Summary
Este protocolo apresenta um modelo padronizado de flexão de sutura em camundongo e um método de visualização 3D para estudar as alterações mecanobiológicas da sutura e remodelação óssea sob carga de força de tração.
Abstract
As suturas craniofaciais desempenham um papel crucial além de serem articulações fibrosas conectando ossos craniofaciais; Eles também servem como nicho primário para o crescimento ósseo da calota e da face, abrigando células-tronco mesenquimais e osteoprogenitores. Como a maioria dos ossos craniofaciais se desenvolve através da ossificação intramembranosa, as regiões marginais das suturas atuam como pontos de iniciação. Devido a essa importância, essas suturas tornaram-se alvos intrigantes em terapias ortopédicas como expansão de abóbada craniana assistida por mola, expansão rápida da maxila e protração maxilar. Sob a força do traçado ortopédico, as células-tronco de sutura são rapidamente ativadas, tornando-se uma fonte dinâmica para a remodelação óssea durante a expansão. Apesar de sua importância, as alterações fisiológicas durante os períodos de remodelação óssea permanecem pouco compreendidas. Os métodos tradicionais de seccionamento, principalmente no sentido sagital, não captam as mudanças abrangentes que ocorrem ao longo de toda a sutura. Este estudo estabeleceu um modelo padrão de camundongo para expansão da sutura sagital. Para visualizar completamente as alterações da remodelação óssea após a expansão da sutura, o método de limpeza tecidual PEGASOS foi combinado com coloração de EdU de montagem total e dupla marcação quelante de cálcio. Isso permitiu a visualização de células altamente proliferantes e nova formação óssea em todo o osso da calota craniana após a expansão. Este protocolo oferece um modelo padronizado de mouse expansor de sutura e um método de visualização 3D, esclarecendo as mudanças mecanobiológicas nas suturas e na remodelação óssea sob carga de força de tração.
Introduction
As suturas craniofaciais são tecidos fibrosos que conectam os ossos craniofaciais e desempenham papéis essenciais no crescimento e remodelação dos ossos craniofaciais. A estrutura da sutura assemelha-se a um rio, proporcionando um fluxo de recursos celulares para nutrir e construir a "margem do rio", conhecidas como frentes osteogênicas, que contribuem para a formação dos ossos craniofaciais via osteogênese intramembranosa1.
O interesse em suturas craniofaciais tem sido impulsionado pela necessidade clínica de entender o fechamento prematuro de suturas cranianas e a disfunção da sutura facial, que podem levar a deformidades craniofaciais e até mesmo condições com risco de vida em crianças. A suturectomia aberta é rotineiramente utilizada no tratamento clínico, mas o seguimento em longo prazo tem mostrado recorrência incompleta da reossificação em alguns pacientes2. A craniotomia minimamente invasiva assistida por molas expansoras ou craniectomia endoscópica por listras pode proporcionar uma abordagem mais segura para preservar a sutura potencial em vez de descartar os tecidos3. Da mesma forma, terapias ortopédicas como máscaras faciais e expansores têm sido amplamente utilizadas no tratamento da hipoplasia sagital ou horizontal da maxila, com alguns estudos ampliando a limitação de idade para tratar pacientes adultos por meio de expansores palatinos assistidos por mini-parafuso4,5,6. Além disso, a regeneração da sutura craniana com células-tronco mesenquimais (CTMs) combinada com materiais biodegradáveis é uma terapia potencial no futuro, oferecendo uma nova direção para o tratamento de doençasrelacionadas7. No entanto, o processo de função ou mecanismo regulatório das suturas permanece indefinido.
A remodelação óssea consiste principalmente em um equilíbrio entre a formação óssea conduzida por osteoblastos e a reabsorção óssea conduzida por osteoclastos, onde a diferenciação osteogênica de células-tronco estimuladas por sinais mecânicos desempenha um papel importante. Após décadas de pesquisa, verificou-se que as suturas craniofaciais são nichos de células-tronco mesenquimais altamenteplásticas8. As células-tronco de sutura (SuSCs) são um grupo heterogêneo de células-tronco, pertencentes às células-tronco mesenquimais (CTMs) ou células-tronco ósseas (CTEs). SuSCs são marcados in vivo por quatro marcadores, incluindo Gli1, Axin2, Prrx1 e Ctsk. SuSCs Gli1+ , em particular, têm verificado rigorosamente as características biológicas de células-tronco, não apenas exibindo alta expressão de marcadores típicos de CTM, mas também demonstrando excelente potencial osteogênico e condrogênico9. Pesquisas anteriores mostraram que as SuSCs Gli1+ contribuem ativamente para a formação de novos ossos sob força de tração, identificando-os como a fonte de células-tronco de sutura que suportam a distração osteogênica10.
No passado, extensas características mecânicas de células-tronco foram estudadas in vitro via Flexcell, flexão de quatro pontos, sistema de carregamento de microímãs, entre outros. Embora células mesenquimais derivadas da sutura craniana de camundongos tenham sido identificadas in vitro11 e células-tronco mesenquimais de sutura humana também tenham sido isoladas recentemente12, a resposta biomecânica das células de sutura permanece obscura no sistema in vitro. Para investigar melhor o processo de remodelação óssea, um modelo de expansão de sutura baseado em cultura de órgãos isolados da calvária foi estabelecido, abrindo caminho para o estabelecimento de um modelo útil de expansão de sutura in vivo 1,13. Coelhos14 e ratos15 têm sido os animais mais utilizados em pesquisa básica para expansão de sutura. No entanto, camundongos são modelos animais preferidos para explorar doenças humanas devido ao seu genoma altamente homólogo com humanos, numerosas linhas de modificação gênica e forte capacidade de hibridização reprodutiva. Os modelos existentes de expansão de sutura craniana em camundongos tipicamente dependem de fios de mola ortodôntica de aço inoxidável para aplicar força de tração na sutura sagital16,17. Nesses modelos, são feitos dois orifícios em cada lado dos ossos parietais para fixar o dispositivo de expansão, e os fios são embutidos sob a pele, o que pode afetar o modo de ativação celular.
Em relação ao método de visualização, a observação bidimensional de cortes no sentido sagital tem sido geralmente adotada há décadas. Entretanto, considerando que a remodelação óssea é um processo dinâmico tridimensional complexo, a obtenção de informações tridimensionais completas tornou-se uma necessidade urgente. A técnica de transparência tecidual PEGASOS surgiu para atender a esse requisito18,19. Oferece vantagens únicas pela transparência dos tecidos duros e moles, permitindo que todo o processo de remodelação óssea seja reproduzido no espaço tridimensional.
Para obter uma compreensão mais profunda e abrangente das alterações fisiológicas nos períodos de remodelação óssea, foi estabelecido um modelo padrão de camundongo expansor de sutura sagital com fixação de mola entre os suportesartesanais10. Com um procedimento padronizado de condicionamento ácido e colagem, o dispositivo expansor poderia ser firmemente colado ao osso craniano, gerando uma força de tração perpendicular à sutura sagital. Além disso, o método PEGASOS tissue clearing foi aplicado após dupla marcação do osso mineralizado pós-expansão para visualizar completamente as mudanças na modelagem óssea após a expansão da sutura.
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Protocol
Todos os procedimentos experimentais descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de Cuidados com Animais do Shanghai Nono People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (SH9H-2023-A616-SB). Camundongos C57BL/6 machos com 4 semanas de idade foram usados neste estudo. Todos os instrumentais utilizados foram esterilizados previamente ao procedimento.
1. Preparo do modelo de expansão da sutura
- Preparação de dois detentores de retenção.
- Use fio australiano de 0,014'' ou fio de aço inoxidável (consulte Tabela de Materiais) para fazer um laço helicoidal com alicates de fio leve. O diâmetro da alça é de 2 mm, e a cauda de 1 mm é reservada em dois lados (Figura 1A).
- Esterilize os fios e suportes para a cirurgia em autoclave, esterilizador a plasma ou esterilizante frio adequado (por exemplo, glutaraldeído).
- Preparo das nascentes.
- Prepare molas personalizadas em aço inoxidável.
OBS: A mola de pressão com fio de 0,2 mm de diâmetro, 1,5 mm de diâmetro externo, 1 mm de intervalo de espaço e 7 mm de comprimento é utilizada neste estudo (Figura 1B). Cada compressão de mola de 1 mm obteve um empuxo de cerca de 30 g. - Corte a mola em um comprimento disponível antes de definir. Confirme a força para a mola especializada antes do experimento.
NOTA: Os tamanhos das molas são variados, desde que a magnitude da força seja a mesma em experimentos paralelos. A força é medida por um instrumento de teste uniaxial de mesa ou um pequeno dinamômetro eletrônico (ver Tabela de Materiais) se a condição for limitada. A mudança de comprimento é avaliada de acordo com a magnitude da força (Figura 1C-E). Notavelmente, é necessário alterar o valor de carregamento da força da mola com base na idade, na condição óssea do camundongo e nos objetos de pesquisa. - Prepare um fio australiano reto ou um fio de aço reto de 7 mm de comprimento e faça dois pedaços de papel com 2 mm de diâmetro para usar como barreiras (Figura 1F).
- Prepare molas personalizadas em aço inoxidável.
2. Cirurgia de expansão da sutura sagital
- Anestesização: Anestesiar os camundongos com tiletamina (25 mg/kg), zolazepam (25 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg). Ao mesmo tempo, aplique pomada oftálmica estéril nos olhos para evitar o ressecamento das córneas. Julgue a profundidade da anestesia dos ratos através de uma pinça no dedo do pé.
NOTA: As seguintes características indicam que o rato está anestesiado corretamente: respiração lenta e constante, fraqueza dos membros, relaxamento muscular, desaparecimento do reflexo de acupuntura cutânea e reflexo palpebral, bem como reflexo corneano mais fraco. - Depilação e desinfecção: Retire cuidadosamente os pelos no topo da cabeça com creme de depilação; Evite tocar nos olhos. Logo após, utilizar rodadas alternadas de iodóforo e álcool a 75% para desinfetar o sítio cirúrgico. Administrar meloxicam (1 mg/kg) como analgesia aos camundongos por injeção subcutânea.
- Fixação da posição corporal: Coloque o mouse deitado na frente e use fitas cirúrgicas para fixar os membros na mesa cirúrgica.
- Retalho aberto do couro cabeludo: Use tesoura cirúrgica para realizar um retalho arqueado ao longo do couro cabeludo próximo ao pescoço do rato, expondo totalmente a sutura sagital e o crânio circundante. Em seguida, fixar o retalho de couro cabeludo com sutura 6-0 na mesa cirúrgica.
- Amarre os suportes de retenção após a corrosão ácida.
- Secar o crânio e condicioná-lo com ácido fosfórico a 37% por 20 s e usar soro fisiológico para limpar o condicionamento ácido (Figura 2A). Um resíduo de giz será evidente após a secagem do crânio com o bulbo da pipeta de borracha.
- Cimiciar os dois suportes (preparados no passo 1.1) em ambos os lados dos ossos parietais a 3 mm das suturas sagitais com um adesivo fotopolimerizável (Figura 2B).
- Redefinir o retalho do couro cabeludo.
- Recolocar manualmente o retalho de couro cabeludo (Figura 2C). Rotular a posição dos suportes, cortar dois pequenos orifícios no couro cabeludo na posição correspondente dos suportes de retenção bilaterais e, em seguida, redefinir o couro cabeludo batido.
- Ao mesmo tempo, passe as pequenas alças pelos orifícios para expor a superfície da pele. Sutura da incisão curva com sutura 6-0 (Figura 2D). Um a três dias são permitidos para a recuperação da pele. Administrar meloxicam (1 mg/kg) aos ratinhos por injeção subcutânea a cada 24 h durante 1 a 3 dias.
NOTA: Após a cirurgia, verifique diariamente a atividade do couro cabeludo do rato e se os suportes caem. Existem vários tipos de pele na questão de cor e espessura; O couro cabeludo saudável manterá a cor original e as bordas da pele se fundirão gradualmente após a sutura. Se for encontrada uma infecção do couro cabeludo, ou se o dispositivo cirúrgico tiver caído, remova o camundongo do estudo e eutanasie-o.
- Instale a mola e o fio-guia.
- Corte a mola 1 mm a mais do que a distância entre os dois suportes.
- Comprimir a mola de pressão selecionada e colocá-la entre as pequenas bobinas de ambos os lados.
- Passe o fio de aço inoxidável através das pequenas bobinas e da mola, e solte a mola para obter um impulso inicial de cerca de 30 g.
- Verifique se o couro cabeludo sob a área da mola do mouse está sem qualquer compressão.
- Após confirmar que a colagem é firme, sem folga, cole dois pedaços de papel entre a mola e os suportes com um adesivo fotopolimerizável, a fim de estabelecer barreiras em ambas as extremidades da mola (Figura 2E,F).
3. Dupla marcação de ossos mineralizados
- Preparação da solução-mãe.
- Preparar uma solução de diluição com água destilada que contenha NaCl a 0,9% e NaHCO3 a 2%.
- Utilizar a solução diluente para preparar 20 mg/ml de complexo de alizarina di-hidratado e 10 mg/ml de calceína (ver Tabela de Materiais).
- Ajuste o pH para 7,4 usando um dispositivo de medição de pH. Limpe a sonda de pH entre as medições para garantir leituras precisas.
- Coloque o corante em um recipiente estéril e guarde-o em geladeira a 4 °C; A folha é usada para manter a luz apagada.
- Prepare a solução de trabalho. Antes da injeção, diluir a solução-mãe a 1 mg/ml para cálcio e 2 mg/ml para complexo de alizarina di-hidratado utilizando uma solução de dissolução.
- Injetar intraperitonealmente 5 mg/kg de verde de calceína e 20 mg/kg de vermelho de alizarina em dois pontos de tempo para marcar os ossos mineralizados e analisar as mudanças entre dois tempos. Geralmente, coletar as amostras 12-14 h após a injeção.
NOTA: Aqueça os corantes antes da injeção e certifique-se de que o tempo de injeção não é inferior a 3 minutos. O intervalo de injeção depende do tempo de expansão. Neste estudo, o vermelho de alizarina e o verde de calceína foram injetados durante a noite (O/N) antes da expansão e O/N antes da coleta, respectivamente. - Coletar ossos inteiros da calota craniana preparados para o procedimento de limpeza de tecidos um dia após a segunda injeção.
4. Coloração de EdU
- Injeção intraperitoneal: Injetar EdU 2 h por via intraperitoneal antes da eutanásia dos camundongos (seguindo protocolos aprovados institucionalmente). A dose é de 1 mg/10 g de peso corporal.
- Preparação do cocktail de rotulagem: Misturar solução salina tamponada com Tris (100 mmol/L final, pH 7,6), CuSO4 (4 mmol/L final), Sulfo-Cyanine 3 Azide (2-5 μmol/L final) e Ascorbato de Sódio (100 mmol/L final, fresco a cada uso) (ver Tabela de Materiais).
- Coloração de montagem total de EdU: Após a etapa de descoloração do tecido no método PEGASOS de limpeza de tecido (passo 7), colocar as amostras no coquetel de rotulagem por 1 dia à temperatura ambiente (TR).
5. Microtomografia computadorizada
- Fixação e armazenamento tecidual: Fixar os ossos da calota craniana em paraformaldeído (PFA) a 4% a 4 °C O/N e armazená-los em PFA 0,5% antes da varredura.
- Escaneamento e análise: Digitalizar as amostras com um sistema de imagem de microtomografia computadorizada (μCT) com alta resolução e um tamanho de voxel de 7 μm.
6. Preparação da solução de trabalho para limpeza de tecidos PEGASOS
- Poliformaldeído (PFA) a 4%: Dissolver 4 g de pó de PFA em 1× PBS para 100 mL.
- Solução de perfusão cardíaca: heparina a 0,02%, ou seja, 20 mg de heparina em pó dissolvido em 1× PBS a 100 mL; alternativamente, utilizar EDTA 0,05 mol/L, ou seja, 0,05 mol de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) (ver Tabela de Materiais), dissolvido em solução aquosa deionizada para um volume total de 1 L.
- Solução de descalcificação: EDTA 0,5 mol/L, ou seja, 0,5 mol de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), dissolvido em solução aquosa deionizada para um volume total de 1 L.
- Solução de descoloração: 25% Quadrol, que é 250 mL de Quadrol (N, N, N', N' - Tetrakis (2-Hidroxipropil) etilenodiamina) (ver Tabela de Materiais) dissolvido em água deionizada para um volume total de 1 L.
NOTA: Devido à viscosidade do Quadrol, ele pode ser aquecido a 60 °C para aumentar sua fluidez antes da configuração. - Solução desengordurante: 30%, 50%, 70% terc-Butanol (tB) (ver Tabela de Materiais), preparada com água por fração volumétrica.
OBS: Considerando que a tB pura é cristalina à temperatura ambiente, ela deve ser aquecida a 60 °C até se dissolver antes de poder ser utilizada. Posteriormente, 3% a 5% (v/v) de trietanolamina (TEA) é adicionada para regular o pH da solução >9,5. - Solução de desidratação: solução TB-PEG, 70% tB + 27% PEG-MMA + 3% Quadrol (v/v), em que PEG-MMA é poli (etilenoglicol) metacrilato de éter metílico com peso molecular médio de 500 (Poli (etilenoglicol) Metacrilato 500, PEG-MMA 500) (ver Tabela de Materiais).
- Solução transparente: BB-PEG solução, 75% BB + 22% PEG-MMA + 3% Quadrol (v/v), em que BB é benzoato de benzila (BB).
7. Transparência dos ossos da calota craniana com o método PEGASOS
- Anestesiar o camundongo por injeção intraperitoneal de anestésicos (passo 2.1) e julgar a profundidade da anestesia do camundongo através da reação de pinça para garantir que não haja reação de resistência antes da perfusão cardíaca.
- Realizar perfusão e fixação cardíaca.
- Segure o abdome do mouse para cima, fixe os membros com fita adesiva e corte cuidadosamente ao longo da circunferência do tórax para expô-lo completamente.
- Imediatamente após fazer um pequeno corte no átrio direito com tesoura oftálmica, inserir uma agulha de perfusão 22G no ápice do ventrículo esquerdo.
NOTA: Apenas a ponta da agulha é inserida para evitar danificar a válvula cardíaca através da inserção excessiva. Caso contrário, o líquido de perfusão cardíaca entrará na circulação pulmonar, afetando o efeito de perfusão da circulação sistêmica. - Empurrar o líquido de perfusão cardíaca de 30-50 mL (passo 6.2) na seringa. Pode-se ver que o fígado gradualmente fica pálido de vermelho brilhante.
- Depois que o fluido de saída do átrio direito ficar completamente claro, infundir solução de PFA a 4% em igual volume. A operação de perfusão do PFA é conduzida em um capô ventilado.
- Separar e separar os tecidos e órgãos e fixá-los durante a noite com PFA a 4% a 4 °C.
- Descalcificação tecidual: Para amostras processadas pela coloração de EdU, colocar o tecido duro fixado em solução de EDTA 0,5 mol/L (pH 7,0) (10 mL) em uma mesa de agitação a 37 °C por cerca de 2 dias e trocar o líquido diariamente.
NOTA: Ignore o processo de descalcificação no método PEGASOS normalizado para ossos marcados com agente quelante de cálcio para preservar totalmente a sinalização. A descalcificação é necessária para tratar os ossos para visualizar a fluorescência endógena ou sinais imunomarcados de montagem total. - Descoloração tecidual: Colocar os ossos da calvária fixados em solução de Quadrol a 25% (20 mL) em uma mesa de agitação a 37 °C por 1 dia, e trocar o líquido uma vez.
NOTA: O tempo de descoloração está relacionado com o conteúdo de heme no tecido. Observe a cor do líquido de tratamento, pois a profundidade de cor representa a necessidade de continuar o tratamento de reposição de fluidos. - Coloração de EdU: Enxaguar as amostras em 1× PBS por 5 min (três vezes) e, em seguida, mergulhá-las no coquetel de rotulagem por 1 dia. Depois disso, enxágue as amostras em 1× PBS por 1 h (três vezes).
- Desengorduramento e desidratação de tecidos
- Colocar os tecidos em soluções de 30% tB, 50% tB e 70% tB em sequência para realizar a diminuição do gradiente em uma mesa de agitação a 37 °C. Coloque em cada concentração por cerca de 2 h.
- Em seguida, desidratar as amostras em solução de TB-PEG durante 6 h numa mesa de agitação a 37 °C.
NOTA: O tempo de processamento acima pode ser aumentado ou diminuído dependendo do número do tecido.
- Transparência do tecido: Colocar o tecido completamente desidratado em solução de BB-PEG em uma mesa de agitação a 37 °C (2-4 h) até ficar transparente. Atualmente, as amostras podem ser armazenadas por até 1-2 anos.
NOTA: Após a limpeza quase total, abra a tampa do tubo para expor as amostras e o meio ao ar com agitação melhorará ainda mais a transparência. Este método é adequado para melhorar a transparência de tecidos e órgãos individuais, bem como toda a cabeça e corpo de ratos jovens. No entanto, para a transparência de todo o corpo de camundongos adultos, as etapas acima devem ser realizadas usando um método de perfusão de ciclo completo.
8. Exames por imagem
OBS: A microscopia confocal foi utilizada para visualização 3D dos tecidos transparentes neste estudo. A microscopia óptica também é apropriada para este protocolo. Vários sistemas operacionais foram verificados como disponíveis antes. Aqui, um sistema operacional de microscópio confocal a laser é tomado como exemplo (veja Tabela de Materiais).
- De acordo com o manual do usuário, siga os passos corretos para abrir a interface de operação confocal a laser e LAS AF. Ligue o laser necessário em diferentes canais de disparo e ajuste a potência. Defina o caminho óptico e o comprimento de onda correspondente, 561 nm para o vermelho Alizarin e 488 nm para o verde Calcein, qualquer um dos quais é usado para o sinal EdU de acordo com o coquetel de rotulagem.
- Coloque as amostras transparentes na placa de Petri de vidro côncavo que pode transportar amostras espessas, caixas de incorporação ou dispositivos de colocação feitos por conta própria, como cola impermeável para imergir as amostras transparentes em um líquido transparente.
- Selecione uma lente objetiva de baixo consumo de energia para localizar rapidamente a amostra. Faça uma visão geral de todo o tecido da calota craniana com a função de varredura rápida e encontre a área de interesse para exames de imagem.
- Defina a potência de saída, selecione o modo de digitalização e primeiro ajuste os coeficientes de disparo (resolução, velocidade de digitalização, fator de zoom, qualidade da imagem, ruído de fundo médio, etc.).
NOTA: Geralmente, o Smart Gain varia de 500 a 800 (mudança de sinal e ruído); O Smart Offset é o mais próximo possível de 0, garantindo a qualidade da imagem (para reduzir o ruído de fundo). Quando o ganho de PMT é maior que 800, ou o ganho de HyD é maior que 100%, e o brilho ainda é insuficiente, a intensidade do laser pode ser adequadamente aumentada, mas em princípio, quanto menor, melhor. - Defina a distância axial Z e o passo Z, que é perfurado a partir do lado mais raso da organização transparente; ou seja, definir os lados mais profundos e rasos.
NOTA: Confirme a classificação e a distância de trabalho para cada lente. Ajuste cuidadosamente a faixa Z e não opere a distância de trabalho excedendo o limite da lente selecionada. O "z-Galvo" pode ser selecionado quando a regulamentação de multa é necessária. - Defina os parâmetros de disparo novamente e comece a fotografar. Após a conclusão, mescle e processe as imagens através do módulo multifuncional. Por fim, guarde e desligue o instrumento na ordem indicada.
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Representative Results
Com esse protocolo, foi estabelecido um modelo de camundongo para expansão da sutura sagital (Figura 1-2). Para a visualização em 3D das mudanças na modelagem óssea após a expansão da sutura, o método PEGASOS tissue clearing foi aplicado em todo o osso da calota craniana após a expansão. Após a perfusão, os ossos da calota craniana foram separados (Figura 3A) e o processo PEGASOS adequado foi continuado (Tabela 1 e Tabela 2). Notavelmente, os ossos da calota craniana tornaram-se quase transparentes após o processo completo do PEGASOS, independentemente da descalcificação (Figura 3B,C).
Para visualizar rapidamente as alterações após a expansão, utilizou-se μCT nas amostras coletadas e fixadas. Em comparação com o grupo controle (Figura 4A), a sutura craniana expandiu-se gradual e significativamente após a aplicação de força por 1 dia (Figura 4B). No quinto dia, surgiram protuberâncias ósseas fofas na borda óssea (Figura 4C).
Para a visualização tridimensional da taxa de justaposição de mineralização em toda a sutura após expansão, foi empregado o método de dupla marcação e a eficiente técnica PEGASOS, mesmo em ossos da calota craniana não descalcificados (Figura 5). Em condições fisiológicas, houve pequenas alterações entre os sinais de marcação pré-pós (Figura 5A), enquanto a carga de força ativou significativamente a osteogênese. O padrão em zigue-zague do osso recém-mineralizado, marcado com um único marcador amarelo-esverdeado de cálcio, alargou-se após expansão por 7 dias (Figura 5B,C). Na visualização tridimensional de alta resolução, as mudanças no padrão dos ossos marginais indicaram o processo de remodelação óssea após a expansão da sutura, e o grau de osso neoformado variou nos dois lados das suturas (Figura 5C).
Além disso, para visualizar a taxa de proliferação das células após a expansão da sutura, tentou-se a incorporação de EdU de montagem total usando o método de limpeza tecidual PEGASOS com um processo de calcificação. Com sucesso, a marcação foi eficiente e bem preservada nos tecidos clareados. No grupo controle, várias células EdU+ estavam difusamente distribuídas ao longo das suturas (Figura 6A), o que pode ser importante para a remodelação óssea fisiológica e possivelmente negligenciado no corte 2D. Ao se expandirem por 1 dia, as células proliferantes atingiram o pico no meio e nas bordas das suturas (Figura 6B). À medida que a sutura aumentava, o número de células em proliferação diminuía ao longo do tempo, chegando ao 7º dia (Figura 6C). As células destacadas eram pequenas células redondas na medula óssea, indicativas de células sanguíneas, que diferiam das células de sutura EdU+ (Figura 6C).
Figura 1: Foram preparados materiais vitais para a cirurgia. Os suportes de retenção foram confeccionados com fio de aço inoxidável. Seus diâmetros eram de 2 mm, e caudas de 1 mm eram reservadas em dois lados (A). Foi aplicada mola de pressão com fio de 0,2 mm de diâmetro, 1,5 mm de diâmetro externo e 1 mm de intervalo de intervalo (B). A força de tração foi detectada por um dinamômetro (C,D). Cada compressão de mola de 1 mm obteve um empuxo de cerca de 30 g (E) neste experimento. Pedaços de papel foram cortados em forma de pipas com 2 mm de diâmetro para serem utilizadas como barreiras (F). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Processo cirúrgico para sutura modelo de camundongo expansivo. Após a inversão do retalho de calvária, foi realizada a condicionante ácida (A) e a colagem (B) na posição em que os suportes de retenção ficariam expostos. Após a reposição do retalho de couro cabeludo (C), os suportes foram expostos na posição marcada (D). Uma mola foi fixada entre dois suportes para exercer força expansiva sobre a sutura da calvária, e dois pedaços de papel foram fixados em ambas as extremidades da mola como barreiras (E,F) após a confirmação de que os suportes estavam firmemente ligados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: O PEGASOS foi aplicado em dois ossos da calota craniana com ou sem descalcificação. Após a perfusão, os ossos da calota craniana foram separados, com alguns corados de sangue e tecidos moles aderidos (A). Os ossos da calota craniana que sofreram o processo de descalcificação (B) ou com não descalcificação (C) tornaram-se quase completamente transparentes após todo o processo de PEGASOS. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: As suturas da calota craniana expandiram-se gradualmente após o esforço da força de tração. Imagens de μCT de sutura sagital sem carga de força (A) e após carga de força por 1 dia e 5 dias (B,C). Barra de escala: 100 μm. Exp = expansão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Osteogênese ativada após expansão da sutura em imagens 3D. (A-C) Visualização tridimensional de pontos sagitais duplamente marcados desobstruídos pelo método PEGASOS. O vermelho de alizarina e o verde de calceína foram injetados intraperitonealmente durante a noite antes da expansão e antes da eutanásia após a expansão por 7 dias (B,C), respectivamente, em comparação com o grupo controle sem carga mecânica nos mesmos momentos (A). A lente de 5x foi usada para adquirir as imagens de sutura completa de forma eficiente (A,B), e a imagem da caixa em (B) foi ampliada em (C, C', C'') fotografada com uma lente de 10x. Barra de escala em A,B: 100 μm, C: 150 μm. Exp = expansão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Células de sutura altamente proliferadas após o carregamento com força de tração em imagens 3D. Os ensaios de incorporação de montagem total combinados com o método de limpeza tecidual PEGASOS mostraram as células em proliferação em toda a sutura quando em silêncio (A) ou após carga forçada por 1 dia e 7 dias (B,C). Imagem com uma lente de 10x. As linhas de traço delineiam duas bordas para suturas sagitais. Barra de escala: 100 μm. Exp = expansão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Processos | Soluções | Tempo & Temperatura |
| 1. Injeção intraperitoneal | 1 mg/10 g de EdU | 2 h antes da eutanásia dos ratos |
| 2. Perfusão | 0,02% Heparina & 0,05 mol/L EDTA | / |
| 3. Fixação | 4% PFA | O/N, 4 °C |
| 4. Descalcificação | 10% EDTA | 2 dias, 37 °C |
| 5. Descoloração | 25% Quadrol | 1 dia, 37 °C |
| 6. Coloração de EdU | coquetel de rotulagem | 1 dia, RT |
| 7. Desengorduramento | 30% terc-Butanol | 2 h, 37 °C |
| 50% terc-butanol | 2 h, 37 °C | |
| 70% terc-butanol | 2 h, 37 °C | |
| 8. Desidratação | Solução TB-PEG | 3 h*2, 37 °C |
| 9. Compensação | Solução BB-PEG | 2 h, 37 °C |
Tabela 1: Procedimento de limpeza tecidual PEGASOS para ossos da calota craniana com coloração de EdU.
| Processos | Soluções | Tempo & Temperatura |
| 1. Injeção intraperitoneal | 20 mg/kg de alizarina vermelha | durante a noite antes da expansão |
| 2. Injeção intraperitoneal | 5 mg/kg de calceina | durante a noite antes da coleta |
| 3. Perfusão | 0,02% Heparina & 0,05 mol/L EDTA | / |
| 4. Fixação | 4% PFA | O/N, 4 °C |
| 5. Descoloração | 25% Quadrol | 1 dia, 37 °C |
Tabela 2: Procedimento de limpeza tecidual PEGASOS para ossos da calota craniana com dupla marcação de ossos mineralizados por verde de calceína e vermelho de alizarina.
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Discussion
Aplicamos um modelo padrão de camundongo expansor de sutura para observar as mudanças morfológicas regulares que ocorrem a cada semana durante todo o ciclo de remodelação de um mês10. Este modelo é útil para pesquisar a remodelação e regeneração óssea da calota craniana através da expansão de suturas de calvárias, bem como para estudar várias células de sutura in vivo. Para apresentar os resultados desta pesquisa, é necessária a visualização tridimensional dos tecidos corados. Portanto, a tecnologia PEGASOS, conhecida por sua eficiência na limpeza de tecidos duros19,20, foi combinada com dupla marcação e coloração de EdU para revelar taxas de mineralização expandidas e proliferação de células durante o processo de expansão.
Em relação à cirurgia de expansão da sutura, um dos passos fundamentais é a colagem do anel de retenção. Para garantir uma ligação firme com a superfície óssea, padronizamos o processo de condicionamento ácido e colagem na parte inferior do anel retentor. As pequenas alças no anel retentor devem ser perpendiculares à superfície óssea e corresponder a pequenos orifícios no couro cabeludo. Após a sutura do couro cabeludo, as pequenas alças devem ser expostas à superfície da pele através de pequenos orifícios em estado natural e equilibrado para evitar o colapso do anel de retenção durante a instalação da mola de aplicação forçada e do fio-guia, o que poderia levar ao insucesso da cirurgia. Além disso, a seleção de uma mola de aplicação de força adequada é vital para o sucesso da cirurgia, pois facilita a instalação da mola, evitando que o anel de retenção caia e alcance a aplicação de força pretendida.
Em comparação com os modelos anteriores, este modelo oferece várias vantagens. Em primeiro lugar, previne a formação de defeitos ósseos circulares no osso parietal, preservando o modo de ativação celular. Além disso, a força pode ser removida a qualquer momento pela desmontagem da mola, tornando-a adequada para estabelecer um modelo de recorrência após alongamento sob tensão. A conveniência de desmontar a mola também garante danos secundários mínimos aos animais de experimentação. Além disso, a magnitude mecânica da tensão de tração pode ser facilmente ajustada alterando a força da mola. É importante ressaltar que este modelo mantém o ambiente fisiológico natural ao redor da sutura craniana, garantindo assim a precisão dos resultados experimentais.
No entanto, existem algumas limitações para esse modelo de expansão. Em primeiro lugar, existe o risco de o anel de retenção cair se a força for excessiva. Os novatos devem realizar exercícios preliminares na instalação da mola para mitigar esse risco. Em segundo lugar, há um risco de infecção ao abrir o couro cabeludo e expor o crânio, por isso a desinfecção do instrumento é essencial, e encurtar a duração da cirurgia é benéfico para a cura. O excesso de anestesia também pode levar à morte de camundongos.
Em relação ao método PEGASOS passivo, é aplicável para alcançar transparência em tecidos e órgãos individuais, bem como em toda a cabeça e corpo de camundongos jovens. Embora eficiente para ossos inteiros da calota, um tempo de processamento mais longo é necessário para amostras maiores, especialmente para tecidos ósseos inteiros ou tecidos de ossos longos em massa com articulações. É importante ressaltar que a descalcificação tecidual não deve ser realizada com o uso do protocolo de dupla marcação, pois interfere no processo de coloração. O método de limpeza tecidual PEGASOS também é flexível, permitindo a combinação com vários métodos de marcação, não se limitando à incorporação de EdU ou dupla marcação de cálcio, mas também fluorescência endógena em modelos de camundongos transgênicos ou coloração de corante ou anticorpo de montagem inteira, todos com fluorescência bem preservada.
Com efeitos estáveis e alta repetibilidade, este modelo de expansão de sutura é adequado para várias linhagens de camundongos transgênicos de diferentes idades. A capacidade de ajustar a magnitude da tensão de tração e retirar a força a qualquer momento permite uma pesquisa conveniente sobre a recorrência após a estimulação do estresse. Combinando o método de dupla marcação de ossos mineralizados com a técnica de limpeza tecidual PEGASOS, podemos observar a distribuição espaço-temporal tridimensional das células-tronco de sutura craniana durante a remodelação óssea, permitindo uma maior exploração da relação entre os CSUs e o estresse mecânico, bem como de seus mecanismos específicos.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos pela plataforma de laboratório e assistência do Ear Institute, Shanghai Jiaotong University School of Medicine. Este trabalho foi apoiado pelo Shanghai Pujiang Program (22PJ1409200); Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (No.11932012); Fundação de Pesquisa Científica de Pós-doutorado do Hospital do Nono Povo de Xangai, Faculdade de Medicina da Universidade Jiao Tong de Xangai; Financiamento do programa de pesquisa fundamental do Nono Hospital do Povo afiliado à Faculdade de Medicina da Universidade Jiao Tong de Xangai (JYZZ154).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37% Acid etching | Xihubiom | E10-02/1807011 | |
| Alizarin red | Sigma-Aldrich | A3882 | |
| AUSTRALIAN WIRE | A.J.WILCOCK | 0.014'' | |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | B6630 | |
| Calcein green | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Copper(II) sulfate, anhydrous | Sangon Biotech | A603008 | |
| Dynamometer | Sanliang | SF-10N | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| EdU | Invitrogen | E104152 | |
| Laser Confocal Microscope | Leica | SP8 | |
| PBS | Sangon Biotech | E607008 | |
| PEG-MMA 500 | Sigma-Aldrich | 447943 | |
| PFA | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| pH Meters | Mettler Toledo | S220 | |
| Quadrol | Sigma-Aldrich | 122262 | |
| Sodium Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| Sodium bicarbonate | Sangon Biotech | A500873 | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A610476 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Spring | TAOBAO | 0.2*1.5*1*7 | |
| Sulfo-Cyanine3 azide | Lumiprobe | A1330 | |
| tert-Butanol | Sigma-Aldrich | 360538 | Protect from light. Do not freeze. |
| Transbond MIP Moisture Insensitive Primer |
3M Unitek | 712-025 | |
| Transbond XT Light Cure Adhesive Paste |
3M Unitek | 712-035 | |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | V900257 | |
| Tris-buffered saline | Sangon Biotech | A500027 |
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