Summary
Ce protocole présente un modèle murin standardisé d’expansion de suture et une méthode de visualisation 3D pour étudier les changements mécanobiologiques de la suture et le remodelage osseux sous charge de force de traction.
Abstract
Les sutures craniofaciales jouent un rôle crucial au-delà d’être des articulations fibreuses reliant les os craniofaciaux ; Ils servent également de niche principale pour la croissance des os calvaires et faciaux, abritant des cellules souches mésenchymateuses et des ostéoprogéniteurs. Comme la plupart des os cranio-faciaux se développent par ossification intramembraneuse, les régions marginales des sutures agissent comme des points d’initiation. En raison de cette importance, ces sutures sont devenues des cibles intrigantes dans les thérapies orthopédiques telles que l’expansion de la voûte crânienne assistée par ressort, l’expansion maxillaire rapide et la traction maxillaire. Sous l’effet de la force de traçage orthopédique, les cellules souches de suture sont rapidement activées, devenant une source dynamique de remodelage osseux pendant l’expansion. Malgré leur importance, les changements physiologiques au cours des périodes de remodelage osseux restent mal compris. Les méthodes de coupe traditionnelles, principalement dans le sens sagittal, ne capturent pas les changements globaux qui se produisent dans l’ensemble de la suture. Cette étude a permis d’établir un modèle murin standard pour l’expansion de la suture sagittale. Pour visualiser pleinement les changements de remodelage osseux après l’expansion de la suture, la méthode d’élimination des tissus PEGASOS a été combinée avec une coloration EdU à montage complet et un double marquage chélateur du calcium. Cela a permis de visualiser des cellules hautement proliférantes et la formation de nouveaux os sur l’ensemble des os calvaires après l’expansion. Ce protocole offre un modèle murin standardisé d’expansion de suture et une méthode de visualisation 3D, mettant en lumière les changements mécanobiologiques dans les sutures et le remodelage osseux sous charge de force de traction.
Introduction
Les sutures craniofaciales sont des tissus fibreux qui relient les os craniofaciaux et jouent un rôle essentiel dans la croissance et le remodelage des os craniofaciaux. La structure de la suture ressemble à une rivière, fournissant un flux de ressources cellulaires pour nourrir et construire la « berge de la rivière », connue sous le nom de fronts ostéogéniques, qui contribuent à la formation des os craniofaciaux via l’ostéogenèse intramembraneuse1.
L’intérêt pour les sutures craniofaciales a été motivé par les besoins cliniques de comprendre la fermeture prématurée des sutures crâniennes et le dysfonctionnement des sutures faciales, qui peuvent entraîner des déformations craniofaciales et même des conditions potentiellement mortelles chez les enfants. La suturectomie ouverte est couramment utilisée dans le traitement clinique, mais un suivi à long terme a montré une récidive de réossification incomplète chez certains patients2. La craniotomie mini-invasive assistée par ressorts d’expansion ou la craniectomie endoscopique peut constituer une approche plus sûre pour préserver la suture potentielle plutôt que de jeter les tissus3. De même, les thérapies orthopédiques telles que les masques faciaux et les appareils d’expansion ont été largement utilisées pour traiter l’hypoplasie sagittale ou maxillaire horizontale, certaines études étendant la limite d’âge pour traiter les patients adultes via des expanseurs palatins assistés par minivis 4,5,6. De plus, la régénération des sutures crâniennes avec des cellules souches mésenchymateuses (CSM) combinées à des matériaux biodégradables est une thérapie potentielle à l’avenir, offrant une nouvelle direction pour le traitement des maladies connexes7. Cependant, le processus de fonction ou le mécanisme de régulation des sutures reste insaisissable.
Le remodelage osseux consiste principalement en un équilibre entre la formation osseuse menée par les ostéoblastes et la résorption osseuse effectuée par les ostéoclastes, où la différenciation ostéogénique des cellules souches stimulée par des signaux mécaniques joue un rôle important. Après des décennies de recherche, il a été constaté que les sutures craniofaciales sont des niches de cellules souches mésenchymateuses hautement plastiques8. Les cellules souches de suture (SuSC) sont un groupe hétérogène de cellules souches, appartenant aux cellules souches mésenchymateuses (CSM) ou aux cellules souches osseuses (CSS). Les SuSCs sont marqués in vivo par quatre marqueurs, dont Gli1, Axin2, Prrx1 et Ctsk. Les SuSCs Gli1+ , en particulier, ont strictement vérifié les caractéristiques biologiques des cellules souches, non seulement en présentant une forte expression des marqueurs MSC typiques, mais aussi en démontrant un excellent potentiel ostéogénique et chondrogénique9. Des recherches antérieures ont montré que les SuSC Gli1+ contribuent activement à la formation de nouveaux os sous l’effet de la force de traction, les identifiant comme la source de cellules souches de suture soutenant l’ostéogenèse de distraction10.
Dans le passé, les caractéristiques mécaniques étendues des cellules souches ont été étudiées in vitro via Flexcell, la courbure en quatre points, le système de chargement par micro-aimant, etc. Bien que des cellules mésenchymateuses dérivées de sutures crâniennes de souris aient été identifiées in vitro11 et que des cellules souches mésenchymateuses de suture humaine aient également été isolées récemment12, la réponse biomécanique des cellules de suture reste incertaine dans le système in vitro. Pour étudier plus en détail le processus de remodelage osseux, un modèle d’expansion de suture basé sur la culture d’organes de calvaria isolés a été établi, ouvrant la voie à l’établissement d’un modèle d’expansion de suture in vivo utile 1,13. Les lapins14 et les rats15 ont été les animaux les plus utilisés dans la recherche fondamentale pour l’expansion des sutures. Cependant, les souris sont des modèles animaux préférés pour explorer les maladies humaines en raison de leur génome hautement homologue avec celui des humains, de leurs nombreuses lignées de modification génétique et de leur forte capacité d’hybridation reproductive. Les modèles murins existants d’expansion de la suture crânienne reposent généralement sur des fils à ressort orthodontiques en acier inoxydable pour appliquer une force de traction à la suture sagittale16,17. Dans ces modèles, deux trous sont percés de chaque côté des os pariétaux pour fixer le dispositif d’expansion, et les fils sont intégrés sous la peau, ce qui peut affecter le mode d’activation cellulaire.
En ce qui concerne la méthode de visualisation, l’observation bidimensionnelle des tranches dans la direction sagittale est généralement adoptée depuis des décennies. Cependant, étant donné que le remodelage osseux est un processus dynamique tridimensionnel complexe, l’obtention d’informations tridimensionnelles complètes est devenue un besoin urgent. C’est pour répondre à cette exigence que la technique de transparence tissulaire PEGASOS a vu le jour18,19. Il offre des avantages uniques pour la transparence des tissus durs et mous, permettant de reproduire l’ensemble du processus de remodelage osseux dans un espace tridimensionnel.
Pour acquérir une compréhension plus profonde et plus complète des changements physiologiques dans les périodes de remodelage osseux, un modèle de souris standard d’expansion de suture sagittale avec un réglage à ressort entre les supports faits à la main a été établi10. Grâce à une procédure normalisée de gravure et de collage à l’acide, le dispositif d’expansion pourrait être fermement lié à l’os crânien, générant une force de traction perpendiculaire à la suture sagittale. De plus, la méthode d’élimination des tissus PEGASOS a été appliquée après le double marquage de l’os minéralisé après l’expansion afin de visualiser pleinement les changements de modélisation osseuse après l’expansion de la suture.
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Protocol
Toutes les procédures expérimentales décrites ici ont été approuvées par le Comité de protection des animaux du Neuvième Hôpital populaire de Shanghai, École de médecine de l’Université Jiao Tong de Shanghai (SH9H-2023-A616-SB). Des souris mâles C57BL/6 âgées de 4 semaines ont été utilisées dans cette étude. Tous les instruments utilisés ont été stérilisés avant l’intervention.
1. Préparation du modèle d’expansion de suture
- Préparation de deux supports de rétention.
- Utilisez du fil australien de 0,014'' ou du fil d’acier inoxydable (voir le tableau des matériaux) pour faire une boucle hélicoïdale avec une pince à fil léger. Le diamètre de la boucle est de 2 mm, et la queue de 1 mm est réservée sur les deux côtés (Figure 1A).
- Stérilisez les fils et les supports pour la chirurgie dans un autoclave, un stérilisateur à plasma ou un stérilisateur à froid approprié (par exemple, le glutaraldéhyde).
- Préparation des ressorts.
- Préparez des ressorts en acier inoxydable personnalisés.
REMARQUE : Le ressort de pression avec un diamètre de fil de 0,2 mm, un diamètre extérieur de 1,5 mm, un intervalle de 1 mm et une longueur de 7 mm est utilisé dans cette étude (Figure 1B). Chaque compression par ressort de 1 mm permet d’obtenir une poussée d’environ 30 g. - Coupez le ressort à une longueur disponible avant de le régler. Confirmez la force du ressort spécialisé avant l’expérience.
REMARQUE : Les tailles des ressorts varient tant que l’amplitude de la force est la même dans les expériences parallèles. La force est mesurée à l’aide d’un instrument d’essai uniaxial de table ou d’un petit banc d’essai électronique (voir le tableau des matériaux) si les conditions sont limitées. Le changement de longueur est évalué à l’amplitude de la force (Figure 1C-E). Notamment, il est nécessaire de modifier la valeur de charge de la force du ressort en fonction de l’âge, de l’état osseux de la souris et des objets de recherche. - Préparez un fil australien droit ou un fil d’acier droit de 7 mm de longueur et fabriquez deux feuilles de papier de 2 mm de diamètre qui serviront de barrières (figure 1F).
- Préparez des ressorts en acier inoxydable personnalisés.
2. Chirurgie d’expansion de la suture sagittale
- Anesthésie : Anesthésier les souris avec de la tilétamine (25 mg/kg), du zolazépam (25 mg/kg) et de la xylazine (10 mg/kg). Dans le même temps, appliquez une pommade ophtalmique stérile sur les yeux pour éviter le dessèchement des cornées. Jugez de la profondeur de l’anesthésie des souris via un pincement des orteils.
REMARQUE : Les caractéristiques suivantes indiquent que la souris est anesthésiée correctement : respiration lente et régulière, faiblesse des membres, relaxation musculaire, disparition du réflexe d’acupuncture cutané et du réflexe des paupières, ainsi qu’un réflexe cornéen plus faible. - Enlèvement et désinfection de la fourrure : Enlevez soigneusement la fourrure sur le dessus de la tête avec une crème dépilatoire ; Évitez de vous toucher les yeux. Peu de temps après, utilisez une alternance de doses d’iodophor et d’alcool à 75 % pour désinfecter le site chirurgical. Administrer du méloxicam (1 mg/kg) comme analgésie aux souris par injection sous-cutanée.
- Fixation de la position du corps : Placez la souris allongée sur le devant et utilisez des rubans chirurgicaux pour fixer les membres sur la table d’opération.
- Lambeau de cuir chevelu ouvert : Utilisez des ciseaux chirurgicaux pour effectuer un lambeau arqué le long du cuir chevelu près du cou de la souris, exposant complètement la suture sagittale et le crâne environnant. Après cela, fixez le lambeau du cuir chevelu avec une suture 6-0 sur la table d’opération.
- Collez les supports de rétention après la gravure à l’acide.
- Séchez le crâne et gravez-le avec de l’acide phosphorique à 37 % pendant 20 s, puis utilisez une solution saline normale pour nettoyer la gravure à l’acide (figure 2A). Un résidu crayeux sera évident après avoir séché le crâne avec l’ampoule de pipette en caoutchouc.
- Cimentez les deux supports (préparés à l’étape 1.1) de part et d’autre des os pariétaux à 3 mm des sutures sagittales avec un adhésif photopolymérisable (Figure 2B).
- Réinitialisez le lambeau du cuir chevelu.
- Remettez manuellement le lambeau du cuir chevelu en place (Figure 2C). Étiquetez la position des supports, découpez deux petits trous dans le cuir chevelu à la position correspondante des supports de rétention bilatéraux, puis réinitialisez le cuir chevelu lambeau.
- En même temps, passez les petites boucles dans les trous pour exposer la surface de la peau. Suturez l’incision incurvée avec une suture 6-0 (Figure 2D). Un à trois jours sont alloués pour la récupération de la peau. Administrer du méloxicam (1 mg/kg) aux souris par injection sous-cutanée toutes les 24 h pendant 1 à 3 jours.
REMARQUE : Après la chirurgie, vérifiez quotidiennement l’activité du cuir chevelu de la souris et si les supports tombent. Il existe différents types de peau en matière de couleur et d’épaisseur ; Le cuir chevelu sain conservera la couleur d’origine et les bords de la peau fusionneront progressivement après la suture. Si une infection du cuir chevelu est détectée ou si le dispositif chirurgical est tombé, retirez la souris de l’étude et euthanasiez-la.
- Installez le ressort et le fil guide.
- Coupez le ressort 1 mm plus long que la distance entre les deux supports.
- Comprimez le ressort de pression sélectionné et placez-le entre les petites bobines des deux côtés.
- Passez le fil d’acier inoxydable à travers les petites bobines et le ressort, et relâchez le ressort pour obtenir une poussée de départ d’environ 30 g.
- Vérifiez que le cuir chevelu sous la zone à ressort de la souris n’est pas compressé.
- Après avoir vérifié que le collage est ferme sans aucun desserrement, collez deux bouts de papier entre le ressort et les supports avec un adhésif photopolymérisable afin de mettre en place des barrières aux deux extrémités du ressort (Figure 2E,F).
3. Double marquage des os minéralisés
- Préparation de la solution mère.
- Préparez une solution de dilution avec de l’eau distillée contenant 0,9 % de NaCl et 2 % de NaHCO3.
- Utiliser la solution diluante pour préparer 20 mg/mL de complexe d’alizarine dihydraté et 10 mg/mL de calcéine (voir le tableau des matériaux).
- Ajustez le pH à 7,4 à l’aide d’un appareil de mesure du pH. Rincez la sonde de pH entre les mesures pour garantir des lectures précises.
- Mettez le colorant dans un récipient stérile et conservez-le au réfrigérateur à 4 °C ; Le papier d’aluminium est utilisé pour empêcher la lumière d’entrer.
- Préparez la solution de travail. Avant l’injection, diluer la solution mère à 1 mg/mL pour le calcium et à 2 mg/mL pour le complexe d’alizarine dihydraté à l’aide d’une solution de dissolution.
- Injecter par voie intrapéritonéale 5 mg/kg de vert de calcéine et 20 mg/kg de rouge d’alizarine à deux moments pour marquer les os minéralisés et analyser les changements entre deux temps. En règle générale, prélever les échantillons 12 à 14 h après l’injection.
REMARQUE : Réchauffez les colorants avant l’injection et assurez-vous que le temps d’injection n’est pas inférieur à 3 minutes. L’intervalle d’injection dépend du temps d’expansion. Dans cette étude, le rouge d’alizarine et le vert de calcéine ont été injectés pendant la nuit (O/N) avant l’expansion et O/N avant le prélèvement, respectivement. - Prélever des os calvaires entiers préparés pour la procédure de nettoyage des tissus un jour après la deuxième injection.
4. Coloration EdU
- Injection intrapéritonéale : Injection intrapéritonéale d’EdU 2 h avant d’euthanasier les souris (selon les protocoles approuvés par l’établissement). La dose est de 1 mg/10 g de poids corporel.
- Préparation du cocktail d’étiquetage : Mélanger une solution saline tamponnée Tris (100 mmol/L final, pH 7,6), CuSO4 (4 mmol/L final), de l’azoture de sulfocyanine 3 (2 à 5 μmol/L final) et de l’ascorbate de sodium (100 mmol/L final, frais à chaque utilisation) (voir le tableau des matériaux).
- Coloration EdU à montage complet : Après l’étape de décoloration des tissus dans la méthode d’élimination des tissus PEGASOS (étape 7), mettez les échantillons dans le cocktail d’étiquetage pendant 1 jour à température ambiante (RT).
5. Imagerie par micro-tomodensitométrie
- Fixation et stockage des tissus : Fixez les os calvaires dans du paraformaldéhyde (PFA) à 4 % à 4 °C O/N et stockez-les dans du PFA à 0,5 % avant la numérisation.
- Balayage et analyse : Scannez les échantillons à l’aide d’un système d’imagerie par microtomodensitométrie (μCT) à haute résolution et d’une taille de voxel de 7 μm.
6. Préparation de la solution de travail pour le nettoyage des tissus PEGASOS
- Polyformaldéhyde (PFA) à 4 % : Dissoudre 4 g de poudre de PFA dans 1× PBS à 100 mL.
- Solution de perfusion cardiaque : 0,02 % d’héparine, c’est-à-dire 20 mg de poudre d’héparine dissoute dans 1× PBS à 100 mL ; on peut aussi utiliser 0,05 mol/L d’EDTA, c’est-à-dire 0,05 mol d’acide éthylène-diamine tétraacétique (EDTA) (voir Tableau des matières), dissous dans une solution aqueuse déminéralisée jusqu’à un volume total de 1 L.
- Solution de décalcification : 0,5 mol/L d’EDTA, c’est-à-dire 0,5 mol d’acide éthylène diamine tétraacétique (EDTA), dissous dans une solution aqueuse déminéralisée pour un volume total de 1 L.
- Solution de décoloration : 25 % de Quadrol, soit 250 mL de Quadrol (N, N, N', N'- Tetrakis (2-Hydroxypropyl) éthylènediamine) (voir le tableau des matériaux) dissous dans de l’eau déminéralisée pour un volume total de 1 L.
REMARQUE : En raison de la viscosité du Quadrol, il peut être chauffé à 60 °C pour augmenter sa fluidité avant la configuration. - Solution dégraissante : 30 %, 50 %, 70 % tert-butanol (tB) (voir tableau des matériaux), préparée avec une fraction volumique de l’eau.
REMARQUE : Étant donné que le tB pur est cristallin à température ambiante, il doit être chauffé à 60 °C jusqu’à ce qu’il se dissolve avant de pouvoir être utilisé. Par la suite, 3 % à 5 % (v/v) de triéthanolamine (TEA) sont ajoutés pour réguler le pH de la solution >9,5. - Solution de déshydratation : solution TB-PEG, 70 % tB + 27 % de PEG-MMA + 3 % de Quadrol (v/v), dans laquelle le PEG-MMA est du méthacrylate de poly (éthylène glycol) méthyl éther d’un poids moléculaire moyen de 500 (poly (éthylène glycol) méthacrylate 500, PEG-MMA 500) (voir tableau des matériaux).
- Solution transparente : solution BB-PEG, 75 % BB + 22 % de PEG-MMA + 3 % de Quadrol (v/v), où BB est du benzoate de benzyle (BB).
7. Transparence des os calvaires avec la méthode PEGASOS
- Anesthésier la souris par injection intrapéritonéale d’anesthésiques (étape 2.1) et évaluer la profondeur d’anesthésie de la souris par la réaction de pincement pour s’assurer qu’il n’y a pas de réaction de résistance avant la perfusion cardiaque.
- Effectuer la perfusion et la fixation cardiaques.
- Tenez l’abdomen de la souris vers le haut, fixez les membres avec du ruban adhésif et coupez soigneusement le long de la circonférence du thorax pour l’exposer complètement.
- Immédiatement après avoir fait une petite incision dans l’oreillette droite avec des ciseaux ophtalmiques, insérez une aiguille de perfusion 22 G à l’apex du ventricule gauche.
REMARQUE : Seule la pointe de l’aiguille est insérée pour éviter d’endommager la valve cardiaque par une insertion excessive. Sinon, le liquide de perfusion cardiaque pénètre dans la circulation pulmonaire, affectant l’effet de perfusion de la circulation systémique. - Insérez le liquide de perfusion cardiaque de 30 à 50 ml (étape 6.2) dans la seringue. On peut voir que le foie devient progressivement pâle à partir du rouge vif.
- Une fois que le liquide d’écoulement de l’oreillette droite devient complètement clair, perfusez une solution de PFA à 4 % dans un volume égal. Le fonctionnement de la perfusion de PFA est effectué dans une hotte ventilée.
- Disséquez et séparez les tissus et les organes, et fixez-les pendant la nuit avec 4 % de PFA à 4 °C.
- Détartrage tissulaire : Pour les échantillons traités par coloration EdU, placer le tissu dur fixé dans une solution d’EDTA à 0,5 mol/L (pH 7,0) (10 mL) dans une table agitée à 37 °C pendant environ 2 jours, et changer le liquide quotidiennement.
REMARQUE : Sautez le processus de décalcification dans la méthode PEGASOS normalisée pour les os marqués par l’agent chélateur de calcium afin de préserver complètement la signalisation. La décalcification est nécessaire pour traiter les os afin de visualiser la fluorescence endogène ou les signaux immunocolorés de l’ensemble du support. - Décoloration des tissus : Placer les os calvaires fixés dans une solution de Quadrol à 25 % (20 ml) dans une table agitée à 37 °C pendant 1 jour, et changer le liquide une fois.
REMARQUE : Le temps de décoloration est lié à la teneur en hème dans le tissu. Observez la couleur du liquide de traitement, car la profondeur de la couleur représente la nécessité de poursuivre le traitement de remplacement du fluide. - Coloration EdU : Rincez les échantillons dans 1× PBS pendant 5 min (trois fois), puis plongez-les dans le cocktail d’étiquetage pendant 1 jour. Après cela, rincez les échantillons dans 1× PBS pendant 1 h (trois fois).
- Dégraissage et déshydratation des tissus
- Placez les tissus dans des solutions à 30 % tB, 50 % tB et 70 % tB dans l’ordre pour effectuer une diminution du gradient sur une table agitée à 37 °C. Placer dans chaque concentration pendant environ 2 h.
- Ensuite, déshydrater les échantillons dans une solution TB-PEG pendant 6 h sur une table vibrante à 37 °C.
REMARQUE : Le temps de traitement ci-dessus peut être augmenté ou diminué en fonction du nombre de tissus.
- Transparence des tissus : Placer le tissu complètement déshydraté dans une solution de BB-PEG sur une table agitée à 37 °C (2-4 h) jusqu’à ce qu’il soit transparent. Actuellement, les échantillons peuvent être conservés jusqu’à 1 à 2 ans.
REMARQUE : Après avoir presque complètement nettoyé, ouvrez le couvercle du tube pour exposer les échantillons et le milieu à l’air avec agitation pour améliorer encore la transparence. Cette méthode convient pour améliorer la transparence des tissus et organes individuels, ainsi que de l’ensemble de la tête et du corps des jeunes souris. Cependant, pour la transparence de l’ensemble du corps des souris adultes, les étapes ci-dessus doivent être effectuées à l’aide d’une méthode de perfusion à cycle complet.
8. Imagerie
REMARQUE : La microscopie confocale a été utilisée pour la visualisation 3D de tissus transparents dans cette étude. La microscopie à feuille de lumière est également appropriée pour ce protocole. Plusieurs systèmes d’exploitation ont déjà été vérifiés comme étant disponibles. Ici, un système d’exploitation de microscope confocal laser est pris à titre d’exemple (voir Tableau des matériaux).
- Selon le manuel d’utilisation, suivez les étapes correctes pour ouvrir l’interface de fonctionnement de la confocale laser et de l’AF LAS. Allumez le laser requis dans différents canaux de prise de vue et ajustez la puissance. Réglez le chemin optique et la longueur d’onde correspondante, 561 nm pour le rouge d’alizarine et 488 nm pour le vert calcéine, qui sont tous utilisés pour le signal EdU selon le cocktail d’étiquetage.
- Placez les échantillons transparents dans la boîte de Pétri en verre concave qui peut contenir des échantillons épais, des boîtes d’enrobage ou des dispositifs de placement fabriqués par nos soins tels que de la colle imperméable pour immerger les échantillons transparents dans un liquide transparent.
- Sélectionnez une lentille d’objectif à faible puissance pour localiser rapidement l’échantillon. Faites une vue d’ensemble de l’ensemble du tissu calvaire grâce à la fonction de balayage rapide et trouvez la zone d’intérêt pour l’imagerie.
- Réglez la puissance de sortie, sélectionnez le mode de numérisation et ajustez d’abord les coefficients de prise de vue (résolution, vitesse de numérisation, facteur de zoom, qualité d’image, bruit de fond moyen, etc.).
REMARQUE : Généralement, le gain intelligent varie de 500 à 800 (changement de signal et de bruit) ; Le décalage intelligent est aussi proche que possible de 0 tout en garantissant la qualité de l’image (pour réduire le bruit de fond). Lorsque le gain PMT est supérieur à 800 ou que le gain HyD est supérieur à 100 % et que la luminosité est encore insuffisante, l’intensité du laser peut être augmentée de manière appropriée, mais en principe, plus elle est faible, mieux c’est. - Définissez la distance axiale Z et le pas Z, qui sont explorés à partir du côté le moins profond de l’organisation transparente ; c’est-à-dire définir les côtés les plus profonds et les moins profonds.
REMARQUE : Confirmez la classification et la distance de travail pour chaque objectif. Réglez soigneusement la plage Z et n’utilisez pas la distance de travail dépassant la limite de l’objectif sélectionné. Le « z-Galvo » peut être sélectionné lorsqu’une régulation fine est nécessaire. - Réglez à nouveau les paramètres de prise de vue et commencez à prendre des photos. Une fois l’opération terminée, fusionnez et traitez les images à l’aide du module multifonctionnel. Enfin, rangez et éteignez l’instrument dans l’ordre indiqué.
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Representative Results
À l’aide de ce protocole, un modèle murin d’expansion de la suture sagittale a été établi (Figure 1-2). Pour la visualisation 3D des changements de modélisation osseuse après l’expansion de la suture, la méthode d’élimination des tissus PEGASOS a été appliquée à l’ensemble des os calvaires après l’expansion. Après la perfusion, les os calvaires ont été séparés (figure 3A) et le processus PEGASOS approprié a été poursuivi (tableau 1 et tableau 2). Fait remarquable, les os calvaires sont devenus presque transparents après le processus PEGASOS complet, indépendamment du fait que la décalcification ait été effectuée ou non (Figure 3B, C).
Pour visualiser rapidement les changements après l’expansion, le μCT a été utilisé sur les échantillons prélevés et fixés. Par rapport au groupe témoin (Figure 4A), la suture crânienne s’est progressivement et significativement élargie après avoir appliqué une force pendant 1 jour (Figure 4B). Au cinquième jour, des protubérances osseuses duveteuses sont apparues sur le bord osseux (figure 4C).
Pour la visualisation tridimensionnelle du taux de juxtaposition de la minéralisation dans l’ensemble de la suture après expansion, la méthode de double marquage a été utilisée avec la technique efficace PEGASOS, même sur des os calvaires non décalcifiés (Figure 5). Dans des conditions physiologiques, il y a eu des changements mineurs entre les signaux de marquage antérieur et post-marquage (Figure 5A), tandis que la charge de force a activé de manière significative l’ostéogenèse. Le motif en zigzag de l’os nouvellement minéralisé, marqué d’un seul marqueur jaune-vert de calcium, s’est élargi après s’être dilaté pendant 7 jours (Figure 5B,C). Dans la visualisation tridimensionnelle à haute résolution, les changements de motif des os marginaux indiquaient le processus de remodelage osseux après l’expansion de la suture, et le degré d’os nouvellement formé variait des deux côtés des sutures (Figure 5C).
De plus, pour visualiser le taux de prolifération des cellules lors de l’expansion de la suture, l’incorporation d’EdU à montage entier a été tentée en utilisant la méthode de nettoyage tissulaire PEGASOS avec un processus de calcification. Avec succès, le marquage a été efficace et bien conservé dans les tissus clairs. Dans le groupe témoin, plusieurs cellules EdU+ étaient distribuées de manière diffuse dans les sutures (Figure 6A), ce qui pourrait être important pour le remodelage osseux physiologique et peut-être négligé dans la coupe 2D. Après s’être dilatées pendant 1 jour, les cellules proliférantes ont atteint un pic au milieu et sur les bords des sutures (Figure 6B). Au fur et à mesure que la suture s’élargissait, le nombre de cellules proliférantes diminuait au fil du temps, atteignant le jour 7 (Figure 6C). Les cellules mises en évidence étaient de petites cellules rondes dans la moelle osseuse, indiquant des cellules sanguines, qui différaient des cellules de suture EdU+ (Figure 6C).
Figure 1 : Le matériel vital a été préparé pour l’opération. Les supports de rétention étaient en fil d’acier inoxydable. Leurs diamètres étaient de 2 mm, et les queues de 1 mm étaient réservées sur les deux côtés (A). Le ressort de pression avec un diamètre de fil de 0,2 mm, un diamètre extérieur de 1,5 mm, un espacement de 1 mm a été appliqué (B). La force de traction a été détectée par un dynamomètre (C,D). Chaque compression par ressort de 1 mm a permis d’obtenir une poussée d’environ 30 g (E) dans cette expérience. Des bouts de papier ont été découpés en forme de cerfs-volants de 2 mm de diamètre pour servir de barrières (F). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Le processus chirurgical pour l’expansion de la suture dans un modèle murin. Après avoir retourné le volet calvaire, la gravure à l’acide (A) ainsi que le collage (B) ont été effectués à l’endroit où les supports de rétention seraient exposés. Après avoir réinitialisé le rabat du cuir chevelu (C), les supports ont été exposés à la position marquée (D). Un ressort a été placé entre deux supports pour exercer une force d’expansion sur la suture calvaire, et deux bouts de papier ont été fixés aux deux extrémités du ressort comme barrières (E, F) après confirmation que les supports étaient solidement collés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : La procédure de nettoyage tissulaire PEGASOS a été appliquée pour deux os calvaires avec ou sans décalcification. Après perfusion, les os calvaires ont été séparés, avec des tissus mous et tachés de sang attachés (A). Les os calvaires qui ont subi le processus de décalcification (B) ou de non-décalcification (C) étaient presque complètement transparents après tout le processus de PEGASOS. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Les sutures calvaires se dilatent progressivement après l’exercice d’une force de traction. Images μCT de la suture sagittale sans charge de force (A) et après charge de force pendant 1 jour et 5 jours (B,C). Barre d’échelle : 100 μm. Exp = expansion. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Ostéogenèse activée après expansion de suture dans des images 3D. (A-C) Visualisation tridimensionnelle de sutures sagittales doublement marquées nettoyées par la méthode PEGASOS. Le rouge d’alizarine et le vert de calcéine ont été injectés par voie intrapéritonéale pendant la nuit avant l’expansion et avant l’euthanasie après l’expansion pendant 7 jours (B, C), respectivement, par rapport au groupe témoin sans charge mécanique aux mêmes points de temps (A). L’objectif 5x a été utilisé pour acquérir efficacement les images de suture complètes (A, B), et l’image de la boîte en (B) a été agrandie en (C, C', C'''') imagée avec un objectif 10x. Barre d’échelle en A,B : 100 μm, C : 150 μm. Exp = expansion. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Cellules de suture fortement proliférées lors de la charge de force de traction dans les images 3D. Les tests d’incorporation à montage complet combinés à la méthode d’élimination des tissus PEGASOS ont montré les cellules proliférantes dans l’ensemble de la suture lorsqu’elles sont silencieuses (A) ou après une charge de force pendant 1 jour et 7 jours (B, C). Image avec un objectif 10x. Les lignes pointillées délimitent deux bords pour les sutures sagittales. Barre d’échelle : 100 μm. Exp = expansion. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Processus | Solutions | Temps et température |
| 1. Injection intrapéritonéale | 1 mg/10 g d’EdU | 2 h avant d’euthanasier les souris |
| 2. La perfusion | 0,02 % d’héparine et 0,05 mol/L d’EDTA | / |
| 3. Fixation | 4 % de PFA | O/N, 4 °C |
| 4. Décalcification | 10 % d’EDTA | 2 jours, 37 °C |
| 5. Décoloration | 25% Quadrol | 1 jour, 37 °C |
| 6. Coloration EdU | Cocktail d’étiquetage | 1 jour, RT |
| 7. Dégraissage | 30% tert-butanol | 2 h, 37 °C |
| 50% tert-butanol | 2 h, 37 °C | |
| 70% de tert-butanol | 2 h, 37 °C | |
| 8. Déshydratation | Solution TB-PEG | 3 h*2, 37 °C |
| 9. Dégagement | Solution BB-PEG | 2 h, 37 °C |
Tableau 1 : Procédure de nettoyage des tissus PEGASOS pour les os calvaires avec coloration EdU.
| Processus | Solutions | Temps et température |
| 1. Injection intrapéritonéale | 20 mg/kg Rouge d’alizarine | Nuit avant l’agrandissement |
| 2. Injection intrapéritonéale | 5 mg/kg de calcéine | Nuit avant la collecte |
| 3. La perfusion | 0,02 % d’héparine et 0,05 mol/L d’EDTA | / |
| 4. Fixation | 4 % de PFA | O/N, 4 °C |
| 5. Décoloration | 25% Quadrol | 1 jour, 37 °C |
Tableau 2 : Procédure de nettoyage tissulaire PEGASOS pour les os calvaires avec double marquage des os minéralisés par le vert de calcéine et le rouge d’alizarine.
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Discussion
Nous avons appliqué un modèle murin standard d’expansion de suture pour observer les changements morphologiques réguliers qui se produisent chaque semaine pendant tout le cycle de remodelage d’un mois10. Ce modèle est utile pour la recherche sur le remodelage et la régénération de l’os calvaire par l’expansion des sutures calvaires, ainsi que pour l’étude de diverses cellules de suture in vivo. Pour présenter pleinement les résultats de ces recherches, une visualisation tridimensionnelle des tissus colorés est nécessaire. Par conséquent, la technologie PEGASOS, connue pour son efficacité dans l’élimination des tissus durs19,20, a été combinée à un double marquage et à une coloration EdU pour révéler des taux de minéralisation élargis et des cellules proliférantes pendant le processus d’expansion.
En ce qui concerne la chirurgie d’expansion de la suture, l’une des étapes clés est le collage de l’anneau de retenue. Pour assurer une liaison ferme avec la surface de l’os, nous avons normalisé le processus de gravure à l’acide et de collage au bas de l’anneau de retenue. Les petites boucles de l’anneau de rétention doivent être perpendiculaires à la surface de l’os et correspondre à de petits trous sur le cuir chevelu. Après avoir suturé le cuir chevelu, les petites boucles doivent être exposées à la surface de la peau à travers de petits trous dans un état naturel et équilibré pour éviter que l’anneau de rétention ne s’effondre lors de l’installation du ressort d’application de force et du fil guide, ce qui pourrait entraîner un échec de la chirurgie. De plus, le choix d’un ressort d’application de force approprié est essentiel pour une intervention chirurgicale réussie, car il facilite l’installation du ressort tout en empêchant l’anneau de rétention de tomber et en obtenant l’application de force prévue.
Par rapport aux modèles précédents, ce modèle offre plusieurs avantages. Tout d’abord, il empêche la formation de défauts osseux circulaires dans l’os pariétal, préservant ainsi le mode d’activation cellulaire. De plus, la force peut être supprimée à tout moment en démontant le ressort, ce qui le rend adapté à l’établissement d’un modèle de récurrence après étirement sous contrainte. La commodité du démontage du ressort garantit également un minimum de dommages secondaires aux animaux de laboratoire. De plus, l’amplitude mécanique de la contrainte de traction peut être facilement ajustée en modifiant la force du ressort. Il est important de noter que ce modèle maintient l’environnement physiologique naturel autour de la suture crânienne, assurant ainsi l’exactitude des résultats expérimentaux.
Cependant, il existe certaines limites à ce modèle d’extension. Tout d’abord, il y a un risque de chute de l’anneau de rétention si la force est excessive. Les novices devraient effectuer des exercices préliminaires lors de l’installation au printemps afin d’atténuer ce risque. Deuxièmement, il existe un risque d’infection lors de l’ouverture du cuir chevelu et de l’exposition du crâne, la désinfection des instruments est donc essentielle et le raccourcissement de la durée de la chirurgie est bénéfique pour la guérison. Une anesthésie excessive peut également entraîner la mort des souris.
En ce qui concerne la méthode passive PEGASOS, elle est applicable à l’obtention de la transparence dans les tissus et organes individuels, ainsi que dans l’ensemble de la tête et du corps des jeunes souris. Bien qu’efficace pour les os calvaires entiers, un temps de traitement plus long est nécessaire pour les échantillons plus volumineux, en particulier pour les tissus osseux entiers ou les tissus osseux longs en vrac avec articulations. Il est important de noter que la décalcification des tissus ne doit pas être effectuée lors de l’utilisation du protocole de double marquage, car cela interfère avec le processus de coloration. La méthode d’élimination des tissus PEGASOS est également flexible, permettant une combinaison avec diverses méthodes de marquage, non limitées à l’incorporation d’EdU ou au double marquage calcique, mais aussi à la fluorescence endogène dans des modèles de souris transgéniques ou à la coloration de colorants ou d’anticorps à montage entier, le tout avec une fluorescence bien préservée.
Avec des effets stables et une répétabilité élevée, ce modèle d’expansion de suture convient à diverses souches de souris transgéniques d’âges différents. La possibilité d’ajuster à tout moment l’amplitude de la contrainte de traction et de retirer la force permet une recherche pratique sur la récurrence après une stimulation par contrainte. En combinant la méthode de double marquage des os minéralisés avec la technique de nettoyage tissulaire PEGASOS, nous pouvons observer la distribution spatio-temporelle tridimensionnelle des cellules souches de suture crânienne au cours du remodelage osseux, ce qui permet d’explorer plus en détail la relation entre les SUSC et les contraintes mécaniques, ainsi que ses mécanismes spécifiques.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions pour la plate-forme de laboratoire et l’assistance de l’Institut de l’oreille de l’École de médecine de l’Université Jiaotong de Shanghai. Ce travail a été soutenu par le programme Pujiang de Shanghai (22PJ1409200) ; Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n° 11932012) ; Fondation de recherche scientifique postdoctorale de l’Hôpital du neuvième peuple de Shanghai, École de médecine de l’Université Jiao Tong de Shanghai ; Financement du programme de recherche fondamentale du Neuvième Hôpital du Peuple affilié à la faculté de médecine de l’Université Jiao Tong de Shanghai (JYZZ154).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37% Acid etching | Xihubiom | E10-02/1807011 | |
| Alizarin red | Sigma-Aldrich | A3882 | |
| AUSTRALIAN WIRE | A.J.WILCOCK | 0.014'' | |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | B6630 | |
| Calcein green | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Copper(II) sulfate, anhydrous | Sangon Biotech | A603008 | |
| Dynamometer | Sanliang | SF-10N | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| EdU | Invitrogen | E104152 | |
| Laser Confocal Microscope | Leica | SP8 | |
| PBS | Sangon Biotech | E607008 | |
| PEG-MMA 500 | Sigma-Aldrich | 447943 | |
| PFA | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| pH Meters | Mettler Toledo | S220 | |
| Quadrol | Sigma-Aldrich | 122262 | |
| Sodium Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| Sodium bicarbonate | Sangon Biotech | A500873 | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A610476 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Spring | TAOBAO | 0.2*1.5*1*7 | |
| Sulfo-Cyanine3 azide | Lumiprobe | A1330 | |
| tert-Butanol | Sigma-Aldrich | 360538 | Protect from light. Do not freeze. |
| Transbond MIP Moisture Insensitive Primer |
3M Unitek | 712-025 | |
| Transbond XT Light Cure Adhesive Paste |
3M Unitek | 712-035 | |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | V900257 | |
| Tris-buffered saline | Sangon Biotech | A500027 |
References
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