-ontkalkte calvariale botten (Figuur 5). Onder fysiologische omstandigheden waren er kleine veranderingen tussen eerdere labelsignalen (Figuur 5A), terwijl krachtbelasting osteogenese significant activeerde. Het zigzagpatroon van nieuw gemineraliseerd bot, gelabeld met een enkele geelgroene calciummarker, verbreedde zich na 7 dagen uitzetten (Figuur 5B,C). In driedimensionale visualisatie met hoge resolutie duidden de patroonveranderingen van marginale botten op het botremodelleringsproces na uitzetting van de hechting, en de mate van nieuw gevormd bot varieerde aan twee zijden van de hechtingen (Figuur 5C).
Om de proliferatiesnelheid van cellen bij uitzetting van de hechting te visualiseren, werd bovendien geprobeerd EdU-opname in het geheel te maken met behulp van de PEGASOS-weefselverwijderingsmethode met een verkalkingsproces. Met succes, de etikettering was efficiënt en goed bewaard in geruimde weefsels. In de controlegroep waren verschillende EdU+-cellen diffuus verdeeld over de hechtingen (Figuur 6A), wat belangrijk kan zijn voor fysiologische botremodellering en mogelijk over het hoofd wordt gezien bij 2D-secties. Na 1 dag uitzetten bereikten de prolifererende cellen een piek in het midden en de randen van de hechtingen (Figuur 6B). Naarmate de hechting breder werd, nam het aantal prolifererende cellen in de loop van de tijd af en bereikte dag 7 (figuur 6C). De gemarkeerde cellen waren kleine ronde cellen in het beenmerg, wat wijst op bloedcellen, die verschilden van de EdU+ hechtdraadcellen (Figuur 6C).
Figuur 1: Vitale materialen werden voorbereid voor de operatie. Retentiehouders waren gemaakt van roestvrij staaldraad. Hun diameters waren 2 mm en staarten van 1 mm waren aan twee zijden gereserveerd (A). De drukveer met een draaddiameter van 0,2 mm, een buitendiameter van 1,5 mm en een intervalruimte van 1 mm werd toegepast (B). De trekkracht werd gedetecteerd door een dynameter (C,D). Elke veercompressie van 1 mm kreeg in dit experiment een stuwkracht van ongeveer 30 g (E). Stukjes papier werden in de vorm van vliegers met een diameter van 2 mm gesneden om als barrières (F) te gebruiken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Het chirurgische proces voor het uitzetten van hechtingen in het muismodel. Na het omdraaien van de calvariale flap werden zowel het etsen (A) als het verlijmen (B) uitgevoerd op de plaats waar de retentiehouders zouden worden blootgesteld. Na het resetten van de hoofdhuidflap (C) werden de houders blootgesteld op de gemarkeerde positie (D). Er werd een veer tussen twee houders geplaatst om uitzettingskracht uit te oefenen op de calvariale hechtdraad, en twee stukjes papier werden aan beide uiteinden van de veer bevestigd als barrières (E,F) nadat was bevestigd dat de houders stevig waren gehecht. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: De PEGASOS-procedure voor het opruimen van weefsel werd toegepast voor twee calvariale botten met of zonder ontkalking. Na perfusie werden de calvariale botten gescheiden, met enkele met bloed bevlekte en zachte weefsels eraan gehecht (A). Calvariale botten die het ontkalkingsproces (B) of met niet-ontkalking (C) hebben ondergaan, waren bijna volledig transparant na het hele proces van PEGASOS. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Calvariale hechtingen zetten geleidelijk uit na inspanning van trekkracht. μCT-beelden van sagittale hechting zonder krachtbelasting (A) en na krachtbelasting gedurende 1 dag en 5 dagen (B,C). Schaalbalk: 100 μm. Exp = expansie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Osteogenese geactiveerd na uitzetting van de hechting in 3D-beelden. (A-C) Driedimensionale visualisatie van dubbel gelabelde sagittale hechtingen die zijn vrijgemaakt door de PEGASOS-methode. Alizarinerood en Calceïnegroen werden 's nachts intraperitoneaal geïnjecteerd vóór expansie en vóór euthanasie na respectievelijk 7 dagen expansie (B,C), vergeleken met de controlegroep zonder mechanische belasting op dezelfde tijdstippen (A). 5x lens werd gebruikt om de hele hechtdraadbeelden efficiënt te verkrijgen (A,B), en het doosbeeld in (B) werd vergroot in (C, C', C'') afgebeeld met een 10x lens. Schaalbalk in A,B: 100 μm, C: 150 μm. Exp = expansie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Hechtcellen prolifereren sterk bij trekkrachtbelasting in 3D-beelden. Whole-mount incorporatietests in combinatie met de PEGASOS-weefselopruimingsmethode toonden de prolifererende cellen in de hele hechting in stilte (A) of na krachtbelasting gedurende 1 dag en 7 dagen (B,C). Afgebeeld met een 10x lens. Streepjeslijnen omlijnen twee randen voor sagittale hechtingen. Schaalbalk: 100 μm. Exp = expansie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Processen | Oplossingen | Tijd en temperatuur |
| 1. Intraperitoneale injectie | 1 mg/10 g EdU | 2 uur voor het euthanaseren van de muizen |
| 2. Perfusie | 0,02% heparine & 0,05 mol/l EDTA | / |
| 3. Fixatie | 4% PFA | O/N, 4 °C |
| 4. Ontkalking | 10% EDTA | 2 dagen, 37 °C |
| 5. Ontkleuring | 25% Viervoudig | 1 dag, 37 °C |
| 6. EdU-kleuring | Etikettering cocktail | 1 dag, RT |
| 7. Ontvetten | 30% tert-butanol | 2 uur, 37 °C |
| 50% tert-butanol | 2 uur, 37 °C | |
| 70% tert-butanol | 2 uur, 37 °C | |
| 8. Uitdroging | TB-PEG-oplossing | 3 uur*2, 37 °C |
| 9. Opruiming | BB-PEG-oplossing | 2 uur, 37 °C |
Tabel 1: PEGASOS-weefselverwijderingsprocedure voor calvariale botten met EdU-kleuring.
| Processen | Oplossingen | Tijd en temperatuur |
| 1. Intraperitoneale injectie | 20 mg/kg Alizarine rood | Overnachting voor uitbreiding |
| 2. Intraperitoneale injectie | 5 mg/kg Calceïne | overnachting voor het ophalen |
| 3. Perfusie | 0,02% heparine & 0,05 mol/l EDTA | / |
| 4. Fixatie | 4% PFA | O/N, 4 °C |
| 5. Ontkleuring | 25% Viervoudig | 1 dag, 37 °C |
Tabel 2: PEGASOS-weefselreinigingsprocedure voor calvariale botten met dubbele etikettering van gemineraliseerde botten door Calceïnegroen en Alizarinerood.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We pasten een standaard muismodel voor hechtingsexpansie toe om de regelmatige morfologische veranderingen te observeren die elke week optreden gedurende de gehele remodelleringscyclus van een maand10. Dit model is nuttig voor het onderzoeken van calvariale botremodellering en regeneratie door calvariale hechtingen uit te breiden, evenals voor het bestuderen van verschillende hechtcellen in vivo. Om de resultaten van dergelijk onderzoek volledig te presenteren, is driedimensionale visualisatie van gekleurde weefsels nodig. Daarom werd de PEGASOS-technologie, bekend om zijn efficiëntie bij het opruimen van hard weefsel19,20, gecombineerd met dubbele labeling en EdU-kleuring om verhoogde mineralisatiesnelheden en prolifererende cellen tijdens het expansieproces te onthullen.
Met betrekking tot hechtingsexpansiechirurgie is een van de belangrijkste stappen het verlijmen van de borgring. Om een stevige hechting met het botoppervlak te garanderen, hebben we het zuurets- en hechtingsproces aan de onderkant van de borgring gestandaardiseerd. De kleine lusjes op de borgring moeten loodrecht op het botoppervlak staan en overeenkomen met kleine gaatjes op de hoofdhuid. Na het hechten van de hoofdhuid moeten de kleine lussen in een natuurlijke en evenwichtige toestand via kleine gaatjes aan het huidoppervlak worden blootgesteld om te voorkomen dat de retentiering instort tijdens de installatie van de krachtuitoefenende veer en voerdraad, wat kan leiden tot het mislukken van de operatie. Bovendien is het selecteren van een geschikte krachtuitoefenende veer van vitaal belang voor een succesvolle operatie, omdat het het installeren van de veer gemakkelijker maakt en tegelijkertijd voorkomt dat de retentiering eraf valt en de beoogde krachttoepassing wordt bereikt.
In vergelijking met eerdere modellen biedt dit model verschillende voordelen. Ten eerste voorkomt het de vorming van cirkelvormige botdefecten in het pariëtale bot, waardoor de celactiveringsmodus behouden blijft. Bovendien kan de kracht op elk moment worden weggenomen door de veer te demonteren, waardoor deze geschikt is voor het opstellen van een herhalingsmodel na spanningsrekken. Het gemak van het demonteren van de veer zorgt ook voor minimale secundaire schade aan de proefdieren. Bovendien kan de mechanische grootte van de trekspanning eenvoudig worden aangepast door de veerkracht te veranderen. Belangrijk is dat dit model de natuurlijke fysiologische omgeving rond de schedelnaad handhaaft, waardoor de nauwkeurigheid van experimentele resultaten wordt gegarandeerd.
Er zijn echter enkele beperkingen aan dit uitbreidingsmodel. Ten eerste bestaat het risico dat de borgring eraf valt als de kracht te groot is. Beginners moeten voorbereidende oefeningen doen bij het installeren van de veer om dit risico te beperken. Ten tweede bestaat er een risico op infectie bij het openen van de hoofdhuid en het blootleggen van de schedel, dus desinfectie van instrumenten is essentieel en het verkorten van de operatieduur is gunstig voor genezing. Overanesthesie kan ook leiden tot de dood van muizen.
Wat betreft de passieve PEGASOS-methode, deze is toepasbaar op het bereiken van transparantie in individuele weefsels en organen, evenals in het hele hoofd en lichaam van jonge muizen. Hoewel efficiënt voor hele calvariale botten, is een langere verwerkingstijd vereist voor grotere monsters, vooral voor hele botweefsels of bulk lange botweefsels met gewrichten. Het is belangrijk op te merken dat weefselontkalking niet mag worden uitgevoerd bij gebruik van het dubbele labelprotocol, omdat dit het kleuringsproces verstoort. De PEGASOS-weefselreinigingsmethode is ook flexibel, waardoor combinatie met verschillende etiketteringsmethoden mogelijk is, niet beperkt tot EdU-opname of dubbele calciumetikettering, maar ook endogene fluorescentie in transgene muismodellen of kleuring van kleurstof of antilichamen in het hele mont, allemaal met goed bewaarde fluorescentie.
Met stabiele effecten en hoge herhaalbaarheid is dit hechtdraaduitbreidingsmodel geschikt voor verschillende stammen van transgene muizen van verschillende leeftijden. De mogelijkheid om de grootte van trekspanning en terugtrekkracht op elk moment aan te passen, maakt gemakkelijk onderzoek naar herhaling na stressstimulatie mogelijk. Door de dubbele labelmethode van gemineraliseerde botten te combineren met de PEGASOS-weefselopruimingstechniek, kunnen we de driedimensionale spatiotemporele verdeling van craniale hechtdraadstamcellen tijdens botremodellering observeren, waardoor verder onderzoek naar de relatie tussen SUSC's en mechanische stress, evenals de specifieke mechanismen ervan, mogelijk wordt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We danken voor het laboratoriumplatform en de hulp van Ear Institute, Shanghai Jiaotong University School of Medicine. Dit werk werd ondersteund door het Shanghai Pujiang-programma (22PJ1409200); Nationale Stichting voor Natuurwetenschappen van China (nr. 11932012); Postdoctorale Stichting voor Wetenschappelijk Onderzoek van het Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine; Financiering van een fundamenteel onderzoeksprogramma van het Ninth People's Hospital, verbonden aan de Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (JYZZ154).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37% Acid etching | Xihubiom | E10-02/1807011 | |
| Alizarin red | Sigma-Aldrich | A3882 | |
| AUSTRALIAN WIRE | A.J.WILCOCK | 0.014'' | |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | B6630 | |
| Calcein green | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Copper(II) sulfate, anhydrous | Sangon Biotech | A603008 | |
| Dynamometer | Sanliang | SF-10N | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| EdU | Invitrogen | E104152 | |
| Laser Confocal Microscope | Leica | SP8 | |
| PBS | Sangon Biotech | E607008 | |
| PEG-MMA 500 | Sigma-Aldrich | 447943 | |
| PFA | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| pH Meters | Mettler Toledo | S220 | |
| Quadrol | Sigma-Aldrich | 122262 | |
| Sodium Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| Sodium bicarbonate | Sangon Biotech | A500873 | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A610476 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Spring | TAOBAO | 0.2*1.5*1*7 | |
| Sulfo-Cyanine3 azide | Lumiprobe | A1330 | |
| tert-Butanol | Sigma-Aldrich | 360538 | Protect from light. Do not freeze. |
| Transbond MIP Moisture Insensitive Primer |
3M Unitek | 712-025 | |
| Transbond XT Light Cure Adhesive Paste |
3M Unitek | 712-035 | |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | V900257 | |
| Tris-buffered saline | Sangon Biotech | A500027 |
References
- Opperman, L. A. Cranial sutures as intramembranous bone growth sites. Developmental Dynamics. 219 (4), 472-485 (2000).
- Thenier-Villa, J. L., Sanromán-Álvarez, P., Miranda-Lloret, P., Plaza Ramírez, M. E. Incomplete reossification after craniosynostosis surgery-incidence and analysis of risk factors: a clinical-radiological assessment study. Journal Of Neurosurgery-pediatrics. 22 (2), 120-127 (2018).
- Markiewicz, M. R., Recker, M. J., Reynolds, R. M. Management of sagittal and lambdoid craniosynostosis: open cranial vault expansion and remodeling. Oral And Maxillofacial Surgery Clinics Of North America. 34 (3), 395-419 (2022).
- Mao, J. J., Wang, X., Kopher, R. A. Biomechanics of craniofacial sutures: orthopedic implications. Angle Orthodontist. 73 (2), 128-135 (2003).
- Shayani, A., Sandoval Vidal, P., Garay Carrasco, I., Merino Gerlach, M. Midpalatal suture maturation method for the assessment of maturation before maxillary expansion: a systematic review. Diagnostics (Basel). 12 (11), 2774 (2022).
- Suzuki, H., et al. Miniscrew-assisted rapid palatal expander (MARPE): the quest for pure orthopedic movement. Dental Press Journal Of Orthodontics. 21 (4), 17-23 (2016).
- Yu, M., et al. Cranial suture regeneration mitigates skull and neurocognitive defects in craniosynostosis. Cell. 184 (1), 243-256 (2021).
- Roth, D. M., Souter, K., Graf, D. Craniofacial sutures: Signaling centres integrating mechanosensation, cell signaling, and cell differentiation. European Journal of Cell Biology. 101 (3), 151258 (2022).
- Zhao, H., et al. The suture provides a niche for mesenchymal stem cells of craniofacial bones. Nature Cell Biology. 17 (4), 386-396 (2015).
- Jing, D., et al. Response of Gli1(+) suture stem cells to mechanical force upon suture expansion. Journal of Bone And Mineral Research. 37 (7), 1307-1320 (2022).
- Xu, Y., Malladi, P., Chiou, M., Longaker, M. T. Isolation and characterization of posterofrontal/sagittal suture mesenchymal cells in vitro. Plastic and Reconstructive Surgery. 119 (3), 819-829 (2007).
- Kong, L., et al. Isolation and characterization of human suture mesenchymal stem cells in vitro. International Journal of Stem Cells. 13 (3), 377-385 (2020).
- Ikegame, M., et al. Tensile stress induces bone morphogenetic protein 4 in preosteoblastic and fibroblastic cells, which later differentiate into osteoblasts leading to osteogenesis in the mouse calvariae in organ culture. Journal of Bone And Mineral Research. 16 (1), 24-32 (2001).
- Liu, S. S., Opperman, L. A., Buschang, P. H. Effects of recombinant human bone morphogenetic protein-2 on midsagittal sutural bone formation during expansion. American Journal of Orthodontics And Dentofacialorthopedics. 136 (6), 768-769 (2009).
- Liang, W., Ding, P., Li, G., Lu, E., Zhao, Z. Hydroxyapatite nanoparticles facilitate osteoblast differentiation and bone formation within sagittal suture during expansion in rats. Drug Design Development and Therapy. 15, 905-917 (2021).
- Morinobu, M., et al. Osteopontin expression in osteoblasts and osteocytes during bone formation under mechanical stress in the calvarial suture in vivo. Journal of Bone And Mineral Research. 18 (9), 1706-1715 (2003).
- Hwang, S., Chung, C. J., Choi, Y. J., Kim, T., Kim, K. H. The effect of cetirizine, a histamine 1 receptor antagonist, on bone remodeling after calvarial suture expansion. Korean Journal of Orthodontics. 50 (1), 42-51 (2020).
- Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).
- Jing, D., et al. Tissue clearing and its application to bone and dental tissues. Journal of Dental Research. 98 (6), 621-631 (2019).
- Luo, W., et al. Investigation of postnatal craniofacial bone development with tissue clearing-based three-dimensional imaging. Stem Cells Development. 28 (19), 1310-1321 (2019).
