Summary
Bu protokol, gerilme kuvveti yükü altında sütürün mekanobiyolojik değişikliklerini ve kemiğin yeniden şekillenmesini incelemek için standartlaştırılmış bir sütür genişletme fare modeli ve 3 boyutlu bir görselleştirme yöntemi sunar.
Abstract
Kraniyofasiyal sütürler, kraniyofasiyal kemikleri birbirine bağlayan fibröz eklemler olmanın ötesinde çok önemli bir rol oynar; Ayrıca, mezenkimal kök hücreleri ve osteoprogenitörleri barındıran kalvarial ve fasiyal kemik büyümesi için birincil niş görevi görürler. Kraniyofasiyal kemiklerin çoğu intramembranöz kemikleşme yoluyla geliştiğinden, sütürlerin marjinal bölgeleri başlangıç noktaları olarak işlev görür. Bu önemi nedeniyle, bu sütürler yay destekli kraniyal tonoz genişletme, hızlı üst çene genişletme ve üst çene protraksiyonu gibi ortopedik tedavilerde ilgi çekici hedefler haline gelmiştir. Ortopedik izleme kuvveti altında, sütür kök hücreleri hızla aktive edilir ve genişleme sırasında kemiğin yeniden şekillenmesi için dinamik bir kaynak haline gelir. Önemlerine rağmen, kemiğin yeniden şekillenme dönemlerindeki fizyolojik değişiklikler tam olarak anlaşılamamıştır. Başta sagital yönde olmak üzere geleneksel kesit alma yöntemleri, tüm sütür boyunca meydana gelen kapsamlı değişiklikleri yakalamaz. Bu çalışmada sagital sütür genişletme için standart bir fare modeli oluşturulmuştur. Sütür genişletme sonrası kemik yeniden şekillenme değişikliklerini tam olarak görselleştirmek için, PEGASOS doku temizleme yöntemi, tam montajlı EdU boyama ve kalsiyum şelatlama çift etiketleme ile birleştirildi. Bu, genişlemeyi takiben tüm kalvarial kemikler boyunca yüksek oranda çoğalan hücrelerin ve yeni kemik oluşumunun görselleştirilmesine izin verdi. Bu protokol, standartlaştırılmış bir sütür genişletme fare modeli ve 3 boyutlu bir görselleştirme yöntemi sunarak, sütürlerdeki mekanobiyolojik değişikliklere ve gerilme kuvveti yükü altında kemiğin yeniden şekillenmesine ışık tutar.
Introduction
Kraniyofasiyal sütürler, kraniyofasiyal kemikleri birbirine bağlayan ve kraniyofasiyal kemiklerin büyümesinde ve yeniden şekillenmesinde önemli rol oynayan fibröz dokulardır. Sütürün yapısı bir nehri andırır ve intramembranöz osteogenez yoluyla kraniyofasiyal kemiklerin oluşumuna katkıda bulunan osteojenik cepheler olarak bilinen "nehir kıyısını" beslemek ve inşa etmek için bir hücre kaynağı akışı sağlar1.
Kraniyofasiyal sütürlere olan ilgi, çocuklarda kraniyofasiyal deformitelere ve hatta hayatı tehdit eden durumlara yol açabilen kraniyal sütürlerin ve fasiyal sütür disfonksiyonunun erken kapanmasını anlamaya yönelik klinik ihtiyaçlardan kaynaklanmaktadır. Açık süturektomi klinik tedavide rutin olarak kullanılmaktadır, ancak uzun süreli takiplerde bazı hastalarda eksik re-ossifikasyon nüksü gösterilmiştir2. Genleşme yayları veya endoskopik şerit kraniektomi ile desteklenen minimal invaziv kraniotomi, dokuları atmak yerine potansiyel sütürü korumak için daha güvenli bir yaklaşım sağlayabilir3. Benzer şekilde, yüz maskeleri ve genişletme cihazları gibi ortopedik tedaviler, sagital veya yatay maksiller hipoplaziyi tedavi etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır ve bazı çalışmalar, minivida destekli damak genişleticiler aracılığıyla yetişkin hastaları tedavi etmek için yaş sınırlamasını genişletmektedir 4,5,6. Ek olarak, biyolojik olarak parçalanabilen materyallerle birleştirilmiş mezenkimal kök hücreler (MSC'ler) ile kraniyal sütür rejenerasyonu, ilgili hastalıkların tedavisi için yeni bir yön sunan, gelecekte potansiyel bir tedavidir7. Bununla birlikte, sütürlerin işlev süreci veya düzenleyici mekanizması belirsizliğini korumaktadır.
Kemiğin yeniden şekillenmesi esas olarak, osteoblastlar tarafından yürütülen kemik oluşumu ile mekanik sinyallerle uyarılan kök hücrelerin osteojenik farklılaşmasının önemli bir rol oynadığı osteoklastlar tarafından yürütülen kemik rezorpsiyonu arasındaki dengeden oluşur. Onlarca yıl süren araştırmalardan sonra, kraniyofasiyal sütürlerin oldukça plastik mezenkimal kök hücre nişleri olduğu bulunmuştur8. Sütür kök hücreleri (SuSC'ler), mezenkimal kök hücrelere (MSC'ler) veya kemik kök hücrelerine (SSC'ler) ait heterojen bir kök hücre grubudur. SuSC'ler, Gli1, Axin2, Prrx1 ve Ctsk dahil olmak üzere dört belirteç ile in vivo olarak etiketlenir. Özellikle Gli1+ SuSC'ler, kök hücrelerin biyolojik özelliklerini kesin olarak doğrulamıştır, sadece tipik MSC belirteçlerinin yüksek ekspresyonunu sergilemekle kalmaz, aynı zamanda mükemmel osteojenik ve kondrojenik potansiyelgösterir 9. Önceki araştırmalar, Gli1+ SuSC'lerin gerilme kuvveti altında yeni kemik oluşumuna aktif olarak katkıda bulunduğunu ve bunları distraksiyon osteogenezini destekleyen sütür kök hücre kaynağı olarak tanımladığını göstermiştir10.
Geçmişte, kök hücrelerin kapsamlı mekanik özellikleri Flexcell, dört noktalı bükme, mikro mıknatıs yükleme sistemi ve diğerleri aracılığıyla in vitro olarak incelenmiştir. Fare kraniyal sütür kaynaklı mezenkimal hücreler in vitro11 olarak tanımlanmış ve insan sütür mezenkimal kök hücreleri de yakın zamanda izole edilmişolsa da 12, in vitro sistemde sütür hücrelerinin biyomekanik yanıtı belirsizliğini korumaktadır. Kemiğin yeniden şekillenme sürecini daha fazla araştırmak için, izole kalvaria organ kültürüne dayalı bir sütür genişletme modeli oluşturulmuştur ve bu da yararlı bir in vivo sütür genişletme modeli oluşturmanın yolunu açmıştır 1,13. Tavşan14 ve sıçan15, sütür genişletme için temel araştırmalarda en yaygın kullanılan hayvanlar olmuştur. Bununla birlikte, fareler, insanlarla oldukça homolog genomları, çok sayıda gen modifikasyon hattı ve güçlü üreme hibridizasyon yetenekleri nedeniyle insan hastalıklarını araştırmak için tercih edilen hayvan modelleridir. Kraniyal sütür genişlemesinin mevcut fare modelleri, sagital sütüre gerilme kuvveti uygulamak için tipik olarak paslanmaz çelik ortodontik yay tellerine dayanır16,17. Bu modellerde, genişleme cihazını sabitlemek için parietal kemiklerin her iki tarafında iki delik açılır ve teller cildin altına gömülür, bu da hücre aktivasyon modunu etkileyebilir.
Görselleştirme yöntemi ile ilgili olarak, dilimlerin sagital yönde iki boyutlu gözlemi genellikle onlarca yıldır benimsenmiştir. Bununla birlikte, kemiğin yeniden şekillenmesinin karmaşık üç boyutlu dinamik bir süreç olduğu göz önüne alındığında, eksiksiz üç boyutlu bilgi elde etmek acil bir ihtiyaç haline gelmiştir. Bu gereksinimi karşılamak için PEGASOS doku saydamlık tekniği ortaya çıkmıştır18,19. Sert ve yumuşak dokuların şeffaflığı için benzersiz avantajlar sunarak, tüm kemik yeniden şekillenme sürecinin üç boyutlu uzayda yeniden üretilmesini sağlar.
Kemiğin yeniden şekillenme dönemlerindeki fizyolojik değişiklikler hakkında daha derin ve daha kapsamlı bir anlayış elde etmek için, el yapımı tutucular arasında yay ayarlı standart bir sagital sütür genişletme faresi modeli oluşturulmuştur10. Standartlaştırılmış bir asitle aşındırma ve yapıştırma prosedürü ile, genişletme cihazı kraniyal kemiğe sıkıca bağlanabilir ve sagital sütüre dik bir gerilme kuvveti oluşturabilir. Ayrıca, sütür genişletme sonrası kemik modelleme değişikliklerini tam olarak görselleştirmek için ekspansiyon sonrası mineralize kemiğin çift etiketlenmesinden sonra PEGASOS doku temizleme yöntemi uygulandı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada açıklanan tüm deneysel prosedürler, Şanghay Jiao Tong Üniversitesi Tıp Fakültesi, Şanghay Dokuzuncu Halk Hastanesi Hayvan Bakım Komitesi (SH9H-2023-A616-SB) tarafından onaylanmıştır. Bu çalışmada 4 haftalık C57BL/6 erkek fareler kullanıldı. Kullanılan tüm aletler işlem öncesi sterilize edilmiştir.
1. Sütür genişletme modelinin hazırlanması
- İki tutma tutucunun hazırlanması.
- Hafif tel pense ile sarmal bir halka yapmak için 0.014'' Avustralya teli veya paslanmaz çelik tel ( Malzeme Tablosuna bakın) kullanın. Halkanın çapı 2 mm'dir ve iki tarafta 1 mm kuyruk ayrılmıştır (Şekil 1A).
- Ameliyat için telleri ve tutucuları bir otoklav, plazma sterilizatörü veya uygun soğuk sterilantta (örn. glutaraldehit) sterilize edin.
- Yayların hazırlanması.
- Özelleştirilmiş paslanmaz çelik yaylar hazırlayın.
NOT: Bu çalışmada 0,2 mm tel çapı, 1,5 mm dış çap, 1 mm aralık aralığı ve 7 mm uzunluğu olan baskı yayı kullanılmıştır (Şekil 1B). Her 1 mm'lik yay sıkıştırması, yaklaşık 30 g'lık bir itme kuvveti elde etti. - Ayarlamadan önce yayı uygun bir uzunlukta kesin. Deneyden önce özel yay için kuvveti onaylayın.
NOT: Paralel deneylerde kuvvet büyüklüğü aynı olduğu sürece yayların boyutları değişir. Kuvvet, bir masa üstü tek eksenli test cihazı veya durum sınırlıysa küçük bir elektronik dinamometre (Malzeme Tablosuna bakınız) ile ölçülür. Uzunluk değişimi kuvvet büyüklüğüne göre değerlendirilir (Şekil 1C-E). Özellikle, yay kuvveti yükleme değerini yaşa, farenin kemik durumuna ve araştırma nesnelerine göre değiştirmek gerekir. - 7 mm uzunluğunda bir düz Avustralya teli veya düz çelik tel hazırlayın ve bariyer olarak kullanmak için 2 mm çapında iki parça kağıt yapın (Şekil 1F).
- Özelleştirilmiş paslanmaz çelik yaylar hazırlayın.
2. Sagital sütür genişletme ameliyatı
- Anestezi: Fareleri tiletamin (25 mg/kg), zolazepam (25 mg/kg) ve Ksilazin (10 mg/kg) ile uyuşturun. Aynı zamanda, korneaların kurumasını önlemek için gözlere steril oftalmik merhem sürün. Farelerin anestezi derinliğini bir ayak parmağı tutamıyla değerlendirin.
NOT: Aşağıdaki özellikler farenin uygun şekilde uyuşturulduğunu gösterir: yavaş ve sabit nefes alma, uzuvların zayıflığı, kas gevşemesi, cilt akupunktur refleksinin ve göz kapağı refleksinin kaybolması ve ayrıca daha zayıf kornea refleksi. - Kürk çıkarma ve dezenfeksiyon: Başın üstündeki kürkü tüy dökücü kremle dikkatlice çıkarın; Gözlere dokunmaktan kaçının. Kısa bir süre sonra, ameliyat bölgesini dezenfekte etmek için dönüşümlü iyodofor ve% 75 alkol kullanın. Deri altı enjeksiyonu ile farelere analjezi olarak meloksikam (1 mg / kg) uygulayın.
- Vücut pozisyonu sabitleme: Fareyi öne yatırın ve uzuvları ameliyat masasına sabitlemek için cerrahi bantlar kullanın.
- Açık kafa derisi flebi: Farenin boynuna yakın kafa derisi boyunca kavisli bir flep gerçekleştirmek için cerrahi makas kullanın, sagital sütürü ve çevresindeki kafatasını tamamen açığa çıkarın. Bundan sonra, kafa derisi flebini ameliyat masasına 6-0 dikişle sabitleyin.
- Asitle aşındırmadan sonra tutma tutucuları yapıştırın.
- Kafatasını kurutun ve 20 saniye boyunca %37 fosforik asitle aşındırın ve asit aşındırmasını temizlemek için normal salin kullanın (Şekil 2A). Kafatasını kauçuk pipet ampulü ile kuruttuktan sonra kireçli bir kalıntı ortaya çıkacaktır.
- Parietal kemiklerin her iki tarafındaki iki tutucuyu (adım 1.1'de hazırlanan) sagital sütürlerden 3 mm uzakta ışıkla sertleşen bir yapıştırıcı ile yapıştırın (Şekil 2B).
- Kafa derisi kapağını sıfırlayın.
- Kafa derisi flebini manuel olarak geri yerleştirin (Şekil 2C). Tutucuların pozisyonunu etiketleyin, kafa derisinde iki taraflı tutma tutucuların karşılık gelen pozisyonunda iki küçük delik açın ve ardından çırpılmış kafa derisini sıfırlayın.
- Aynı zamanda, cildin yüzeyini ortaya çıkarmak için küçük halkaları deliklerden geçirin. Kavisli insizyonu 6-0 sütür ile dikin (Şekil 2D). Cildin iyileşmesi için bir ila üç gün izin verilir. 1 ila 3 gün boyunca her 24 saatte bir deri altı enjeksiyonla farelere meloksikam (1 mg / kg) uygulayın.
NOT: Ameliyattan sonra, fare kafa derisinin aktivitesini ve tutucuların düşüp düşmediğini günlük olarak kontrol edin. Renk ve kalınlık konusunda çeşitli cilt tipleri vardır; Sağlıklı cilt derisi orijinal rengini koruyacak ve cilt kenarları dikildikten sonra yavaş yavaş birbirine kaynaşacaktır. Kafa derisinde bir enfeksiyon bulunursa veya cerrahi cihaz düşmüşse, fareyi çalışmadan çıkarın ve ötenazi yapın.
- Yayı ve kılavuz teli takın.
- Yayı iki tutucu arasındaki mesafeden 1 mm daha uzun kesin.
- Seçilen baskı yayını sıkıştırın ve her iki taraftaki küçük bobinlerin arasına yerleştirin.
- Paslanmaz çelik teli küçük bobinlerden ve yaydan geçirin ve yaklaşık 30 g'lık bir başlangıç itme kuvveti elde etmek için yayı serbest bırakın.
- Farenin yay alanının altındaki kafa derisinin herhangi bir sıkıştırma olmadığını kontrol edin.
- Yapıştırmanın herhangi bir gevşeklik olmadan sağlam olduğunu onayladıktan sonra, yayın her iki ucunda bariyerler oluşturmak için yay ile tutucular arasına iki kağıt parçasını ışıkla sertleşen bir yapıştırıcı ile yapıştırın (Şekil 2E,F).
3. Mineralize kemiklerin çift etiketlenmesi
- Stok çözeltisinin hazırlanması.
- % 0.9 NaCl ve% 2 NaHCO3 içeren damıtılmış su ile bir seyreltme çözeltisi hazırlayın.
- 20 mg / mL Alizarin kompleks dihidrat ve 10 mg / mL Calcein hazırlamak için seyreltici çözeltiyi kullanın (Malzeme Tablosuna bakınız).
- Bir pH ölçüm cihazı kullanarak pH'ı 7.4'e ayarlayın. Doğru okumalar sağlamak için ölçümler arasında pH probunu yıkayın.
- Boyayı steril bir kaba koyun ve buzdolabında 4 °C'de saklayın; Işığı dışarıda tutmak için folyo kullanılır.
- Çalışma çözümünü hazırlayın. Enjeksiyondan önce, stok çözeltisini bir çözünme çözeltisi kullanarak kalsiyum için 1 mg / mL ve Alizarin kompleks dihidrat için 2 mg / mL'ye seyreltin.
- İntraperitoral olarak 5 mg / kg Calcein yeşili ve 20 mg / kg Alizarin kırmızısını mineralize kemikleri etiketlemek ve iki zaman arasındaki değişiklikleri analiz etmek için iki zaman noktasına enjekte edin. Genel olarak, numuneleri enjeksiyondan 12-14 saat sonra toplayın.
NOT: Enjeksiyondan önce boyaları ısıtın ve enjeksiyon süresinin 3 dakikadan az olmamasına dikkat edin. Enjeksiyon aralığı genişleme zamanına bağlıdır. Bu çalışmada, Alizarin kırmızısı ve Calcein yeşili, sırasıyla genişletmeden önce gece boyunca (O/N) ve toplamadan önce O/N enjekte edildi. - İkinci enjeksiyondan bir gün sonra doku temizleme işlemi için hazırlanan tüm kalvarial kemikleri toplayın.
4. EdU boyama
- İntraperitoneal enjeksiyon: Farelere ötenazi yapmadan 2 saat önce intraperitoneal olarak EdU enjekte edin (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek). Doz 1 mg / 10 g vücut ağırlığıdır.
- Etiketleme kokteyli hazırlama: Tris-tamponlu salin (100 mmol/L final, pH 7.6),CuS04 (4 mmol/L final), Sülfo-Siyanin 3 Azid (2-5 μmol/L final) ve Sodyum Askorbat (100 mmol/L final, her kullanımda taze yapılır) karıştırın (bkz.
- EdU tam montajlı boyama: PEGASOS doku temizleme yönteminde doku renk giderme adımından sonra (7. adım), numuneleri oda sıcaklığında (RT) 1 gün boyunca etiketleme kokteyline koyun.
5. Mikro bilgisayarlı tomografi görüntüleme
- Doku fiksasyonu ve saklanması: Kalvarial kemikleri 4 °C O/N'de %4 paraformaldehit (PFA) içinde sabitleyin ve taramadan önce %0,5 PFA'da saklayın.
- Tarama ve analiz: Numuneleri yüksek çözünürlüklü ve 7 μm voksel boyutuna sahip bir mikro bilgisayarlı tomografi (μCT) görüntüleme sistemi ile tarayın.
6. PEGASOS doku temizliği için çalışma solüsyonunun hazırlanması
- %4 poliformaldehit (PFA): 4 g PFA tozunu 1× PBS ila 100 mL'de çözün.
- Kardiyak perfüzyon çözeltisi:% 0.02 Heparin, yani 1× PBS ila 100 mL içinde çözülmüş 20 mg heparin tozu; alternatif olarak, 0,05 mol/L EDTA, yani 0,05 mol etilen diamin tetraasetik asit (EDTA) kullanın (bkz. Malzeme Tablosu), deiyonize sulu bir çözelti içinde toplam hacmi 1 L'ye kadar çözülür.
- Dekalsifikasyon çözeltisi: 0,5 mol/L EDTA, yani 0,5 mol etilen diamin tetraasetik asit (EDTA), deiyonize sulu bir çözelti içinde toplam 1 L hacme kadar çözülür.
- Renk giderme çözeltisi: Deiyonize suda toplam hacmi 1 L'ye kadar çözülmüş 250 mL Quadrol (N, N, N', N' - Tetrakis (2-Hidroksipropil) etilendiamin) olan %25 Quadrol.
NOT: Quadrol'ün viskozitesi nedeniyle, konfigürasyondan önce akışkanlığını artırmak için 60 °C'ye kadar ısıtılabilir. - Yağ alma çözeltisi: %30, %50, %70 tert-Bütanol (tB) (bkz. Malzeme Tablosu), hacimce su fraksiyonu ile hazırlanır.
NOT: Saf tB'nin oda sıcaklığında kristal olduğu göz önüne alındığında, kullanılmadan önce çözünene kadar 60 °C'ye ısıtılmalıdır. Daha sonra, çözeltinin pH'ını düzenlemek için %3 ila %5 (h/h) trietanolamin (TEA) eklenir >9.5. - Dehidrasyon çözeltisi: TB-PEG çözeltisi, %70 tB + %27 PEG-MMA + %3 Quadrol (h/h), burada PEG-MMA, ortalama moleküler ağırlığı 500 olan poli (etilen glikol) metil eter metakrilattır (Poli (etilen glikol) Metakrilat 500, PEG-MMA 500) (bkz.
- Şeffaf çözelti: BB-PEG çözeltisi, %75 BB + %22 PEG-MMA + %3 Quadrol (h/h), burada BB benzil benzoattır (BB).
7. PEGASOS yöntemi ile kalvarial kemiklerin şeffaflaştırılması
- Fareyi intraperitoneal anestezik enjeksiyonu ile uyuşturun (adım 2.1) ve kardiyak perfüzyondan önce direnç reaksiyonu olmadığından emin olmak için farenin anestezi derinliğini çimdikleme reaksiyonu boyunca değerlendirin.
- Kardiyak perfüzyon ve fiksasyon gerçekleştirin.
- Farenin karnını yukarı doğru tutun, uzuvları yapışkan bantla sabitleyin ve tamamen ortaya çıkarmak için göğüs kafesinin çevresi boyunca dikkatlice kesin.
- Oftalmik makasla sağ atriyumda küçük bir kesi yaptıktan hemen sonra, sol ventrikülün tepesine bir perfüzyon 22 G iğnesi yerleştirin.
NOT: Aşırı yerleştirme yoluyla kalp kapakçığına zarar vermemek için sadece iğne ucu sokulur. Aksi takdirde, kardiyak perfüzyon sıvısı pulmoner dolaşıma girecek ve sistemik dolaşımın perfüzyon etkisini etkileyecektir. - 30-50 mL kardiyak perfüzyon sıvısını (adım 6.2) şırıngaya itin. Karaciğerin yavaş yavaş parlak kırmızıdan soluklaştığı görülebilir.
- Sağ atriyumdan çıkış sıvısı tamamen berraklaştıktan sonra, eşit hacimde% 4 PFA çözeltisi infüze edin. PFA perfüzyonunun çalışması havalandırmalı bir davlumbazda gerçekleştirilir.
- Dokuları ve organları parçalara ayırın ve ayırın ve gece boyunca 4 °C'de% 4 PFA ile sabitleyin.
- Doku dekalsifikasyonu: EdU boyama ile işlenen numuneler için, sabit sert dokuyu yaklaşık 2 gün boyunca 37 °C'de bir çalkalama masasına 0,5 mol/L EDTA (pH 7.0) çözeltisine (10 mL) koyun ve sıvıyı günlük olarak değiştirin.
NOT: Sinyali tam olarak korumak için kalsiyum şelatlama maddesi etiketli kemikler için normalleştirilmiş PEGASOS yönteminde dekalsifikasyon işlemini atlayın. Endojen floresan veya tam montajlı immün boyalı sinyalleri görselleştirmek için kemikleri tedavi etmek için dekalsifikasyon gereklidir. - Doku renk giderme: Sabit calvarial kemikleri 1 gün boyunca 37 ° C'de bir çalkalama masasına %25 Quadrol solüsyonuna (20 mL) yerleştirin ve sıvıyı bir kez değiştirin.
NOT: Renk açma süresi, dokudaki hem içeriği ile ilgilidir. Tedavi sıvısının rengini gözlemleyin, çünkü rengin derinliği sıvı replasman tedavisine devam etme ihtiyacını temsil eder. - EdU boyama: Numuneleri 1× PBS'de 5 dakika (üç kez) durulayın ve ardından 1 gün boyunca etiketleme kokteyline daldırın. Bundan sonra, numuneleri 1 saat (üç kez) boyunca 1× PBS'de durulayın.
- Doku yağdan arındırma ve dehidrasyon
- Dokuları sırayla %30 tB, %50 tB ve %70 tB solüsyonlarına yerleştirerek 37 °C'de bir çalkalama masasında gradyan azaltma işlemi gerçekleştirin. Her konsantrasyonda yaklaşık 2 saat bekletin.
- Daha sonra, numuneleri 37 ° C'de bir çalkalama masasında 6 saat boyunca TB-PEG çözeltisi içinde kurutun.
NOT: Yukarıdaki işlem süresi, doku sayısına bağlı olarak artırılabilir veya azaltılabilir.
- Doku şeffaflığı: Tamamen susuz kalmış dokuyu BB-PEG solüsyonunda şeffaf olana kadar 37 ° C'de (2-4 saat) bir çalkalama masasına yerleştirin. Şu anda, numuneler 1-2 yıla kadar saklanabilir.
NOT: Neredeyse tamamen temizlendikten sonra, numuneleri ve ortamı çalkalama ile havaya maruz bırakmak için tüp kapağını açın, şeffaflığı daha da artıracaktır. Bu yöntem, tek tek doku ve organların yanı sıra genç farelerin tüm baş ve vücudunun şeffaflığını artırmak için uygundur. Bununla birlikte, yetişkin farelerin tüm vücudunun şeffaflığı için, yukarıdaki adımlar tam döngülü bir perfüzyon yöntemi kullanılarak gerçekleştirilmelidir.
8. Görüntüleme
NOT: Bu çalışmada saydam dokuların 3 boyutlu görüntülenmesi için konfokal mikroskopi kullanılmıştır. Işık tabakası mikroskobu da bu protokol için uygundur. Daha önce birkaç işletim sisteminin kullanılabilir olduğu doğrulanmıştır. Burada, bir lazer konfokal mikroskop işletim sistemi örnek olarak alınmıştır (bkz.
- Kullanım kılavuzuna göre, lazer konfokal ve LAS AF çalışma arayüzünü açmak için doğru adımları izleyin. Gerekli lazeri farklı çekim kanallarında açın ve gücü ayarlayın. Optik yolu ve karşılık gelen dalga boyunu, Alizarin kırmızısı için 561 nm ve Calcein yeşili için 488 nm'yi ayarlayın, bunlardan herhangi biri etiketleme kokteyline göre EdU sinyali için kullanılır.
- Şeffaf numuneleri, şeffaf numuneleri şeffaf bir sıvıya daldırmak için kalın numuneleri, gömme kutularını veya su geçirmez yapıştırıcı gibi kendi kendine yapılan yerleştirme cihazlarını taşıyabilen içbükey cam Petri kabına yerleştirin.
- Numuneyi hızlı bir şekilde bulmak için düşük güçlü bir objektif lensi seçin. Hızlı tarama fonksiyonu ile tüm kalvarial dokuya genel bir bakış yapın ve görüntüleme için ilgi alanını bulun.
- Çıkış gücünü ayarlayın, tarama modunu seçin ve önce çekim katsayılarını ayarlayın (çözünürlük, tarama hızı, yakınlaştırma faktörü, görüntü kalitesi, ortalama arka plan gürültüsü vb.).
NOT: Genel olarak, Akıllı Kazanç 500 ila 800 arasında değişir (hem sinyal hem de gürültü değişimi); Akıllı Ofset, görüntü kalitesini sağlarken (arka plan gürültüsünü azaltmak için) mümkün olduğunca 0'a yakındır. PMT kazancı 800'den yüksek olduğunda veya HyD kazancı %100'den büyük olduğunda ve parlaklık hala yetersiz olduğunda, lazer yoğunluğu uygun şekilde artırılabilir, ancak prensip olarak ne kadar düşükse o kadar iyidir. - Şeffaf organizasyonun en sığ tarafından delinen eksenel mesafe Z aralığını ve Z adımını ayarlayın; yani, en derin ve en sığ tarafları ayarlayın.
NOT: Her lens için sınıflandırmayı ve çalışma mesafesini onaylayın. Z aralığını dikkatlice ayarlayın ve çalışma mesafesini seçilen lensin sınırını aşacak şekilde çalıştırmayın. İnce düzenleme gerektiğinde "z-Galvo" seçilebilir. - Çekim parametrelerini tekrar ayarlayın ve çekime başlayın. Tamamlandıktan sonra, görüntüleri çok işlevli modül aracılığıyla birleştirin ve işleyin. Son olarak, cihazı belirtilen sırayla saklayın ve kapatın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol kullanılarak sagital sütür genişletme için bir fare modeli oluşturulmuştur (Şekil 1-2). Sütür genişletme sonrası kemik modelleme değişikliklerinin 3 boyutlu görüntülenmesi için, genişletmeyi takiben tüm kalvarial kemiklere PEGASOS doku temizleme yöntemi uygulandı. Perfüzyon sonrası kalvarial kemikler ayrıldı (Şekil 3A) ve uygun PEGASOS işlemine devam edildi (Tablo 1 ve Tablo 2). Dikkat çekici bir şekilde, kalvarial kemikler, dekalsifikasyon yapılıp yapılmadığına bakılmaksızın, tam PEGASOS işleminden sonra neredeyse şeffaf hale geldi (Şekil 3B, C).
Genişleme sonrası değişiklikleri hızlı bir şekilde görselleştirmek için, toplanan ve sabitlenen numunelerde μCT kullanıldı. Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında (Şekil 4A), 1 gün boyunca kuvvet uygulandıktan sonra kraniyal sütür kademeli ve önemli ölçüde genişledi (Şekil 4B). Beşinci günde, kemik kenarında kabarık kemikli çıkıntılar ortaya çıktı (Şekil 4C).
Ekspansiyon sonrası tüm sütürdeki mineralizasyon yan yana gelme hızının üç boyutlu görüntülenmesi için, kalsifiye edilmemiş kalvarial kemiklerde bile etkin PEGASOS tekniği ile birlikte ikili etiketleme yöntemi kullanılmıştır (Şekil 5). Fizyolojik koşullar altında, öncesi-sonrası etiketleme sinyalleri arasında küçük değişiklikler vardı (Şekil 5A), kuvvet yüklemesi osteogenezi önemli ölçüde aktive etti. Tek bir kalsiyum sarı-yeşil işaretleyici ile etiketlenmiş yeni mineralize kemiğin zikzak deseni, 7 gün boyunca genişledikten sonra genişledi (Şekil 5B, C). Yüksek çözünürlüklü üç boyutlu görüntülemede, marjinal kemiklerin patern değişiklikleri, sütür genişlemesinden sonra kemiğin yeniden şekillenme sürecini gösterdi ve yeni oluşan kemiğin derecesi sütürlerin iki tarafında değişti (Şekil 5C).
Ayrıca, sütür genişlemesi üzerine hücrelerin proliferasyon hızını görselleştirmek için, bir kalsifikasyon işlemi ile PEGASOS doku temizleme yöntemi kullanılarak tam montajlı EdU dahil edilmeye çalışıldı. Başarılı bir şekilde, etiketleme temizlenmiş dokularda verimli ve iyi korunmuştur. Kontrol grubunda, birkaç EdU + hücresi sütürler boyunca yaygın olarak dağılmıştır (Şekil 6A), bu fizyolojik kemik yeniden şekillenmesi için önemli olabilir ve muhtemelen 2 boyutlu kesitte gözden kaçabilir. 1 gün genişledikten sonra, çoğalan hücreler sütürlerin ortasında ve kenarlarında zirve yaptı (Şekil 6B). Sütür genişledikçe, çoğalan hücrelerin sayısı zamanla azaldı ve 7. güne ulaştı (Şekil 6C). Vurgulanan hücreler, kemik iliğindeki küçük yuvarlak hücrelerdi, bu da EdU + sütür hücrelerinden farklı olan kan hücrelerini gösteriyordu (Şekil 6C).
Resim 1: Ameliyat için hayati malzemeler hazırlandı. Tutma tutucular paslanmaz çelik telden yapılmıştır. Çapları 2 mm idi ve iki tarafta 1 mm kuyruklar ayrılmıştı (A). 0,2 mm tel çapında, 1,5 mm dış çaplı, 1 mm aralıklı baskı yayı uygulanmıştır (B). Çekme kuvveti bir dinamometre (C,D) ile tespit edildi. Bu deneyde her 1 mm'lik yay sıkıştırması yaklaşık 30 g (E) itme kuvveti elde etti. Kağıt parçaları, bariyer (F) olarak kullanılmak üzere 2 mm çapında uçurtma şeklinde kesildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Sütür genişletici fare modeli için cerrahi süreç. Kalvarial flebi çevirdikten sonra, tutma tutucuların açığa çıkacağı konumda asitle aşındırma (A) ve yapıştırma (B) yapıldı. Kafa derisi flebi (C) sıfırlandıktan sonra, tutucular işaretli pozisyonda (D) açığa çıkarıldı. Kalvarial sütüre genleşme kuvveti uygulamak için iki tutucu arasına bir yay yerleştirildi ve tutucuların sıkıca bağlandığı onaylandıktan sonra yayın her iki ucuna bariyer (E,F) olarak iki kağıt parçası sabitlendi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Dekalsifikasyonlu veya dekalsifikasyonsuz iki kalvarial kemik için PEGASOS doku temizleme işlemi uygulandı. Perfüzyondan sonra kalvarial kemikler ayrıldı, bazı kan lekeli ve yumuşak dokular bağlandı (A). Dekalsifikasyon süreci (B) veya dekalsifikasyon olmayan (C) kalvarial kemikler, tüm PEGASOS sürecinden sonra neredeyse tamamen şeffaftı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Kalvarial sütürler gerilme kuvveti uygulandıktan sonra kademeli olarak genişledi. Kuvvet yüklemesi yapılmadan (A) ve 1 gün ve 5 gün boyunca kuvvet yüklemesi sonrası (B,C) sagital sütürün μBT görüntüleri. Ölçek çubuğu: 100 μm. Exp = genişleme. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: 3 boyutlu görüntülerde sütür genişletme sonrası aktive olan osteogenez. (A-C) PEGASOS yöntemi ile temizlenen çift etiketli sagital sütürlerin üç boyutlu görüntülenmesi. Alizarin kırmızısı ve Calcein yeşili, aynı zaman noktalarında (A) mekanik yükleme yapılmayan kontrol grubuyla karşılaştırıldığında, sırasıyla 7 gün (B, C) genişletildikten sonra genişlemeden önce ve ötenaziden önce gece boyunca intraperitoneal olarak enjekte edildi. Tüm sütür görüntülerini verimli bir şekilde elde etmek için 5x lens kullanıldı (A,B) ve (B)'deki kutu görüntüsü 10x lens ile (C, C', C'') büyütüldü. A,B: 100 μm, C: 150 μm cinsinden ölçek çubuğu. Exp = genişleme. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Sütür hücreleri, 3 boyutlu görüntülerde çekme kuvveti yüklemesi üzerine yüksek oranda çoğaldı. PEGASOS doku temizleme yöntemi ile kombine edilen tam montajlı infüzyon testleri, 1 gün ve 7 gün (B,C) boyunca sessizlik (A) veya kuvvet yüklemesinden sonra tüm sütürdeki çoğalan hücreleri görüntüledi. 10x lens ile görüntülenmiştir. Kısa çizgiler sagital sütürler için iki kenarı çizer. Ölçek çubuğu: 100 μm. Exp = genişleme. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Süreç | Çözümleri | Zaman ve Sıcaklık |
| 1. İntraperitoneal enjeksiyon | 1 mg/10 g EdU | Farelere ötenazi yapmadan 2 saat önce |
| 2. Perfüzyon | % 0.02 Heparin ve 0.05 mol / L EDTA | / |
| 3. Fiksasyon | %4 PFA | O/N, 4 °C |
| 4. Dekalsifikasyon | %10 EDTA | 2 gün, 37 °C |
| 5. Renk giderme | %25 Dörtlü | 1 gün, 37 °C |
| 6. EdU boyama | Etiketleme kokteyli | 1 gün, RT |
| 7. Yağ Alma | % 30 tert-Bütanol | 2 saat, 37 °C |
| % 50 tert-Bütanol | 2 saat, 37 °C | |
| % 70 tert-Bütanol | 2 saat, 37 °C | |
| 8. Dehidrasyon | TB-PEG çözümü | 3 saat*2, 37 °C |
| 9. Takas | BB-PEG çözümü | 2 saat, 37 °C |
Tablo 1: EdU boyama ile kalvarial kemikler için PEGASOS doku temizleme prosedürü.
| Süreç | Çözümleri | Zaman ve Sıcaklık |
| 1. İntraperitoneal enjeksiyon | 20 mg / kg Alizarin kırmızısı | Genişlemeden önceki gece |
| 2. İntraperitoneal enjeksiyon | 5 mg/kg Calcein | Toplamadan önce bir gecede |
| 3. Perfüzyon | % 0.02 Heparin ve 0.05 mol / L EDTA | / |
| 4. Fiksasyon | %4 PFA | O/N, 4 °C |
| 5. Renk giderme | %25 Dörtlü | 1 gün, 37 °C |
Tablo 2: Calcein yeşili ve Alizarin kırmızısı ile mineralize kemiklerin çift etiketlendiği kalvarial kemikler için PEGASOS doku temizleme prosedürü.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bir ay süren yeniden modelleme döngüsü10 boyunca her hafta meydana gelen düzenli morfolojik değişiklikleri gözlemlemek için standart bir sütür genişletme faresi modeli uyguladık. Bu model, kalvarial sütürleri genişleterek kalvarial kemik yeniden şekillenmesi ve rejenerasyonunu araştırmak ve ayrıca çeşitli sütür hücrelerini in vivo incelemek için kullanışlıdır. Bu tür araştırmaların sonuçlarını tam olarak sunmak için, boyanmış dokuların üç boyutlu görselleştirilmesine ihtiyaç vardır. Bu nedenle, sert dokuyu temizlemedeki etkinliğiile bilinen PEGASOS teknolojisi 19,20, genişleme işlemi sırasında genişlemiş mineralizasyon oranlarını ve çoğalan hücreleri ortaya çıkarmak için ikili etiketleme ve EdU boyama ile birleştirildi.
Sütür genişletme ameliyatı ile ilgili olarak, en önemli adımlardan biri tutma halkasının bağlanmasıdır. Kemik yüzeyi ile sağlam bir bağ sağlamak için, tutucu halkanın altındaki asitle aşındırma ve yapıştırma işlemini standartlaştırdık. Tutucu halkadaki küçük halkalar kemik yüzeyine dik olmalı ve kafa derisindeki küçük deliklere karşılık gelmelidir. Kafa derisi dikildikten sonra, kuvvet uygulayan yay ve kılavuz telin takılması sırasında tutma halkasının çökmesini önlemek için küçük halkalar doğal ve dengeli bir durumda küçük deliklerden cilt yüzeyine maruz bırakılmalıdır, bu da ameliyatın başarısız olmasına neden olabilir. Ek olarak, uygun bir kuvvet uygulayan yay seçmek, tutma halkasının düşmesini önlerken ve amaçlanan kuvvet uygulamasına ulaşırken yayın takılmasını kolaylaştırdığı için başarılı bir ameliyat için hayati önem taşır.
Önceki modellerle karşılaştırıldığında, bu model çeşitli avantajlar sunar. İlk olarak, hücre aktivasyon modunu koruyarak parietal kemikte dairesel kemik defektlerinin oluşumunu önler. Ayrıca, yay sökülerek kuvvet herhangi bir zamanda kaldırılabilir, bu da onu gerilme gerdirmeden sonra bir tekrarlama modeli oluşturmak için uygun hale getirir. Yayın sökülmesinin rahatlığı, deney hayvanlarına minimum ikincil hasar sağlar. Ayrıca, çekme geriliminin mekanik büyüklüğü, yay kuvveti değiştirilerek kolayca ayarlanabilir. Daha da önemlisi, bu model kraniyal sütür etrafındaki doğal fizyolojik ortamı korur ve böylece deneysel sonuçların doğruluğunu sağlar.
Ancak, bu genişleme modelinde bazı sınırlamalar vardır. İlk olarak, kuvvet aşırıysa tutma halkasının düşme riski vardır. Acemiler, bu riski azaltmak için yay kurulumunda ön alıştırmalar yapmalıdır. İkincisi, kafa derisini açarken ve kafatasını açığa çıkarırken enfeksiyon riski vardır, bu nedenle alet dezenfeksiyonu esastır ve ameliyat süresinin kısaltılması iyileşme için faydalıdır. Aşırı anestezi de farelerin ölümüne yol açabilir.
Pasif PEGASOS yöntemi ile ilgili olarak, tek tek doku ve organların yanı sıra genç farelerin tüm baş ve vücudunda şeffaflık elde etmek için geçerlidir. Tüm kalvarial kemikler için etkili olsa da, daha büyük numuneler için, özellikle tüm kemik dokuları veya eklemli toplu uzun kemik dokuları için daha uzun bir işlem süresi gerekir. Boyama işlemine müdahale ettiği için çift etiketleme protokolü kullanılırken doku dekalsifikasyonunun yapılmaması gerektiğine dikkat etmek önemlidir. PEGASOS doku temizleme yöntemi aynı zamanda esnektir ve EdU dahil etme veya kalsiyum çift etiketleme ile sınırlı olmayan çeşitli etiketleme yöntemleriyle kombinasyona izin verir, aynı zamanda transgenik fare modellerinde endojen floresan veya tam montajlı boya veya antikor boyama ile tümü iyi korunmuş floresan içerir.
Stabil etkileri ve yüksek tekrarlanabilirliği ile bu sütür genişletme modeli, farklı yaşlardaki transgenik farelerin çeşitli suşları için uygundur. Çekme geriliminin büyüklüğünü ve geri çekme kuvvetini herhangi bir zamanda ayarlama yeteneği, stres stimülasyonundan sonra nüks hakkında uygun araştırma yapılmasını sağlar. Mineralize kemiklerin çift etiketleme yöntemini PEGASOS doku temizleme tekniği ile birleştirerek, kemiğin yeniden şekillenmesi sırasında kraniyal sütür kök hücrelerinin üç boyutlu uzay-zamansal dağılımını gözlemleyebiliyoruz ve bu da SUSC'ler ile mekanik stres arasındaki ilişkinin yanı sıra spesifik mekanizmalarının daha fazla araştırılmasını sağlıyor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Şanghay Jiaotong Üniversitesi Tıp Fakültesi, Kulak Enstitüsü'nün laboratuvar platformu ve yardımı için teşekkür ederiz. Bu çalışma Şanghay Pujiang Programı (22PJ1409200) tarafından desteklenmiştir; Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No.11932012); Şanghay Dokuzuncu Halk Hastanesi Doktora Sonrası Bilimsel Araştırma Vakfı, Şanghay Jiao Tong Üniversitesi Tıp Fakültesi; Şanghay Jiao Tong Üniversitesi Tıp Fakültesi'ne (JYZZ154) bağlı Dokuzuncu Halk Hastanesi'nin temel araştırma programı finansmanı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37% Acid etching | Xihubiom | E10-02/1807011 | |
| Alizarin red | Sigma-Aldrich | A3882 | |
| AUSTRALIAN WIRE | A.J.WILCOCK | 0.014'' | |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | B6630 | |
| Calcein green | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Copper(II) sulfate, anhydrous | Sangon Biotech | A603008 | |
| Dynamometer | Sanliang | SF-10N | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| EdU | Invitrogen | E104152 | |
| Laser Confocal Microscope | Leica | SP8 | |
| PBS | Sangon Biotech | E607008 | |
| PEG-MMA 500 | Sigma-Aldrich | 447943 | |
| PFA | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| pH Meters | Mettler Toledo | S220 | |
| Quadrol | Sigma-Aldrich | 122262 | |
| Sodium Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| Sodium bicarbonate | Sangon Biotech | A500873 | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A610476 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Spring | TAOBAO | 0.2*1.5*1*7 | |
| Sulfo-Cyanine3 azide | Lumiprobe | A1330 | |
| tert-Butanol | Sigma-Aldrich | 360538 | Protect from light. Do not freeze. |
| Transbond MIP Moisture Insensitive Primer |
3M Unitek | 712-025 | |
| Transbond XT Light Cure Adhesive Paste |
3M Unitek | 712-035 | |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | V900257 | |
| Tris-buffered saline | Sangon Biotech | A500027 |
References
- Opperman, L. A. Cranial sutures as intramembranous bone growth sites. Developmental Dynamics. 219 (4), 472-485 (2000).
- Thenier-Villa, J. L., Sanromán-Álvarez, P., Miranda-Lloret, P., Plaza Ramírez, M. E. Incomplete reossification after craniosynostosis surgery-incidence and analysis of risk factors: a clinical-radiological assessment study. Journal Of Neurosurgery-pediatrics. 22 (2), 120-127 (2018).
- Markiewicz, M. R., Recker, M. J., Reynolds, R. M. Management of sagittal and lambdoid craniosynostosis: open cranial vault expansion and remodeling. Oral And Maxillofacial Surgery Clinics Of North America. 34 (3), 395-419 (2022).
- Mao, J. J., Wang, X., Kopher, R. A. Biomechanics of craniofacial sutures: orthopedic implications. Angle Orthodontist. 73 (2), 128-135 (2003).
- Shayani, A., Sandoval Vidal, P., Garay Carrasco, I., Merino Gerlach, M. Midpalatal suture maturation method for the assessment of maturation before maxillary expansion: a systematic review. Diagnostics (Basel). 12 (11), 2774 (2022).
- Suzuki, H., et al. Miniscrew-assisted rapid palatal expander (MARPE): the quest for pure orthopedic movement. Dental Press Journal Of Orthodontics. 21 (4), 17-23 (2016).
- Yu, M., et al. Cranial suture regeneration mitigates skull and neurocognitive defects in craniosynostosis. Cell. 184 (1), 243-256 (2021).
- Roth, D. M., Souter, K., Graf, D. Craniofacial sutures: Signaling centres integrating mechanosensation, cell signaling, and cell differentiation. European Journal of Cell Biology. 101 (3), 151258 (2022).
- Zhao, H., et al. The suture provides a niche for mesenchymal stem cells of craniofacial bones. Nature Cell Biology. 17 (4), 386-396 (2015).
- Jing, D., et al. Response of Gli1(+) suture stem cells to mechanical force upon suture expansion. Journal of Bone And Mineral Research. 37 (7), 1307-1320 (2022).
- Xu, Y., Malladi, P., Chiou, M., Longaker, M. T. Isolation and characterization of posterofrontal/sagittal suture mesenchymal cells in vitro. Plastic and Reconstructive Surgery. 119 (3), 819-829 (2007).
- Kong, L., et al. Isolation and characterization of human suture mesenchymal stem cells in vitro. International Journal of Stem Cells. 13 (3), 377-385 (2020).
- Ikegame, M., et al. Tensile stress induces bone morphogenetic protein 4 in preosteoblastic and fibroblastic cells, which later differentiate into osteoblasts leading to osteogenesis in the mouse calvariae in organ culture. Journal of Bone And Mineral Research. 16 (1), 24-32 (2001).
- Liu, S. S., Opperman, L. A., Buschang, P. H. Effects of recombinant human bone morphogenetic protein-2 on midsagittal sutural bone formation during expansion. American Journal of Orthodontics And Dentofacialorthopedics. 136 (6), 768-769 (2009).
- Liang, W., Ding, P., Li, G., Lu, E., Zhao, Z. Hydroxyapatite nanoparticles facilitate osteoblast differentiation and bone formation within sagittal suture during expansion in rats. Drug Design Development and Therapy. 15, 905-917 (2021).
- Morinobu, M., et al. Osteopontin expression in osteoblasts and osteocytes during bone formation under mechanical stress in the calvarial suture in vivo. Journal of Bone And Mineral Research. 18 (9), 1706-1715 (2003).
- Hwang, S., Chung, C. J., Choi, Y. J., Kim, T., Kim, K. H. The effect of cetirizine, a histamine 1 receptor antagonist, on bone remodeling after calvarial suture expansion. Korean Journal of Orthodontics. 50 (1), 42-51 (2020).
- Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).
- Jing, D., et al. Tissue clearing and its application to bone and dental tissues. Journal of Dental Research. 98 (6), 621-631 (2019).
- Luo, W., et al. Investigation of postnatal craniofacial bone development with tissue clearing-based three-dimensional imaging. Stem Cells Development. 28 (19), 1310-1321 (2019).
