Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

एक सिवनी विस्तार माउस मॉडल में हड्डी रीमॉडेलिंग के लिए एक 3-डी दृश्य तकनीक

Published: August 18, 2023 doi: 10.3791/65709
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Department of Orthodontics, China Shanghai Ninth People’s Hospital, College of Stomatology, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2National Center for Stomatology, National Clinical Research Center for Oral Diseases, Shanghai Key Laboratory of Stomatology, Shanghai Jiao Tong University

Summary

यह प्रोटोकॉल तन्यता बल लोडिंग के तहत सिवनी और हड्डी रीमॉडेलिंग के मेकेनोबायोलॉजिकल परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए एक मानकीकृत सिवनी विस्तार माउस मॉडल और एक 3-डी विज़ुअलाइज़ेशन विधि प्रस्तुत करता है।

Abstract

क्रानियोफेशियल टांके क्रानियोफेशियल हड्डियों को जोड़ने वाले रेशेदार जोड़ों से परे एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं; वे कैल्वरियल और चेहरे की हड्डी के विकास के लिए प्राथमिक स्थान के रूप में भी काम करते हैं, आवास मेसेनकाइमल स्टेम सेल और ऑस्टियोप्रोजेनिटर्स हैं। चूंकि अधिकांश क्रानियोफेशियल हड्डियां इंट्रामेम्ब्रानस ऑसिफिकेशन के माध्यम से विकसित होती हैं, टांके के सीमांत क्षेत्र दीक्षा बिंदुओं के रूप में कार्य करते हैं। इस महत्व के कारण, ये टांके आर्थोपेडिक उपचारों में पेचीदा लक्ष्य बन गए हैं जैसे वसंत-सहायता प्राप्त कपाल तिजोरी विस्तार, तेजी से मैक्सिलरी विस्तार और मैक्सिलरी प्रोट्रैक्शन। आर्थोपेडिक ट्रेसिंग बल के तहत, सिवनी स्टेम सेल तेजी से सक्रिय होते हैं, विस्तार के दौरान हड्डी रीमॉडेलिंग के लिए एक गतिशील स्रोत बन जाते हैं। उनके महत्व के बावजूद, हड्डी रीमॉडेलिंग अवधि के दौरान शारीरिक परिवर्तन खराब समझ में आते हैं। पारंपरिक सेक्शनिंग विधियों, मुख्य रूप से धनु दिशा में, पूरे सिवनी में होने वाले व्यापक परिवर्तनों पर कब्जा नहीं करते हैं। इस अध्ययन ने बाण के समान सिवनी विस्तार के लिए एक मानक माउस मॉडल स्थापित किया। सिवनी विस्तार के बाद हड्डी रीमॉडेलिंग परिवर्तनों की पूरी तरह से कल्पना करने के लिए, पेगासोस ऊतक समाशोधन विधि को पूरे-माउंट ईडीयू धुंधला और कैल्शियम चेलेटिंग डबल लेबलिंग के साथ जोड़ा गया था। इसने विस्तार के बाद पूरे कैल्वरियल हड्डियों में अत्यधिक प्रसार कोशिकाओं और नई हड्डी के गठन के दृश्य की अनुमति दी। यह प्रोटोकॉल एक मानकीकृत सिवनी विस्तार माउस मॉडल और एक 3-डी विज़ुअलाइज़ेशन विधि प्रदान करता है, जो तन्य बल लोडिंग के तहत टांके और हड्डी रीमॉडेलिंग में मेकेनोबायोलॉजिकल परिवर्तनों पर प्रकाश डालता है।

Introduction

क्रानियोफेशियल टांके रेशेदार ऊतक होते हैं जो क्रानियोफेशियल हड्डियों को जोड़ते हैं और क्रानियोफेशियल हड्डियों के विकास और रीमॉडेलिंग में आवश्यक भूमिका निभाते हैं। सिवनी की संरचना एक नदी जैसा दिखता है, जो "नदी के किनारे" को पोषण और निर्माण करने के लिए सेल संसाधनों का प्रवाह प्रदान करता है, जिसे ओस्टोजेनिक मोर्चों के रूप में जाना जाता है, जो इंट्रामेम्ब्रानस ओस्टोजेनेसिस1 के माध्यम से क्रानियोफेशियल हड्डियों के निर्माण में योगदान देता है।

क्रानियोफेशियल टांके में रुचि को कपाल टांके और चेहरे की सिवनी शिथिलता के समय से पहले बंद होने को समझने के लिए नैदानिक आवश्यकताओं से प्रेरित किया गया है, जिससे बच्चों में क्रानियोफेशियल विकृति और यहां तक कि जीवन-धमकी की स्थिति भी हो सकती है। ओपन suturectomy नियमित रूप से नैदानिक उपचार में प्रयोग किया जाता है, लेकिन लंबे समय तक अनुवर्ती कुछ रोगियों में अपूर्ण पुन: ossification पुनरावृत्ति दिखाया गया है2. विस्तार स्प्रिंग्स या एंडोस्कोपिक पट्टी craniectomy द्वारा सहायता प्रदान न्यूनतम इनवेसिव craniotomy ऊतकों 3 त्यागने के बजाय संभावित सिवनी के संरक्षण के लिए एक सुरक्षित दृष्टिकोण प्रदान कर सकतेहैं. इसी तरह, इस तरह के चेहरे के मुखौटे और विस्तार उपकरणों के रूप में आर्थोपेडिक उपचारों का व्यापक रूप से बाण के बराबर या क्षैतिज मैक्सिलरी हाइपोप्लासिया के इलाज के लिए उपयोग किया गया है, कुछ अध्ययनों में मिनीस्क्रू-असिस्टेड पैलेटल विस्तारकों 4,5,6 के माध्यम से वयस्क रोगियों के इलाज के लिए आयु सीमा का विस्तार किया गया है। इसके साथ ही, मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं के साथ कपाल सिवनी पुनर्जनन (एमएससी) biodegradable सामग्री के साथ संयुक्त भविष्य में एक संभावित चिकित्सा है,संबंधित रोगों 7 के उपचार के लिए एक उपन्यास दिशा की पेशकश. हालांकि, टांके की कार्य प्रक्रिया या नियामक तंत्र मायावी रहता है।

अस्थि रीमॉडेलिंग में मुख्य रूप से ओस्टियोब्लास्ट द्वारा आयोजित हड्डी के गठन और ओस्टियोक्लास्ट द्वारा आयोजित हड्डी के पुनर्जीवन के बीच संतुलन होता है, जहां यांत्रिक संकेतों द्वारा उत्तेजित स्टेम कोशिकाओं का ओस्टोजेनिक भेदभाव एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। दशकों के शोध के बाद, यह पाया गया है कि क्रानियोफेशियल टांके अत्यधिक प्लास्टिक मेसेनकाइमल स्टेम सेल निचे8 हैं। सिवनी स्टेम सेल (SuSCs) स्टेम सेल का एक विषम समूह है, जो मेसेनकाइमल स्टेम सेल (MSCs) या बोन स्टेम सेल (SSCs) से संबंधित है। SuSCs को चार मार्करों द्वारा विवो में लेबल किया जाता है, जिनमें Gli1, Axin2, Prrx1 और Ctsk शामिल हैं। Gli1+ SuSCs, विशेष रूप से, सख्ती से स्टेम कोशिकाओं की जैविक विशेषताओं सत्यापित किया है, न केवल ठेठ एमएससी मार्करों की उच्च अभिव्यक्ति का प्रदर्शन लेकिन यह भी उत्कृष्ट osteogenic और chondrogenic क्षमता9का प्रदर्शन. पिछले शोध से पता चला है कि Gli1 + SuSCs सक्रिय रूप से तन्य बल के तहत नई हड्डी के गठन के लिए योगदान, उन्हें सीवन स्टेम सेल स्रोत व्याकुलता osteogenesis10 का समर्थन के रूप में पहचान.

अतीत में, स्टेम कोशिकाओं की व्यापक यांत्रिक विशेषताओं फ्लेक्ससेल, चार-बिंदु झुकने, माइक्रो-चुंबक लोडिंग सिस्टम और अन्य के माध्यम से इन विट्रो में अध्ययन किया गया था। हालांकि माउस कपाल सिवनी व्युत्पन्न mesenchymal कोशिकाओं इन विट्रो11 में पहचान की गई है, और मानव सिवनी mesenchymal स्टेम कोशिकाओं को भी हाल ही में12 अलग किया गया है, सिवनी कोशिकाओं के biomechanical प्रतिक्रिया इन विट्रो प्रणाली में स्पष्ट नहीं रहता है. आगे हड्डी रीमॉडेलिंग प्रक्रिया की जांच करने के लिए, पृथक कैल्वरिया अंग संस्कृति पर आधारित एक सिवनी विस्तार मॉडल स्थापित किया गया है, जो विवो सिवनी विस्तार मॉडल 1,13 में एक उपयोगी स्थापित करने का मार्ग प्रशस्त करता है। खरगोश14 और चूहे15 सिवनी विस्तार के लिए बुनियादी अनुसंधान में सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किए जाने वाले जानवर रहे हैं। हालांकि, चूहों को मनुष्यों के साथ उनके अत्यधिक समरूप जीनोम, कई जीन संशोधन लाइनों और मजबूत प्रजनन संकरण क्षमता के कारण मानव रोग की खोज के लिए पशु मॉडल पसंद किए जाते हैं। कपाल सिवनी विस्तार के मौजूदा माउस मॉडल आम तौर पर बाण के समान सिवनी16,17 के लिए तन्य बल लागू करने के लिए स्टेनलेस स्टील ऑर्थोडोंटिक वसंत तारों पर भरोसा करते हैं। इन मॉडलों में, विस्तार उपकरण को ठीक करने के लिए पार्श्विका हड्डियों के प्रत्येक तरफ दो छेद किए जाते हैं, और तारों को त्वचा के नीचे एम्बेडेड किया जाता है, जो सेल सक्रियण मोड को प्रभावित कर सकता है।

दृश्य विधि के बारे में, धनु दिशा में स्लाइस के द्वि-आयामी अवलोकन को आम तौर पर दशकों से अपनाया गया है। हालांकि, यह देखते हुए कि हड्डी रीमॉडेलिंग एक जटिल त्रि-आयामी गतिशील प्रक्रिया है, पूर्ण त्रि-आयामी जानकारी प्राप्त करना एक तत्काल आवश्यकता बन गई है। पेगासोस ऊतक पारदर्शिता तकनीक इस आवश्यकता को पूरा करने के लिए उभरा, 18,19. यह कठोर और नरम ऊतकों की पारदर्शिता के लिए अद्वितीय लाभ प्रदान करता है, जिससे पूरी हड्डी रीमॉडेलिंग प्रक्रिया को त्रि-आयामी अंतरिक्ष में पुन: पेश किया जा सकता है।

हड्डी रीमॉडेलिंग अवधि में शारीरिक परिवर्तनों की गहरी और अधिक व्यापक समझ हासिल करने के लिए, हस्तनिर्मित धारकों के बीच एक वसंत सेटिंग के साथ एक मानक धनु सिवनी विस्तार माउस मॉडल10 स्थापित किया गया था। एक मानकीकृत एसिड नक़्क़ाशी और संबंध प्रक्रिया के साथ, विस्तार उपकरण मजबूती से कपाल हड्डी के लिए बंधुआ किया जा सकता है, बाण के बाण के लिए लंबवत एक तन्यता बल पैदा करने. इसके अलावा, पेगासोस ऊतक समाशोधन विधि को सिवनी विस्तार के बाद हड्डी मॉडलिंग परिवर्तनों को पूरी तरह से देखने के लिए खनिज हड्डी के बाद के डबल लेबलिंग के बाद लागू किया गया था।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

यहां वर्णित सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को शंघाई नौवें पीपुल्स अस्पताल, शंघाई जिओ टोंग यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन (SH9H-2023-A616-SB) की पशु देखभाल समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। इस अध्ययन में 4 सप्ताह पुराने C57BL/6 नर चूहों का इस्तेमाल किया गया था। उपयोग किए गए सभी उपकरणों को प्रक्रिया से पहले निष्फल कर दिया गया था।

1. सिवनी विस्तार मॉडल की तैयारी

  1. दो प्रतिधारण धारकों की तैयारी।
    1. हल्के तार सरौता के साथ एक पेचदार लूप बनाने के लिए 0.014 '' ऑस्ट्रेलियाई तार या स्टेनलेस स्टील के तार ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करें। लूप का व्यास 2 मिमी है, और 1 मिमी पूंछ दो तरफ(चित्रा 1ए)पर आरक्षित है।
    2. एक आटोक्लेव, प्लाज्मा स्टेरलाइज़र, या उपयुक्त ठंडे स्टेरिलेंट (जैसे, ग्लूटार्डाल्डिहाइड) में सर्जरी के लिए तारों और धारकों को जीवरहित।
  2. स्प्रिंग्स की तैयारी।
    1. अनुकूलित स्टेनलेस स्टील स्प्रिंग्स तैयार करें।
      नोट: इस अध्ययन में 0.2 मिमी तार व्यास, 1.5 मिमी बाहरी व्यास, 1 मिमी अंतराल स्थान और 7 मिमी लंबाई के साथ दबाव वसंत का उपयोग किया जाता है। प्रत्येक 1 मिमी वसंत संपीड़न ने लगभग 30 ग्राम का जोर प्राप्त किया।
    2. सेटिंग से पहले वसंत को उपलब्ध लंबाई में काटें। प्रयोग से पहले विशेष वसंत के लिए बल की पुष्टि करें।
      नोट: स्प्रिंग्स के आकार तब तक भिन्न होते हैं जब तक बल परिमाण समानांतर प्रयोगों में समान होता है। बल को एक टेबलटॉप एकअक्षीय परीक्षण उपकरण या एक छोटे इलेक्ट्रॉनिक डायनेमोमीटर (सामग्री की तालिकादेखें) द्वारा मापा जाता है यदि स्थिति सीमित है। लंबाई परिवर्तन का मूल्यांकन बल परिमाण (चित्रा 1C-E) के लिए किया जाता है। विशेष रूप से, उम्र, माउस की हड्डी की स्थिति और अनुसंधान वस्तुओं के आधार पर वसंत बल लोडिंग मूल्य को बदलना आवश्यक है।
    3. 7 मिमी लंबाई के एक सीधे ऑस्ट्रेलियाई तार या सीधे स्टील के तार तैयार करें, और बाधाओं (चित्रा 1 एफ) के रूप में उपयोग करने के लिए 2 मिमी व्यास के साथ कागज के दो टुकड़े बनाएं।

2. धनु सिवनी विस्तार सर्जरी

  1. एनेस्थेटाइजेटाइजेशन: चूहों को टाइलटामाइन (25 मिलीग्राम/किग्रा), ज़ोलाज़ेपम (25 मिलीग्राम/किग्रा) और ज़ाइलाज़ीन (10 मिलीग्राम/किग्रा) के साथ एनेस्थेटाइज़ करें। उसी समय, कॉर्निया को सूखने से रोकने के लिए आंखों पर बाँझ नेत्र मरहम लागू करें। एक पैर की अंगुली चुटकी के माध्यम से चूहों के संज्ञाहरण की गहराई का न्यायाधीश।
    नोट: निम्नलिखित विशेषताओं से संकेत मिलता है कि माउस ठीक से संवेदनाहारी है: धीमी और स्थिर श्वास, अंगों की कमजोरी, मांसपेशियों में छूट, त्वचा एक्यूपंक्चर पलटा और पलक पलटा के गायब होने, साथ ही कमजोर कॉर्नियल पलटा।
  2. फर हटाने और कीटाणुशोधन: बालों को हटाने क्रीम के साथ सिर के शीर्ष पर फर को सावधानीपूर्वक हटा दें; आंखों को छूने से बचें। इसके तुरंत बाद, सर्जिकल साइट कीटाणुरहित करने के लिए आयोडोफोर और 75% अल्कोहल के वैकल्पिक दौर का उपयोग करें। चमड़े के नीचे इंजेक्शन द्वारा चूहों को एनाल्जेसिया के रूप में मेलॉक्सिकैम (1 मिलीग्राम / किग्रा) का प्रशासन करें।
  3. शरीर की स्थिति निर्धारण: सामने की तरफ झूठ बोल माउस रखो और ऑपरेटिंग टेबल पर अंगों को ठीक करने के लिए शल्य चिकित्सा टेप का उपयोग करें.
  4. ओपन स्कैल्प फ्लैप: सर्जिकल कैंची का उपयोग माउस की गर्दन के पास खोपड़ी के साथ एक धनुषाकार फ्लैप करने के लिए, पूरी तरह से धनु सिवनी और आसपास की खोपड़ी को उजागर करना। उसके बाद, ऑपरेटिंग टेबल पर 6-0 सिवनी के साथ स्कैल्प फ्लैप को ठीक करें।
  5. एसिड नक़्क़ाशी के बाद प्रतिधारण धारकों को बॉन्ड करें।
    1. खोपड़ी सूखी और 20 एस के लिए 37% फॉस्फोरिक एसिड के साथ यह नक़्क़ाशी, और एसिड नक़्क़ाशी (चित्रा 2 ए) को साफ करने के लिए सामान्य खारा का उपयोग करें. रबर विंदुक बल्ब के साथ खोपड़ी को सुखाने के बाद एक चॉकलेट अवशेष स्पष्ट होगा।
    2. पार्श्विका हड्डियों के दोनों किनारों पर दो धारकों (चरण 1.1 में तैयार) सीमेंट एक हल्के ठीक चिपकने वाला (चित्रा 2 बी) के साथ बाण के समान टांके से 3 मिमी।
  6. स्कैल्प फ्लैप को रीसेट करें।
    1. मैन्युअल रूप से खोपड़ी फ्लैप (चित्रा 2 सी) वापस रखो। धारकों की स्थिति को लेबल करें, द्विपक्षीय प्रतिधारण धारकों की संबंधित स्थिति में खोपड़ी में दो छोटे छेद काट लें, और फिर फड़फड़ाहट वाली खोपड़ी को रीसेट करें।
    2. उसी समय, त्वचा की सतह को उजागर करने के लिए छेद के माध्यम से छोटे छोरों को पास करें। एक 6-0 सिवनी (चित्रा 2 डी) के साथ घुमावदार चीरा सीवन. त्वचा की रिकवरी के लिए एक से तीन दिन की अनुमति है। 1 से 3 दिनों के लिए हर 24 घंटे में चमड़े के नीचे इंजेक्शन द्वारा चूहों को मेलॉक्सिकैम (1 मिलीग्राम / किग्रा) का प्रशासन करें।
      नोट: सर्जरी के बाद, दैनिक माउस खोपड़ी की गतिविधि की जांच करें और धारकों गिर जाते हैं या नहीं। रंग और मोटाई के मामले में विभिन्न प्रकार की त्वचा होती है; स्वस्थ त्वचा की खोपड़ी मूल रंग को बनाए रखेगी, और त्वचा के किनारे धीरे-धीरे टांके लगाने के बाद एक साथ फ्यूज हो जाएंगे। यदि खोपड़ी का संक्रमण पाया जाता है, या यदि सर्जिकल डिवाइस गिर गया है, तो माउस को अध्ययन से हटा दें और इसे इच्छामृत्यु दें।
  7. स्प्रिंग और गाइड वायर स्थापित करें।
    1. दो धारकों के बीच की दूरी से 1 मिमी लंबा वसंत काटें।
    2. चयनित दबाव वसंत को संपीड़ित करें और इसे दोनों तरफ छोटे कॉइल के बीच रखें।
    3. छोटे कॉइल और वसंत के माध्यम से स्टेनलेस स्टील के तार को पास करें, और लगभग 30 ग्राम का शुरुआती जोर प्राप्त करने के लिए वसंत को छोड़ दें।
    4. माउस के वसंत क्षेत्र के तहत खोपड़ी किसी भी संपीड़न के बिना है कि जाँच करें.
    5. यह पुष्टि करने के बाद कि संबंध बिना किसी ढीलेपन के दृढ़ है, वसंत के दोनों सिरों पर बाधाओं को स्थापित करने के लिए वसंत और धारकों के बीच कागज के दो स्क्रैप को हल्के-ठीक चिपकने वाला बांधें(चित्र 2ई,एफ)।

3. खनिज हड्डियों की डबल लेबलिंग

  1. स्टॉक समाधान की तैयारी।
    1. आसुत जल के साथ एक कमजोर पड़ने समाधान तैयार करें जिसमें 0.9% NaCl और 2% NaHCO3 शामिल हैं।
    2. एलिज़रीन कॉम्प्लेक्स डाइहाइड्रेट के 20 मिलीग्राम/एमएल और कैल्सिन के 10 मिलीग्राम/एमएल तैयार करने के लिए मंदक समाधान का उपयोग करें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
    3. पीएच मापने वाले उपकरण का उपयोग करके पीएच को 7.4 तक समायोजित करें। सटीक रीडिंग सुनिश्चित करने के लिए माप के बीच पीएच जांच को फ्लश करें।
    4. डाई को एक बाँझ कंटेनर में डालें और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर रेफ्रिजरेटर में स्टोर करें; पन्नी का उपयोग प्रकाश को बाहर रखने के लिए किया जाता है।
  2. कार्य समाधान तैयार करें। इंजेक्शन से पहले, एक विघटन समाधान का उपयोग करके कैल्शियम के लिए 1 मिलीग्राम/एमएल और एलिज़रीन कॉम्प्लेक्स डाइहाइड्रेट के लिए 2 मिलीग्राम/एमएल के लिए स्टॉक समाधान को पतला करें।
  3. इंट्रापेरिटोनली 5 मिलीग्राम/किलोग्राम कैल्सिन हरे और 20 मिलीग्राम/किलोग्राम एलिज़रीन लाल को दो समय बिंदुओं पर इंजेक्ट करें ताकि खनिज हड्डियों को लेबल किया जा सके और दो बार के बीच परिवर्तनों का विश्लेषण किया जा सके। आम तौर पर, इंजेक्शन के बाद नमूने 12-14 घंटे इकट्ठा.
    नोट: इंजेक्शन से पहले रंगों को गर्म करें, और सुनिश्चित करें कि इंजेक्शन का समय 3 मिनट से कम नहीं है। इंजेक्शन अंतराल विस्तार के समय पर निर्भर करता है। इस अध्ययन में, एलिज़रीन लाल और कैल्सिन हरे रंग को क्रमशः विस्तार से पहले रात भर (ओ / एन) और संग्रह से पहले ओ / एन इंजेक्ट किया गया था।
  4. दूसरे इंजेक्शन के एक दिन बाद ऊतक समाशोधन प्रक्रिया के लिए तैयार पूरे कैल्वरियल हड्डियों को इकट्ठा करें।

4. EdU धुंधला हो जाना

  1. इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन: चूहों को इच्छामृत्यु देने से पहले इंट्रापेरिटोनली ईडीयू 2 एच इंजेक्ट करें (संस्थागत रूप से अनुमोदित प्रोटोकॉल का पालन करें)। खुराक 1 मिलीग्राम / 10 ग्राम शरीर का वजन है।
  2. लेबलिंग कॉकटेल तैयारी: मिक्स ट्रिस-बफर खारा (100 मिमीलो / एल अंतिम, पीएच 7.6), क्यूएसओ4 (4 मिमीलो / एल अंतिम), सल्फो-साइनिन 3 एज़ाइड (2-5 माइक्रोमोल / एल अंतिम) और सोडियम एस्कॉर्बेट (100 मिमीलो / एल अंतिम, ताजा प्रत्येक उपयोग किया गया) ( सामग्री की तालिकादेखें)।
  3. EdU पूरे-माउंट धुंधला: PEGASOS ऊतक समाशोधन विधि (चरण 7) में ऊतक decolorization कदम के बाद, कमरे के तापमान (आरटी) पर 1 दिन के लिए लेबलिंग कॉकटेल में नमूने डाल दिया.

5. माइक्रो-कंप्यूटेड टोमोग्राफी इमेजिंग

  1. ऊतक निर्धारण और भंडारण: 4 डिग्री सेल्सियस ओ / एन पर 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) में कैल्वरियल हड्डियों को ठीक करें और स्कैन करने से पहले उन्हें 0.5% पीएफए में स्टोर करें।
  2. स्कैनिंग और विश्लेषण: उच्च रिज़ॉल्यूशन और 7 माइक्रोन के वोक्सेल आकार के साथ माइक्रो-कंप्यूटेड टोमोग्राफी (μCT) इमेजिंग सिस्टम के साथ नमूनों को स्कैन करें।

6. पेगासोस ऊतक समाशोधन के लिए कार्य समाधान की तैयारी

  1. 4% पॉलीफॉर्मलडिहाइड (पीएफए): 1× पीबीएस से 100 एमएल में 4 ग्राम पीएफए पाउडर घोलें।
  2. कार्डियक परफ्यूजन समाधान: 0.02% हेपरिन, यानी 20 मिलीग्राम हेपरिन पाउडर 1× पीबीएस से 100 एमएल में भंग; वैकल्पिक रूप से, 0.05 mol/L EDTA, यानी 0.05 mol एथिलीन डायमाइन टेट्राएसेटिक एसिड (EDTA) ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करें, जो 1 L की कुल मात्रा में एक विआयनीकृत जलीय घोल में भंग हो जाता है।
  3. Decalcification समाधान: 0.5 mol/L EDTA, यानी 0.5 mol एथिलीन डायमाइन टेट्राएसेटिक एसिड (EDTA), 1 L की कुल मात्रा में एक विआयनीकृत जलीय घोल में भंग।
  4. विमुद्रीकरण समाधान: 25% क्वाड्रोल, जो क्वाड्रोल (एन, एन, एन', एन' - टेट्राकिस (2-हाइड्रॉक्सीप्रोपाइल) एथिलीनडायमाइन) का 250 एमएल है ( सामग्री की तालिका) विआयनीकृत पानी में 1 एल की कुल मात्रा में भंग हो गया।
    नोट: क्वाड्रोल की चिपचिपाहट के कारण, कॉन्फ़िगरेशन से पहले इसकी तरलता बढ़ाने के लिए इसे 60 डिग्री सेल्सियस तक गर्म किया जा सकता है।
  5. घटते समाधान: 30%, 50%, 70% टर्ट-बुटानॉल (टीबी) ( सामग्री की तालिकादेखें), मात्रा अंश द्वारा पानी के साथ तैयार।
    नोट: यह देखते हुए कि शुद्ध टीबी कमरे के तापमान पर क्रिस्टलीय है, इसे 60 डिग्री सेल्सियस तक गर्म किया जाना चाहिए जब तक कि इसका उपयोग करने से पहले यह घुल न जाए। इसके बाद, समाधान >9.5) के पीएच को विनियमित करने के लिए 3% से 5% (वी / वी) ट्राइथेनॉलमाइन (टीईए) जोड़ा जाता है।
  6. निर्जलीकरण समाधान: टीबी-पीईजी समाधान, 70% टीबी + 27% पीईजी-एमएमए + 3% क्वाड्रोल (वी / वी), जिसमें पीईजी-एमएमए पॉली (एथिलीन ग्लाइकॉल) मिथाइल ईथर मेथैक्रिलेट है जिसका औसत आणविक भार 500 (पॉली (एथिलीन ग्लाइकॉल) मेथैक्रिलेट 500, पीईजी-एमएमए 500) ( सामग्री की तालिकादेखें)।
  7. पारदर्शी समाधान: बीबी-पीईजी समाधान, 75% बीबी + 22% पीईजी-एमएमए + 3% क्वाड्रोल (वी / वी), जिसमें बीबी बेंजाइल बेंजोएट (बीबी) है।

7. पेगासोस विधि के साथ कैल्वरियल हड्डियों की पारदर्शिता

  1. एनेस्थेटिक्स (चरण 2.1) के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा माउस को एनेस्थेटाइज करें, और चुटकी प्रतिक्रिया के माध्यम से माउस के संज्ञाहरण की गहराई का न्याय करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि कार्डियक परफ्यूजन से पहले कोई प्रतिरोध प्रतिक्रिया नहीं है।
  2. कार्डियक परफ्यूजन और फिक्सेशन करें।
    1. माउस के पेट को ऊपर की ओर पकड़ें, चिपकने वाली टेप के साथ अंगों को ठीक करें, और ध्यान से इसे पूरी तरह से बेनकाब करने के लिए वक्ष की परिधि के साथ काट लें।
    2. इसके तुरंत बाद नेत्र कैंची के साथ सही आलिंद में एक छोटी सी कटौती करने के बाद, बाएं वेंट्रिकल के शीर्ष पर एक छिड़काव 22 जी सुई डालें.
      नोट: अत्यधिक सम्मिलन के माध्यम से हृदय वाल्व को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए केवल सुई की नोक डाली जाती है। अन्यथा, कार्डियक परफ्यूजन द्रव फुफ्फुसीय परिसंचरण में प्रवेश करेगा, प्रणालीगत परिसंचरण के छिड़काव प्रभाव को प्रभावित करेगा।
    3. सिरिंज में 30-50 एमएल कार्डियक परफ्यूजन तरल पदार्थ (चरण 6.2) को पुश करें। यह देखा जा सकता है कि यकृत धीरे-धीरे चमकदार लाल से पीला हो जाता है।
    4. सही आलिंद से बहिर्वाह तरल पदार्थ पूरी तरह से स्पष्ट हो जाता है के बाद, समान मात्रा में 4% पीएफए समाधान डालना. पीएफए छिड़काव के आपरेशन एक हवादार हुड में आयोजित किया जाता है.
    5. ऊतकों और अंगों को काटना और अलग करना, और उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर 4% पीएफए के साथ रात भर ठीक करना।
  3. ऊतक डीकैल्सीफिकेशन: ईडीयू धुंधला द्वारा संसाधित नमूनों के लिए, लगभग 2 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मिलाते हुए टेबल में 0.5 mol/L EDTA (पीएच 7.0) समाधान (10 एमएल) में निश्चित कठोर ऊतक रखें, और तरल पदार्थ को दैनिक रूप से बदलें।
    नोट: सिग्नलिंग को पूरी तरह से संरक्षित करने के लिए हड्डियों को लेबल करने वाले कैल्शियम चेलेटिंग एजेंट के लिए सामान्यीकृत पेगासोस विधि में डीकैल्सीफिकेशन प्रक्रिया को छोड़ दें। अंतर्जात प्रतिदीप्ति या पूरे-माउंट इम्यूनोस्टेन्ड संकेतों की कल्पना करने के लिए हड्डियों के इलाज के लिए डीकैल्सीफिकेशन की आवश्यकता होती है।
  4. ऊतक decolorization: 1 दिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मिलाते हुए तालिका में 25% Quadrol समाधान (20 एमएल) में निश्चित calvarial हड्डियों रखें, और एक बार तरल पदार्थ बदलें.
    नोट: decolorization समय ऊतक में हीम सामग्री से संबंधित है। उपचार तरल के रंग का निरीक्षण करें, क्योंकि रंग की गहराई द्रव प्रतिस्थापन उपचार जारी रखने की आवश्यकता का प्रतिनिधित्व करती है।
  5. EdU धुंधला: 5 मिनट (तीन बार) के लिए 1× पीबीएस में नमूने कुल्ला, और फिर उन्हें 1 दिन के लिए लेबलिंग कॉकटेल में विसर्जित कर दिया. उसके बाद, 1 घंटे (तीन बार) के लिए 1× पीबीएस में नमूने कुल्ला।
  6. ऊतक degreasing और निर्जलीकरण
    1. 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मिलाते हुए मेज पर घटती ढाल प्रदर्शन करने के लिए अनुक्रम में 30% टीबी, 50% टीबी, और 70% टीबी समाधान में ऊतकों रखें. लगभग 2 घंटे के लिए प्रत्येक एकाग्रता में रखें।
    2. इसके बाद, 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मिलाते हुए मेज पर 6 घंटे के लिए टीबी खूंटी समाधान में नमूने निर्जलीकरण.
      नोट: उपरोक्त प्रसंस्करण समय को ऊतक की संख्या के आधार पर बढ़ाया या घटाया जा सकता है।
  7. ऊतक पारदर्शिता: पारदर्शी होने तक 37 डिग्री सेल्सियस (2-4 एच) पर एक मिलाते हुए मेज पर बीबी-पीईजी समाधान में पूरी तरह से निर्जलित ऊतक रखें। वर्तमान में, नमूने 1-2 साल तक संग्रहीत किए जा सकते हैं।
    नोट: लगभग पूरी तरह से समाशोधन के बाद, नली ढक्कन खोलने के लिए नमूने और झटकों के साथ हवा के लिए मध्यम आगे पारदर्शिता में सुधार होगा. यह विधि व्यक्तिगत ऊतकों और अंगों की पारदर्शिता के साथ-साथ युवा चूहों के पूरे सिर और शरीर में सुधार के लिए उपयुक्त है। हालांकि, वयस्क चूहों के पूरे शरीर की पारदर्शिता के लिए, उपरोक्त चरणों को एक पूर्ण-चक्र छिड़काव विधि का उपयोग करके किया जाना चाहिए।

8. इमेजिंग

नोट: इस अध्ययन में पारदर्शी ऊतकों के 3-डी दृश्य के लिए कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग किया गया था। लाइट-शीट माइक्रोस्कोपी भी इस प्रोटोकॉल के लिए उपयुक्त है। कई ऑपरेटिंग सिस्टम को पहले उपलब्ध के रूप में सत्यापित किया गया है। यहां, एक लेजर कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप ऑपरेटिंग सिस्टम को एक उदाहरण के रूप में लिया जाता है ( सामग्री की तालिकादेखें)।

  1. उपयोगकर्ता पुस्तिका के अनुसार, लेजर कॉन्फोकल और एलएएस एएफ ऑपरेशन इंटरफ़ेस खोलने के लिए सही चरणों का पालन करें। विभिन्न शूटिंग चैनलों में आवश्यक लेजर चालू करें, और शक्ति समायोजित करें। ऑप्टिकल पथ और संबंधित तरंग दैर्ध्य, एलिज़रीन लाल के लिए 561 एनएम और कैल्सिन हरे रंग के लिए 488 एनएम सेट करें, जिनमें से कोई भी लेबलिंग कॉकटेल के अनुसार ईडीयू सिग्नल के लिए उपयोग किया जाता है।
  2. अवतल ग्लास पेट्री डिश में पारदर्शी नमूने रखें जो पारदर्शी तरल में पारदर्शी नमूनों को विसर्जित करने के लिए मोटी नमूनों, एम्बेडिंग बक्से, या स्व-निर्मित प्लेसमेंट उपकरणों जैसे जलरोधक गोंद ले जा सकते हैं।
  3. नमूने का शीघ्रता से पता लगाने के लिए कम-शक्ति वाले उद्देश्य लेंस का चयन करें। तेजी से स्कैनिंग समारोह के साथ पूरे calvarial ऊतक का एक सिंहावलोकन करें, और इमेजिंग के लिए ब्याज क्षेत्र लगता है.
  4. आउटपुट पावर सेट करें, स्कैनिंग मोड का चयन करें, और पहले शूटिंग गुणांक (रिज़ॉल्यूशन, स्कैनिंग गति, ज़ूम कारक, छवि गुणवत्ता, औसत पृष्ठभूमि शोर, आदि) को समायोजित करें।
    नोट: आम तौर पर, स्मार्ट गेन 500 से 800 तक होता है (सिग्नल और शोर परिवर्तन दोनों); छवि गुणवत्ता सुनिश्चित करते हुए स्मार्ट ऑफ़सेट जितना संभव हो उतना 0 के करीब है (पृष्ठभूमि शोर को कम करने के लिए)। जब पीएमटी लाभ 800 से अधिक है, या हाइड लाभ 100% से अधिक है, और चमक अभी भी अपर्याप्त है, लेजर तीव्रता उचित रूप से बढ़ाई जा सकती है, लेकिन सिद्धांत रूप में, कम, बेहतर।
  5. अक्षीय दूरी Z रेंज और Z चरण सेट करें, जिसे पारदर्शी संगठन के उथले पक्ष से ड्रिल किया जाता है; यही है, सबसे गहरे और उथले पक्षों को सेट करें।
    नोट: प्रत्येक लेंस के लिए वर्गीकरण और कार्य दूरी की पुष्टि करें। Z श्रेणी को सावधानीपूर्वक सेट करें, और चयनित लेंस की सीमा से अधिक कार्य दूरी का संचालन न करें। "जेड-गैल्वो" का चयन तब किया जा सकता है जब ठीक विनियमन की आवश्यकता हो।
  6. शूटिंग पैरामीटर फिर से सेट करें, और शूटिंग शुरू करें। पूरा होने के बाद, बहु-कार्यात्मक मॉड्यूल के माध्यम से छवियों को मर्ज और संसाधित करें। अंत में, संकेतित क्रम में उपकरण को स्टोर और बंद करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना, बाण के समान सिवनी विस्तार के लिए एक माउस मॉडल (चित्रा 1-2) स्थापित किया गया है. सिवनी विस्तार के बाद हड्डी मॉडलिंग परिवर्तनों के 3-डी दृश्य के लिए, पेगासोस ऊतक समाशोधन विधि को विस्तार के बाद पूरे कैल्वरियल हड्डियों पर लागू किया गया था। छिड़काव के बाद, कैल्वरियल हड्डियों को अलग किया गया था (चित्रा 3 ए), और उपयुक्त पेगासोस प्रक्रिया जारी रखी गई थी (तालिका 1 और तालिका 2)। उल्लेखनीय रूप से, पूर्ण पेगासोस प्रक्रिया के बाद कैल्वरियल हड्डियां लगभग पारदर्शी हो गईं, भले ही डीकैल्सीफिकेशन किया गया हो (चित्र 3बी, सी)।

विस्तार के बाद परिवर्तनों को जल्दी से देखने के लिए, एकत्रित और निश्चित नमूनों पर μCT का उपयोग किया गया था। नियंत्रण समूह(चित्रा 4ए)की तुलना में,1 दिन(चित्रा 4बी)के लिए बल लागू करने के बाद धीरे-धीरे और काफी विस्तारित सीवन का विस्तार हुआ। पांचवें दिन तक, शराबी बोनी प्रोट्रूशियंस हड्डी के किनारे (चित्रा 4सी) पर दिखाई दिए।

विस्तार के बाद पूरे सिवनी में खनिजकरण juxtaposition दर के तीन आयामी दृश्य के लिए, दोहरी लेबलिंग विधि कुशल पेगासोस तकनीक के साथ नियोजित किया गया था, यहां तक कि गैर decalcified calvarial हड्डियों (चित्रा 5) पर भी. शारीरिक स्थितियों के तहत, पूर्व-पोस्ट लेबलिंग संकेतों (चित्रा 5 ए) के बीच मामूली बदलाव थे, जबकि बल लोडिंग ने ऑस्टियोजेनेसिस को काफी सक्रिय कर दिया था। नव खनिज हड्डी के ज़िगज़ैग पैटर्न, एक एकल कैल्शियम पीले-हरे मार्कर के साथ लेबल, 7 दिनों (चित्रा 5 बी, सी) के लिए विस्तार के बाद चौड़ा हो गया। उच्च-रिज़ॉल्यूशन त्रि-आयामी दृश्य में, सीमांत हड्डियों के पैटर्न परिवर्तन ने सिवनी विस्तार के बाद हड्डी रीमॉडेलिंग प्रक्रिया का संकेत दिया, और नवगठित हड्डी की डिग्री टांके(चित्रा 5सी)के दो किनारों पर भिन्न होती है।

इसके अलावा, सिवनी विस्तार पर कोशिकाओं की प्रसार दर की कल्पना करने के लिए, पूरे-माउंट EdU निगमन को एक कैल्सीफिकेशन प्रक्रिया के साथ PEGASOS ऊतक समाशोधन विधि का उपयोग करके प्रयास किया गया था। सफलतापूर्वक, लेबलिंग कुशल और साफ ऊतकों में अच्छी तरह से संरक्षित था। नियंत्रण समूह में, कई EdU + कोशिकाओं को पूरे टांके(चित्रा 6A)में फैलाना वितरित किया गया था, जो शारीरिक हड्डी रीमॉडेलिंग के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है और संभवतः 2-डी सेक्शनिंग में अनदेखा किया जा सकता है। 1 दिन के लिए विस्तार पर, प्रसार कोशिकाओं टांके के बीच और किनारों (चित्रा 6 बी) में नुकीला. सिवनी चौड़ा के रूप में, प्रसार कोशिकाओं की संख्या समय के साथ कम हो गई, 7 दिन (चित्रा 6C) तक पहुँचने. हाइलाइट की गई कोशिकाएं अस्थि मज्जा में छोटी गोल कोशिकाएं थीं, जो रक्त कोशिकाओं को दर्शाती हैं, जो ईडीयू + सिवनी कोशिकाओं(चित्रा 6सी)से भिन्न थीं।

Figure 1
चित्रा 1: सर्जरी के लिए महत्वपूर्ण सामग्री तैयार की गई थी। प्रतिधारण धारक स्टेनलेस स्टील के तार से बने थे। उनके व्यास 2 मिमी थे, और 1 मिमी पूंछ दो तरफ (ए) आरक्षित थे। 0.2 मिमी तार व्यास, 1.5 मिमी बाहरी व्यास, 1 मिमी अंतराल स्थान के साथ दबाव वसंत लागू किया गया था (बी)। तन्यता बल का पता एक राजमिति (C, D) द्वारा लगाया गया था। प्रत्येक 1 मिमी वसंत संपीड़न ने इस प्रयोग में लगभग 30 ग्राम (ई) का जोर प्राप्त किया। कागज के स्क्रैप को बाधाओं (एफ) के रूप में उपयोग करने के लिए 2 मिमी व्यास के साथ पतंगों के आकार में काट दिया गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: माउस मॉडल का विस्तार करने वाली सिवनी के लिए सर्जिकल प्रक्रिया। कैल्वरियल फ्लैप को फ़्लिप करने के बाद, एसिड नक़्क़ाशी (ए) के साथ-साथ बॉन्डिंग (बी) उस स्थिति में किया गया था जहां प्रतिधारण धारकों को उजागर किया जाएगा। स्कैल्प फ्लैप (सी) को रीसेट करने के बाद, धारकों को चिह्नित स्थिति (डी) पर उजागर किया गया था। कैल्वरियल सिवनी पर विस्तार बल लगाने के लिए दो धारकों के बीच एक वसंत सेट किया गया था, और कागज के दो स्क्रैप वसंत के दोनों सिरों पर बाधाओं (ई, एफ) के रूप में तय किए गए थे, यह पुष्टि करने के बाद कि धारकों को मजबूती से बंधुआ किया गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: पेगासोस ऊतक समाशोधन प्रक्रिया को दो कैल्वरियल हड्डियों के साथ या बिना डीकैल्सीफिकेशन के लिए लागू किया गया था। छिड़काव के बाद, कैल्वरियल हड्डियों को अलग किया गया था, जिसमें कुछ रक्त-सना हुआ और नरम ऊतक जुड़े हुए थे (ए)। कैल्वरियल हड्डियां जिन्होंने डीकैल्सीफिकेशन प्रक्रिया (बी) या गैर-डीकैल्सीफिकेशन (सी) के साथ अनुभव किया है, पेगासोस की पूरी प्रक्रिया के बाद लगभग पूरी तरह से पारदर्शी थीं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: तन्य बल के परिश्रम के बाद धीरे-धीरे कैल्वरियल टांके का विस्तार हुआ। बल लोडिंग (ए) के बिना और 1 दिन और 5 दिनों (बी, सी) के लिए बल लोडिंग के बाद धनु सिवनी की μCT छवियां। स्केल बार: 100 माइक्रोन। ऍक्स्प = विस्तार। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: ओस्टियोजेनेसिस 3-डी छवियों में सिवनी विस्तार के बाद सक्रिय होता है। (ए-सी) पेगासोस विधि द्वारा साफ किए गए डबल-लेबल वाले धनु टांके का त्रि-आयामी दृश्य। एलिज़रीन लाल और कैल्सिन हरे रंग को विस्तार से पहले रात भर में इंजेक्ट किया गया था और क्रमशः 7 दिनों (बी, सी) के लिए विस्तार के बाद इच्छामृत्यु से पहले, एक ही समय बिंदु (ए) पर यांत्रिक लोडिंग के बिना नियंत्रण समूह की तुलना में। 5x लेंस का उपयोग पूरे सिवनी छवियों को कुशलतापूर्वक (ए, बी) प्राप्त करने के लिए किया गया था, और (बी) में बॉक्स छवि को 10x लेंस के साथ (सी, सी', सी '') में बढ़ाया गया था। ए, बी में स्केल बार: 100 माइक्रोन, सी: 150 माइक्रोन। ऍक्स्प = विस्तार। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: सिवनी कोशिकाओं अत्यधिक 3 डी छवियों में तन्य बल लोड हो रहा है पर प्रसारित. पेगासोस ऊतक समाशोधन विधि के साथ संयुक्त पूरे माउंट निगमन परख पूरे सिवनी में फैलने वाली कोशिकाओं को प्रदर्शित करते हैं जब शांति (ए) में या 1 दिन और 7 दिनों (बी, सी) के लिए बल लोडिंग के बाद। 10x लेंस के साथ इमेजेड। डैश लाइनें बाण के समान टांके के लिए दो किनारों की रूपरेखा तैयार करती हैं। स्केल बार: 100 माइक्रोन। ऍक्स्प = विस्तार। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

प्रक्रियाओं समाधान समय और तापमान
1. इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन 1 मिलीग्राम/10 ग्राम ईडीयू चूहों को इच्छामृत्यु से पहले 2 घंटे
2. छिड़काव 0.02% हेपरिन और 0.05 mol/L EDTA /
3. फिक्सेशन 4% पीएफए ओ/एन, 4 डिग्री सेल्सियस
4. डिकैल्सीफिकेशन 10% ईडीटीए 2 दिन, 37 डिग्री सेल्सियस
5. रंग का रंग 25% क्वाड्रोल 1 दिन, 37 डिग्री सेल्सियस
6. EdU धुंधला हो जाना लेबलिंग कॉकटेल 1 दिन, आरटी
7. घटना 30% tert-Butanol 2 घंटे, 37 डिग्री सेल्सियस
50% tert-Butanol 2 घंटे, 37 डिग्री सेल्सियस
70% टर्ट-बुटानॉल 2 घंटे, 37 डिग्री सेल्सियस
8. निर्जलीकरण टीबी-खूंटी समाधान 3 एच * 2, 37 डिग्री सेल्सियस
9. समाशोधन बीबी-खूंटी समाधान 2 घंटे, 37 डिग्री सेल्सियस

तालिका 1: ईडीयू धुंधला के साथ कैल्वरियल हड्डियों के लिए पेगासोस ऊतक समाशोधन प्रक्रिया।

प्रक्रियाओं समाधान समय और तापमान
1. इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन 20 मिलीग्राम/किग्रा अलिज़रीन लाल विस्तार से पहले रातोंरात
2. इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन 5 मिलीग्राम/किग्रा कैल्सिन संग्रह से पहले रातोंरात
3. छिड़काव 0.02% हेपरिन और 0.05 mol/L EDTA /
4. फिक्सेशन 4% पीएफए ओ/एन, 4 डिग्री सेल्सियस
5. रंग का रंग 25% क्वाड्रोल 1 दिन, 37 डिग्री सेल्सियस

तालिका 2: कैल्सीन हरे और एलिज़रीन लाल द्वारा खनिज हड्डियों के डबल लेबलिंग के साथ कैल्वरियल हड्डियों के लिए पेगासोस ऊतक समाशोधन प्रक्रिया।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

हम एक मानक सिवनी विस्तार माउस मॉडल लागू नियमित रूप से रूपात्मक परिवर्तन है कि पूरे महीने के लंबे रीमॉडेलिंग चक्र10 के दौरान हर हफ्ते होने वाली का निरीक्षण करने के लिए. यह मॉडल कैल्वरियल टांके का विस्तार करके कैल्वरियल हड्डी रीमॉडेलिंग और पुनर्जनन पर शोध करने के साथ-साथ विवो में विभिन्न सिवनी कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए उपयोगी है। इस तरह के शोध के परिणामों को पूरी तरह से प्रस्तुत करने के लिए, सना हुआ ऊतकों के त्रि-आयामी दृश्य की आवश्यकता होती है। इसलिए, PEGASOS प्रौद्योगिकी, कठोर ऊतक19,20 समाशोधन में अपनी दक्षता के लिए जाना जाता है, विस्तार प्रक्रिया के दौरान विस्तारित खनिज दरों और प्रसार कोशिकाओं को प्रकट करने के लिए दोहरी लेबलिंग और EdU धुंधला के साथ संयुक्त किया गया था.

सिवनी विस्तार सर्जरी के संबंध में, महत्वपूर्ण चरणों में से एक बनाए रखने वाली अंगूठी का संबंध है। हड्डी की सतह के साथ एक दृढ़ बंधन सुनिश्चित करने के लिए, हमने अनुचर अंगूठी के नीचे एसिड नक़्क़ाशी और संबंध प्रक्रिया को मानकीकृत किया। अनुचर की अंगूठी पर छोटे लूप हड्डी की सतह के लंबवत होने चाहिए और खोपड़ी पर छोटे छेद के अनुरूप होने चाहिए। खोपड़ी को टांके लगाने के बाद, छोटे छोरों को प्राकृतिक और संतुलित अवस्था में छोटे छेदों के माध्यम से त्वचा की सतह से अवगत कराया जाना चाहिए ताकि बल-लागू वसंत और गाइड तार की स्थापना के दौरान प्रतिधारण की अंगूठी ढहने से बचा जा सके, जिससे सर्जरी की विफलता हो सकती है। इसके अतिरिक्त, सफल सर्जरी के लिए एक उपयुक्त बल-लागू वसंत का चयन करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह प्रतिधारण की अंगूठी को गिरने से रोकने और इच्छित बल आवेदन को प्राप्त करने से रोकते हुए वसंत को स्थापित करना आसान बनाता है।

पिछले मॉडलों की तुलना में, यह मॉडल कई फायदे प्रदान करता है। सबसे पहले, यह पार्श्विका हड्डी में परिपत्र हड्डी दोषों के गठन को रोकता है, सेल सक्रियण मोड को संरक्षित करता है। इसके अलावा, वसंत को अलग करके किसी भी समय बल को हटाया जा सकता है, जिससे यह तनाव खींचने के बाद पुनरावृत्ति मॉडल स्थापित करने के लिए उपयुक्त हो जाता है। वसंत को अलग करने की सुविधा भी प्रयोगात्मक जानवरों को न्यूनतम माध्यमिक क्षति सुनिश्चित करती है। इसके अलावा, तन्यता तनाव के यांत्रिक परिमाण को वसंत बल को बदलकर आसानी से समायोजित किया जा सकता है। महत्वपूर्ण बात, इस मॉडल कपाल सिवनी के आसपास प्राकृतिक शारीरिक वातावरण को बनाए रखता है, इस प्रकार प्रयोगात्मक परिणामों की सटीकता सुनिश्चित करने.

हालाँकि, इस विस्तार मॉडल की कुछ सीमाएँ हैं। सबसे पहले, बल अत्यधिक होने पर प्रतिधारण अंगूठी गिरने का खतरा होता है। नौसिखियों को इस जोखिम को कम करने के लिए वसंत स्थापना में प्रारंभिक अभ्यास करना चाहिए। दूसरे, खोपड़ी को खोलने और खोपड़ी को उजागर करने पर संक्रमण का खतरा होता है, इसलिए उपकरण कीटाणुशोधन आवश्यक है, और सर्जरी की अवधि को छोटा करना उपचार के लिए फायदेमंद है। ओवर-एनेस्थीसिया से चूहों की मौत भी हो सकती है।

निष्क्रिय पेगासोस विधि के संबंध में, यह व्यक्तिगत ऊतकों और अंगों के साथ-साथ युवा चूहों के पूरे सिर और शरीर में पारदर्शिता प्राप्त करने के लिए लागू होता है। जबकि पूरे कैल्वरियल हड्डियों के लिए कुशल, बड़े नमूनों के लिए एक लंबे समय तक प्रसंस्करण समय की आवश्यकता होती है, विशेष रूप से पूरे हड्डी के ऊतकों या जोड़ों के साथ थोक लंबी हड्डी के ऊतकों के लिए। यह डबल लेबलिंग प्रोटोकॉल का उपयोग करते समय ऊतक decalcification आयोजित नहीं किया जाना चाहिए कि नोट करने के लिए महत्वपूर्ण है, के रूप में यह धुंधला प्रक्रिया के साथ हस्तक्षेप. पेगासोस ऊतक समाशोधन विधि भी लचीली है, जो विभिन्न लेबलिंग विधियों के साथ संयोजन की अनुमति देती है, जो ईडीयू निगमन या कैल्शियम डबल लेबलिंग तक सीमित नहीं है, बल्कि ट्रांसजेनिक माउस मॉडल या पूरे-माउंट डाई या एंटीबॉडी धुंधला में अंतर्जात प्रतिदीप्ति भी है, सभी अच्छी तरह से संरक्षित प्रतिदीप्ति के साथ।

स्थिर प्रभाव और उच्च दोहराव के साथ, यह सिवनी विस्तार मॉडल विभिन्न उम्र के ट्रांसजेनिक चूहों के विभिन्न उपभेदों के लिए उपयुक्त है। तन्यता तनाव की भयावहता को समायोजित करने और किसी भी समय बल वापस लेने की क्षमता तनाव उत्तेजना के बाद पुनरावृत्ति पर सुविधाजनक शोध को सक्षम बनाती है। पेगासोस ऊतक समाशोधन तकनीक के साथ खनिज हड्डियों की डबल लेबलिंग विधि के संयोजन से, हम हड्डी रीमॉडेलिंग के दौरान कपाल सिवनी स्टेम कोशिकाओं के त्रि-आयामी स्थानिक वितरण का निरीक्षण कर सकते हैं, जिससे एसयूएससी और यांत्रिक तनाव के बीच संबंधों की आगे की खोज को सक्षम किया जा सकता है, साथ ही साथ इसके विशिष्ट तंत्र भी।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम प्रयोगशाला मंच और कान संस्थान, शंघाई जियाओतोंग यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन की सहायता के लिए धन्यवाद करते हैं। यह काम शंघाई पुजियांग कार्यक्रम (22PJ1409200) द्वारा समर्थित किया गया था; चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (No.11932012); शंघाई नौवें पीपुल्स अस्पताल के पोस्टडॉक्टोरल साइंटिफिक रिसर्च फाउंडेशन, शंघाई जिओ टोंग यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन; शंघाई जिओ टोंग यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन (JYZZ154) से संबद्ध नौवें पीपुल्स अस्पताल के मौलिक अनुसंधान कार्यक्रम का वित्त पोषण।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
37% Acid etching Xihubiom E10-02/1807011
Alizarin red Sigma-Aldrich A3882
AUSTRALIAN WIRE A.J.WILCOCK 0.014''
Benzyl benzoate Sigma-Aldrich B6630
Calcein green Sigma-Aldrich C0875
Copper(II) sulfate, anhydrous Sangon Biotech A603008
Dynamometer Sanliang SF-10N
EDTA Sigma-Aldrich E9884
EdU Invitrogen E104152
Laser Confocal Microscope Leica SP8
PBS Sangon Biotech E607008
PEG-MMA 500 Sigma-Aldrich 447943
PFA Sigma-Aldrich P6148 
pH Meters Mettler Toledo S220
Quadrol Sigma-Aldrich 122262
Sodium Ascorbate Sigma-Aldrich A4034
Sodium bicarbonate Sangon Biotech A500873
Sodium chloride Sangon Biotech A610476
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich S5881
Spring TAOBAO 0.2*1.5*1*7
Sulfo-Cyanine3 azide Lumiprobe A1330
tert-Butanol Sigma-Aldrich 360538  Protect from light. Do not freeze.
Transbond MIP
Moisture Insensitive Primer		 3M Unitek 712-025
Transbond XT
Light Cure Adhesive Paste		 3M Unitek 712-035
Triethanolamine Sigma-Aldrich V900257
Tris-buffered saline Sangon Biotech A500027

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Opperman, L. A. Cranial sutures as intramembranous bone growth sites. Developmental Dynamics. 219 (4), 472-485 (2000).
  2. Thenier-Villa, J. L., Sanromán-Álvarez, P., Miranda-Lloret, P., Plaza Ramírez, M. E. Incomplete reossification after craniosynostosis surgery-incidence and analysis of risk factors: a clinical-radiological assessment study. Journal Of Neurosurgery-pediatrics. 22 (2), 120-127 (2018).
  3. Markiewicz, M. R., Recker, M. J., Reynolds, R. M. Management of sagittal and lambdoid craniosynostosis: open cranial vault expansion and remodeling. Oral And Maxillofacial Surgery Clinics Of North America. 34 (3), 395-419 (2022).
  4. Mao, J. J., Wang, X., Kopher, R. A. Biomechanics of craniofacial sutures: orthopedic implications. Angle Orthodontist. 73 (2), 128-135 (2003).
  5. Shayani, A., Sandoval Vidal, P., Garay Carrasco, I., Merino Gerlach, M. Midpalatal suture maturation method for the assessment of maturation before maxillary expansion: a systematic review. Diagnostics (Basel). 12 (11), 2774 (2022).
  6. Suzuki, H., et al. Miniscrew-assisted rapid palatal expander (MARPE): the quest for pure orthopedic movement. Dental Press Journal Of Orthodontics. 21 (4), 17-23 (2016).
  7. Yu, M., et al. Cranial suture regeneration mitigates skull and neurocognitive defects in craniosynostosis. Cell. 184 (1), 243-256 (2021).
  8. Roth, D. M., Souter, K., Graf, D. Craniofacial sutures: Signaling centres integrating mechanosensation, cell signaling, and cell differentiation. European Journal of Cell Biology. 101 (3), 151258 (2022).
  9. Zhao, H., et al. The suture provides a niche for mesenchymal stem cells of craniofacial bones. Nature Cell Biology. 17 (4), 386-396 (2015).
  10. Jing, D., et al. Response of Gli1(+) suture stem cells to mechanical force upon suture expansion. Journal of Bone And Mineral Research. 37 (7), 1307-1320 (2022).
  11. Xu, Y., Malladi, P., Chiou, M., Longaker, M. T. Isolation and characterization of posterofrontal/sagittal suture mesenchymal cells in vitro. Plastic and Reconstructive Surgery. 119 (3), 819-829 (2007).
  12. Kong, L., et al. Isolation and characterization of human suture mesenchymal stem cells in vitro. International Journal of Stem Cells. 13 (3), 377-385 (2020).
  13. Ikegame, M., et al. Tensile stress induces bone morphogenetic protein 4 in preosteoblastic and fibroblastic cells, which later differentiate into osteoblasts leading to osteogenesis in the mouse calvariae in organ culture. Journal of Bone And Mineral Research. 16 (1), 24-32 (2001).
  14. Liu, S. S., Opperman, L. A., Buschang, P. H. Effects of recombinant human bone morphogenetic protein-2 on midsagittal sutural bone formation during expansion. American Journal of Orthodontics And Dentofacialorthopedics. 136 (6), 768-769 (2009).
  15. Liang, W., Ding, P., Li, G., Lu, E., Zhao, Z. Hydroxyapatite nanoparticles facilitate osteoblast differentiation and bone formation within sagittal suture during expansion in rats. Drug Design Development and Therapy. 15, 905-917 (2021).
  16. Morinobu, M., et al. Osteopontin expression in osteoblasts and osteocytes during bone formation under mechanical stress in the calvarial suture in vivo. Journal of Bone And Mineral Research. 18 (9), 1706-1715 (2003).
  17. Hwang, S., Chung, C. J., Choi, Y. J., Kim, T., Kim, K. H. The effect of cetirizine, a histamine 1 receptor antagonist, on bone remodeling after calvarial suture expansion. Korean Journal of Orthodontics. 50 (1), 42-51 (2020).
  18. Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).
  19. Jing, D., et al. Tissue clearing and its application to bone and dental tissues. Journal of Dental Research. 98 (6), 621-631 (2019).
  20. Luo, W., et al. Investigation of postnatal craniofacial bone development with tissue clearing-based three-dimensional imaging. Stem Cells Development. 28 (19), 1310-1321 (2019).

Tags

3-डी विज़ुअलाइज़ेशन तकनीक बोन रीमॉडेलिंग सिवनी विस्तार क्रैनियोफेशियल टांके कैल्वरियल बोन ग्रोथ मेसेनकाइमल स्टेम सेल ऑस्टियोप्रोजेनिटर्स आर्थोपेडिक थेरेपी स्प्रिंग-असिस्टेड क्रैनियल वॉल्ट एक्सपैंशन रैपिड मैक्सिलरी एक्सपैंशन मैक्सिलरी प्रोट्रैक्शन सिवनी स्टेम सेल शारीरिक परिवर्तन सेक्शनिंग तरीके धनु दिशा पेगासोस ऊतक समाशोधन विधि होल-माउंट ईडीयू धुंधला कैल्शियम चेलेटिंग डबल लेबलिंग प्रोलिफेरेटिंग सेल नई हड्डी गठन
एक सिवनी विस्तार माउस मॉडल में हड्डी रीमॉडेलिंग के लिए एक 3-डी दृश्य तकनीक
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ding, Z., Li, R., Duan, Y., Li, Z.,… More

Ding, Z., Li, R., Duan, Y., Li, Z., Fang, B., Jing, D. A 3-D Visualization Technique for Bone Remodeling in a Suture Expansion Mouse Model. J. Vis. Exp. (198), e65709, doi:10.3791/65709 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter